一种检测转基因水稻克螟稻2号的质粒标准分子及构建.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103361410 A (43)申请公布日 2013.10.23 CN 103361410 A *CN103361410A* (21)申请号 201210104158.4 (22)申请日 2012.04.10 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/63(2006.01) C12N 15/66(2006.01) (71)申请人 中国计量科学研究院 地址 100013 北京市朝阳区北三环东路 18 号 (72)发明人 王晶 李亮 隋志伟 臧超 余笑波 董莲华 (74)专利代理机构 北京海虹嘉诚知识产权代理 有限公司 11129 代理人 张涛 (54) 发明。

2、名称 一种检测转基因水稻克螟稻 2 号的质粒标准 分子及构建 (57) 摘要 本发明构建了一种用于检测转基因水稻克螟 稻 2 号的质粒标准分子。该质粒标准分子含克螟 稻 2 号构建特异性基因片段和水稻内标准基因片 段。 经实时荧光定量PCR扩增实验证实， 本发明提 供的质粒标准分子可替代转基因水稻克螟稻 2 号 基因组 DNA， 用于该水稻的转基因定量检测。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 序列表 2 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书6页 序列表2页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103361。

3、410 A CN 103361410 A *CN103361410A* 1/1 页 2 1. 一种用于检测转基因水稻克螟稻 2 号的质粒标准分子， 其特征是含有 SEQ ID NO ： 1 所示序列的构建特异性基因片段和 SEQ ID NO ： 2 所示序列的内标准基因片段 ； 且所述 SEQ ID NO ： 1 片段和 SEQ ID NO ： 2 片段共同构建于 pEASY-T3 载体的 T 位点。 2. 权利要求 1 所述的质粒标准分子的构建方法， 其特征是， 所述 SEQ ID NO ： 1 片段是 由 SEQ ID NO ： 3、 SEQ ID NO ： 4 和 SEQ ID NO ：。

4、 5 组成引物对和探针， 对转基因水稻克螟稻 2 号进行扩增， 获得 174bp 扩增子。 3. 权利要求 1 所述的质粒标准分子的构建方法， 其特征是， 所述 SEQ ID NO ： 2 片段是 由 SEQ ID NO ： 6、 SEQ ID NO ： 7 和 SEQ ID NO ： 8 组成引物对， 对转基因水稻克螟稻 2 号进行 特异性扩增， 获得 106bp 扩增子。 4. 权利要求 1 所述的质粒标准分子的用途， 其特征是对转基因水稻克螟稻 2 号进行特 异性且定量检测。 5. 权利要求 4 所述的用途， 其特征是替代转基因水稻克螟稻 2 号基因组 DNA， 作为该水 稻的转基因定量。

5、检测阳性标准品。 权 利 要 求 书 CN 103361410 A 2 1/6 页 3 一种检测转基因水稻克螟稻 2 号的质粒标准分子及构建 技术领域 ： 0001 本发明涉及一种转基因检测用质粒， 具体涉及一种用于检测转基因水稻克螟稻 2 号的质粒标准分子及其构建方法。 背景技术 ： 0002 克螟稻 2 号 (KMD2) 是我国培育的一种转基因水稻。目前， 转基因植物标准物质的 研制和应用成为国内外农业转基因生物安全管理体系建设的当务之急， 也成为制约转基因 植物检测技术发展和检测机构建设的瓶颈问题之一。 0003 质粒标准分子以其制备快捷， 成本经济， 易于复制等优点被称转基因检测用的 。

6、“金 标准” 。目前已有多种转基因植物检测用质粒标准分子， 但是针对转基因水稻克螟稻 2 号进 行定量检测尚无报道。因此， 构建用于对克螟稻 2 号进行特异性定量检测的质粒标准分子 非常急需。 发明内容 ： 0004 本发明的目的是构建一个用于转基因水稻克螟稻 2 号特异性定量检测的质粒标 准分子， 作为阳性标准品， 可用于转基因定量检测和安全评价、 实验室质量控制等领域。 0005 本发明首次发现 SEQ ID NO ： 2 所示序列的基因可作为克螟稻 2 号水稻内标准基 因， 并协同转基因水稻克螟稻 2 号的构建特异性序列 SEQ ID NO ： 1 共同构建于质粒分子 pEASY-T3。。

7、 0006 本发明经过特异性验证和可替代性研究， 结果证明上述构建的质粒标准分子针对 转基因水稻克螟稻 2 号具有检测特异性， 并且该质粒分子可以替代阳性克螟稻 2 号基因组 作为阳性标准品。 0007 本发明的定值结果通过以下两种方法确定 ： 0008 一是核酸序列的测序得到的认定值， 测序表明所述质粒分子中两个基因片段均以 单拷贝形式连入， 认定值为两个片段的比值， 即为 1， 不确定度可忽略 ； 0009 二是通过实时荧光定量 PCR 的方法计算 Ct 比值为参考值， 结果为 1.032。经不确 定度评价， 该质粒分子标准物质的扩展不确定度为 0.032。 0010 以上所得的认定值和参。

8、考值表明， 本发明提供的质粒标准分子适合作为转基因水 稻克螟稻 2 号定量检测。 附图说明 ： 0011 图 1 是内标准基因和外源基因片段从基因组 DNA 扩增获得的片段的电泳图， 其中 106bp 代表内标准基因片段， 174bp 代表转化体构建特异性片段 ； 0012 图 2 是水稻克螟稻 2 号特异性定量检测用质粒构建物理图， 图中内标基因 (En 表 示 ) 和 KMD2 标记分别表示内标准基因片段和外源特异性检测片段 ； 0013 图 3 是转基因水稻克螟稻 2 号质粒标准分子特异性验证的电泳图， 其中， M 为 DNA 说 明 书 CN 103361410 A 3 2/6 页 4。

9、 Ladder， 1 克螟稻 2 号 ； 2 科丰 6 号 ； 3 华恢 1 号 ； 4LLRICE62 ； 5 空白 ； 具体实施方式 ： 0014 实施例 1 标准分子构建 0015 1、 目标基因序列查找及引物设计 0016 通过查阅转化体的相关资料， 选取克螟稻 2 号构建特异性 ( 外源基因 ) 序列片段， 长174bp(SEQ ID NO ： 1)， 为单拷贝 ； 选取单拷贝内标准基因片段， 长106bp(SEQ ID NO ： 2)， 作为内标准基因。 0017 本实验共需要两对引物和相应的探针， 由上海英潍捷基生物技术有限公司合成， 序列见SEQ ID NO ： 3、 SEQ 。

10、ID NO ： 4、 SEQ ID NO ： 5、 SEQ ID NO ： 6、 SEQ ID NO ： 7、 SEQ ID NO ： 8。 0018 表 1 外源基因和内标准基因的引物及探针序列 0019 0020 注 ： 表中 FAM 为探针的发光基团， ECLIPSE 和 MGBNFQ 为探针的淬灭基团 0021 2、 目标 DNA 片段的扩增及标准分子构建 0022 转基因水稻克螟稻 2 号基因组 DNA 采用 Wizard Magnetic DNA Purification System for Food FF3750(Promega 公司 ) 按照说明书提取。随后根据表 1 引物，。

11、 分别以克 螟稻 2 号的基因组 DNA 为模板， 对转化体特异性序列和内标准基因片段进行 PCR 扩增， 对扩 增得到的条带进行回收纯化， 用琼脂糖凝胶电泳验证， 见图 1。 0023 将回收得到的 SEQ ID NO ： 1 片段和 SEQ ID NO ： 2 片段同过重叠 PCR 技术融合后， 连入 pEASY-T3 载体的 T 位点， 即得到质粒标准分子， 物理图谱见图 2。 0024 3、 质粒标准分子的纯化 0025 构建得到的质粒转化入大肠杆菌受体菌中， 菌种保藏在 -70冰箱， 以载体氨苄 青霉素 AMP 抗性为筛选标记。质粒的大量制备由保藏的菌种开始， 首先使菌种复壮， 划平。

12、 板挑取单克隆菌落在 LB 培养液中进行大量培养， 然后采用质粒提取试剂盒 PureYieldTM Plasmid Midiprep System(Promega 公司 ) 进行提取和纯化。 0026 实施例 2 特异性验证和可替代性研究 说 明 书 CN 103361410 A 4 3/6 页 5 0027 1、 克螟稻 2 号的特异性验证 0028 为了验证标准分子的特异性， 采用不同作物转化体的内标准基因、 外源特异性引 物分别对质粒分子进行扩增。 0029 选取商品化或实验用的四种转基因水稻， 包括 ： 克螟稻2号， 科丰6号、 华恢1号和 LLRICE62 的外源引物对质粒分子进行扩。

13、增， 结果如图 3。 0030 由图可知， 只有克螟稻 2 号外源引物可扩增出目的条带， 为阳性 ； 0031 而其它转化体科丰 6 号、 华恢 1 号和 LLRICE62 的检测结果为阴性， 与空白相同。 0032 由此证明克螟稻 2 号质粒分子的外源基因针对其它引物特异性良好， 质粒分子具 有转化体检测特异性。 0033 2、 实时荧光定量 PCR 的体系和程序 0034 实时荧光定量 PCR 扩增采用 AB 7900HT 系统 (Invitrogen 公司 )， 内、 外源扩增体 系如表 2 和表 3。 0035 表 2 外源基因 PCR 反应体系 0036 PCR 反应试剂 保存浓度 。

14、使用浓度 体积 (L) 2Taqman Universal MasterMix 2 1 12.5 克螟稻 2 号 10M 0.4M 1 克螟稻 2 号 10M 0.4M 1 克螟稻 2 号 10M 0.2M 0.5 DNA Template 30ng/L 5 ddH2O 补足 25 0037 表 3 内源基因 PCR 反应体系 0038 PCR 反应试剂 保存浓度 使用浓度 体积 (L) 2Taqman Universal MasterMix 2 1 12.5 内标 -F 10M 0.2M 0.5 内标 -R 10M 0.2M 0.5 内标 -P 10M 0.1M 0.25 DNA Templ。

15、ate 30ng/L 5 ddH2O 补足 25 说 明 书 CN 103361410 A 5 4/6 页 6 0039 使用扩增条件如表 4。 0040 表 4 比对实验实时荧光定量 PCR 反应参数 0041 0042 3、 质粒标准分子和基因组 DNA 的可替代研究 0043 方法 ： 0044 分别以转基因水稻 pKMD2 和基因组 DNA 通过实时荧光定量 PCR 技术绘制标准曲 线， 通过比较所得直线方程的线性相关系数 (R2) 和扩增效率， 以确定质粒标准分子是否可 以在定量检测过程中替代基因组 DNA。 0045 结果 ： 0046 实验采用 12 次 (n 12) 重复数据进。

16、行统计， 见表 5 和表 6。由 R2扩增效率和扩 增效率的 T 检验结果在 95的置信水平没有显著性差异 (T t(9)0.05， P 0.05)。因 此， 也证明了质粒标准分子和基因组 DNA 两个标准产生的内 / 外源基因曲线替代性良好。 0047 结论 ： 质粒标准分子和基因组DNA两个标准产生的内/外源基因曲线替代性良好， 证明此质粒分子可替代基因组 DNA 用于转基因水稻克螟稻 2 号定量检测。 0048 表 5 质粒 DNA 和基因组 DNA 的线性相关系数 (R2) 替代性结果 0049 0050 表 6 质粒 DNA 和基因组 DNA 的扩增效率替代性结果 0051 0052。

17、 实施例 3 标准分子的定值结果 0053 标准分子的定值方式 ： 0054 定值结果通过两种方法确定， 一是核酸序列的测序得到认定值， 即质粒分子中两 个基因片段连入的比值 ； 二是通过实时荧光定量 PCR 的方法计算 Ct 比值为参考值。 0055 1、 认定值的确定 说 明 书 CN 103361410 A 6 5/6 页 7 0056 认定值是具有最高准确度、 所有已知或可疑偏差来源均已经过充分研究或考虑。 质粒分子的认定值是通过三家实验室核酸序列的测序得到的， 测序表明 pKMD2 质粒分子中 两个基因片段均以单拷贝形式连入， 认定值为两个片段的比值， 即为 1。根据测序仪器的说 明。

18、， 仪器对核酸片段鉴别的错误率低于 0.0002， 故此测序对认定值的偏差可忽略。 0057 2、 参考值的确定 0058 参考值是对真值的最佳估计， 通常通过常规方法得到的。将测定的 pKMD2 质粒分 子的外源基因片段与内源基因片段的 Ct 值之比 (n 44) 的结果为 ： 1.022， 相对标准偏差 RSD 为 0.023。见表 7。 0059 表 7 参考值结果 0060 外源 Ct 值 内源 Ct 值 外 / 内 外源 Ct 值 内源 Ct 值 外 / 内 20.47 20.52 0.998 29.87 29.69 1.006 20.27 20.15 1.006 29.71 29.。

19、55 1.005 20.02 20.44 0.979 33.28 32.47 1.025 23.20 23.81 0.974 33.30 31.54 1.056 23.20 24.17 0.960 33.06 32.76 1.009 22.99 23.83 0.965 23.28 20.68 1.126 26.49 27.00 0.981 23.11 20.32 1.137 26.98 27.23 0.991 23.09 20.23 1.141 26.56 27.41 0.969 26.40 23.10 1.143 29.52 30.30 0.974 26.37 23.60 1.118 29.。

20、37 29.86 0.984 26.52 23.50 1.128 29.96 30.26 0.990 29.49 27.26 1.082 33.13 32.75 1.011 29.73 27.30 1.089 33.02 32.84 1.005 29.56 26.68 1.108 20.80 20.70 1.005 32.61 30.40 1.073 20.78 20.84 0.997 32.86 29.91 1.099 20.96 20.83 1.006 32.52 30.48 1.067 说 明 书 CN 103361410 A 7 6/6 页 8 24.45 24.19 1.011 35。

21、.32 32.68 1.081 24.21 24.03 1.008 34.91 33.18 1.052 24.11 24.14 0.999 35.34 33.45 1.057 26.97 26.93 1.002 27.55 27.33 1.008 MEAN 0.967 26.94 26.95 1.000 SD 0.013 29.69 30.07 0.987 RSD 0.013 0061 本发明为转基因水稻克螟稻 2 号质粒标准分子提供了认定值和参考值， 可将该质 粒标准分子作为标准物质， 根据量值结果用于实际定量检测试验。 说 明 书 CN 103361410 A 8 1/2 页 9 0001 0002 序 列 表 CN 103361410 A 9 2/2 页 10 序 列 表 CN 103361410 A 10 1/1 页 11 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 103361410 A 11 。