抗稻曲病基因关联抗病同源序列及其分子标记获取方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103333884 A (43)申请公布日 2013.10.02 CN 103333884 A *CN103333884A* (21)申请号 201310045447.6 (22)申请日 2013.02.05 C12N 15/11(2006.01) C12N 15/10(2006.01) (71)申请人 四川省农业科学院作物研究所 地址 610066 四川省成都市锦江区狮子山路 4 号 (72)发明人 任鄄胜 曾礼华 任光俊 高方远 陆贤军 吴贤婷 (74)专利代理机构 北京众合诚成知识产权代理 有限公司 11246 代理人 龚燮英 (54) 发明名称 抗稻曲病基因关。

2、联抗病同源序列及其分子标 记获取方法 (57) 摘要 本发明公开了水稻抗稻曲病基因关联抗病同 源序列及其分子标记获取方法， 通过对全基因组 抗病同源序列设计 RGA 引物 , 获得水稻种质的 RGA 基因型， 通过稻曲病病菌微注射法获得 137 份抗稻曲病表型， 结合 RGA 基因型和抗稻曲病表 型进行分子性状关联分析以及对 PCR 产物克隆测 序， 获得与抗稻曲病关联的抗病基因同源序列及 其分子标记。 本发明通过遗传转化和杂交， 将其导 入普通栽培水稻品种， 能够提高水稻对稻曲病的 抗性 ； 本发明获得的抗稻曲病基因的相关联的分 子标记， 可检测抗稻曲病基因的有无， 实现对抗病 植株的间接选。

3、择， 避免了接种稻曲病病菌鉴定受 气候、 地理位置等不确定因素的影响， 可以用于早 代选择， 缩短抗稻曲病育种年限， 提高育种效率。 (51)Int.Cl. 权利要求书 3 页 说明书 9 页 序列表 4 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书3页 说明书9页 序列表4页 附图3页 (10)申请公布号 CN 103333884 A CN 103333884 A *CN103333884A* 1/3 页 2 1. 抗稻曲病基因关联抗病同源序列及其分子标记获取方法， 其特征在于， 该获取方法 包括 ： 引物及其序列、 抗稻曲病关联 RGA 引物及其。

4、产生的抗病同源序列片段以及相对应的 抗病同源序列在 Rice Genome Annotatation Project 上的注释号、 编码的蛋白质。 2. 如权利要求 1 所述的抗稻曲病基因关联抗病同源序列及其分子标记获取方法， 其特 征在于， 引物及其序列、 抗稻曲病关联 RGA 引物及其产生的抗病同源序列片段以及相对应 的抗病同源序列在Rice Genome Annotatation Project上的注释号、 编码的蛋白质具体如 下 ： 3. 如权利要求 2 所述的抗稻曲病基因关联抗病同源序列及其分子标记获取方法， 其特 征在于， 该获取方法通过如下步骤获得 RGA 标记及其对应抗病同源序。

5、列 ： RGA 引物设计， 根据从上检索到的全基因组抗病同源序列， 利用引物设计软件 PrimerPremier6 设计了水稻全基因组 RGA 引物 ； 137 份全球核心种质 RGA 基因型鉴定， 用 CTAB 法提取 137 份全球核心种质的 DNA， 用设 计的备选 RGA 标记 137 份全球核心种质进行 RGA 基因型分析， PCR 反应在 NBI Veriti 9600 权 利 要 求 书 CN 103333884 A 2 2/3 页 3 扩增仪上进行， 扩增产物在 6% 的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分析， 并记录带型 ； 137 份全球核心种质抗稻曲病表型， 于 2009 年 -2。

6、011 年三年间对 137 份全球核心种质 进行了稻曲病抗性鉴定 ； 利用稻曲病自然诱导和稻曲病病菌菌液微管注射法接种鉴定 ； 待 发病平稳后调查接种单株发病情况， 并记录发病最高的单穗稻曲病病球数 ； 分子 - 性状关联分析， 利用单分子标记分析方法进行分子 - 性状关联分析， 取 P 0.01， 获得 RGA9、 RGA132、 RGA170、 RGA198、 RGA255、 RGA305 和 RGA306 与稻曲病抗性相 关联 ； 利用关联 RGA 标记相对应抗病同源序列测序及比对， 利用关联 RGA 标记对稻曲病抗感 种质进行克隆测序。 4. 如权利要求 3 所述的抗稻曲病基因关联抗病。

7、同源序列及其分子标记获取方法， 其特 征在于， 关联RGA标记相对应抗病同源序列测序及比对， 利用关联RGA标记对稻曲病抗感种 质进行克隆测序的具体过程如下 : 抗 病 同 源 序 列 克 隆 PCR 扩 增 体 系 50l ： 1l DNA,10buffer5l， 10mM dNTP2l,10M 引物各 3l， 高保真 Taq 酶 0.5， 超纯水 35.5l ； PCR 反应程序 ： 94 5min;95 20s,57 45s,72 1min, 共 35 个循环 ； 然后 72延长 7min ； 最后 4保存 ； PCR 产物在 1% 琼脂糖电泳分离， 用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的片段。。

8、再将用将目 的片段构建到PMD19-T质粒载体， 然后将构建好的载体转化到感受态大肠杆菌DH5中， 最 后送样测序。 5. 如权利要求 3 所述的抗稻曲病基因关联抗病同源序列及其分子标记获取方法， 其特 征在于， 序列比对分析， 序列 RGA132-3 共 562bp， 通过在线软件对抗感种质的 PCR 片段比对 发现两者存在两个碱基缺失 ； 通过比对， RGA132-3 与 LOC_Os08g07930 在 939-1449bp 之间 99% 的同源 ； 序列 RGA132-3 推测编码一个 NBS-LRR 抗性蛋白 ； 序列 RGA170-2 共 1521bp， 编码一个 284 个氨基酸。

9、的 NBS 蛋白结构域。通过 DNAMAN6.0 对抗感种质的 PCR 片段比对发现两者在蛋白质序列中存在 1 个氨基酸突变 ； 通过比对， RGA132-3 与 LOC_Os08g07930 在 193-1712bp 之间 99% 的同源 ； 序列 RGA198-2 共 954bp， 编码一个 154 个氨基酸， 属于 zf-BED 超级家族。 。通过 DNAMAN6.0 对抗感种质的 PCR 片段比对发现两者在蛋白质序列中存在 1 个氨基酸突变 ； 通 过比对， RGA1982 与 LOC_Os04g53160 在 382-1050bp 之间 94% 的同源。 序列 RGA255-2 共 。

10、1108bp， 通过在线软件对抗感种质的 PCR 片段比对发现两者存在多 个碱基缺失或突变 ； 通过比对， RGA255-2 与 LOC_Os12g28070 在 2474-3516bp 之间 96% 的同 源 ； 序列 RGA305-2 共 1001bp， 编码一个 226 个氨基酸的 PLN03210 蛋白结构域。通过 DNAMAN6.0 对抗感种质的 PCR 片段比对发现两者在蛋白质序列中存在 7 个氨基酸插入 / 缺 失 ； 通过比对， RGA305-2 与 LOC_Os05g31550 在 2650-3630bp 之间 99% 的同源 ； 序列 RGA306-2 共 603bp， 通。

11、过在线软件对抗感种质的 PCR 片段比对发现两者存在多个 碱基插入缺失 ； 通过比对， RGA306-2 与 LOC_Os05g31570 在 235-624bp 之间 74% 的同源 ； 序列 RGA9-2 共 1347bp， 编码一个 327 个氨基酸的 B-Lectin 蛋白结构域。通过 DNAMAN6.0 对抗感种质的 PCR 片段比对发现两者在蛋白质序列中存在多个氨基酸突变 ； 通 权 利 要 求 书 CN 103333884 A 3 3/3 页 4 过比对， RGA132-3 与 LOC_Os08g07930 在 193-1712bp 之间 99% 的同源 ； 序列 RGA116-。

12、5 共 1189bp， 编码一个 181 个氨基酸。通过 DNAMAN6.0 对抗感种质的 PCR 片段比对发现两者在蛋白质序列中存在 1 个氨基酸突变 ； 通过比对， RGA116-5 与 LOC_ Os06g37840 在 173-867bp 之间 98% 的同源。 权 利 要 求 书 CN 103333884 A 4 1/9 页 5 抗稻曲病基因关联抗病同源序列及其分子标记获取方法 技术领域 0001 本发明涉及植物抗病基因的植物基因工程以及分子标记辅助育种领域， 具体涉及 一种抗稻曲病基因的抗病基因同源序列及其分子标记， 及其专用引物在水稻抗稻曲病中的 应用。 背景技术 0002 水稻。

13、稻曲病是一种水稻穗期病害， 在世界主要稻区都有发生， 且逐年加重， 严重危 害水稻的产量和品质 ； 并且该病菌含有人、 畜、 禽有毒害物质以及致病色素， 对人造成直接 和间接的伤害。 由于稻曲病病菌侵染时期以水稻孕穗到开花期为主， 而发病期则在灌浆期， 这样病菌侵染与发病并不在同一时期， 往往造成人工化学防治滞后， 致使病害大发生 ； 另一 方面， 化学防治成本高、 费时费工， 容易造成人员中毒和环境污染。 因而， 种植抗性品种来控 制稻曲病病害， 被认为经济有效， 环境友好的方法。 但是， 由于稻曲病病害属于穗部病害， 接 种鉴定周期长， 易受到外部环境的影响， 基于表型抗性鉴定选择抗性植株。

14、非常困难， 因而抗 稻曲病育种进展非常缓慢。 0003 另外， 由于稻曲病抗性属于数量性状， 单一的抗稻曲病基因位点 （Quantitative Trait Loci,QTL） 是无法抵抗稻曲病病菌的侵染， 所以抗稻曲病育种需要抗稻曲病基因位 点的聚合。目前， 对于水稻抗稻曲病基因位点的定位进展较慢， 徐建龙等 （徐建龙， 薛庆中， 罗利军， 黎志康 . 近等基因导入系定位水稻抗稻曲病数量性状位点的研究初报浙江农 业学报， 2002， 14(1) ： 14 一 19 ） 利用 Lemont 特青的近等基因导入系在第 10、 12 染色体 上检测到两个水稻稻曲病抗性数量性状位点。李余生等 （李余。

15、生， 张亚东， 朱镇， 赵凌， 王 才林 . 利用重组自交系分析水稻稻曲病抗性位点及效应 . 中国水稻科学， 2008， 22（5） ： 472-476） 利用大关稻 IR28 重组自交系群体和微卫星 （SSR） 标记检测了对稻曲病抗性 的数量性状位点 （QTL） ， 共检测到 5 个 QTLs。但是， 这些抗稻曲病 QTLs 所用标记是微卫星 （SSR） 标记， 并非直接标记抗性基因位点， 将它们利用到育种实践中尚未见到有关报道。 发明内容 0004 本发明的目的是提供一种水稻抗稻曲病基因位点分子标记， 通过检测这些与抗稻 曲病关 联的分子标记， 可以预测水稻植株的稻曲病抗性， 加快抗稻曲病。

16、水稻新品种的选育 速度， 简 化选育手段。 0005 本发明实施例是这样实现的， 抗稻曲病关联 RGA 引物及其产生的抗病同源序列片 段以及相对应的抗病同源序列在 Rice Genome Annotatation Project 上的注释号如下 ： 0006 说 明 书 CN 103333884 A 5 2/9 页 6 0007 进一步， 该获取方法通过如下步骤获得 RGA 标记及其对应抗病同源序列 ： 0008 RGA 引物设计， 根据从上检索到的全基因组抗病同源序列， 利用引物设计软件 PrimerPremier6 设计了水稻全基因组 RGA 引物 ； 0009 137 份全球核心种质 R。

17、GA 基因型鉴定， 用 CTAB 法提取 137 份全球核心种质的 DNA， 用设计的备选 RGA 标记 137 份全球核心种质进行 RGA 基因型分析， PCR 反应在 NBI Veriti 9600 扩增仪上进行， 扩增产物在 6% 的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分析， 并记录带型 ； 0010 137 份全球核心种质抗稻曲病表型， 于 2009 年 -2011 年三年间对 137 份全球核 心种质进行了稻曲病抗性鉴定 ； 利用稻曲病自然诱导和稻曲病病菌菌液微管注射法接种鉴 定 ； 待发病平稳后调查接种单株发病情况， 并记录发病最高的单穗稻曲病病球数 ； 0011 分子 - 性状关联分析， 利。

18、用单分子标记分析方法进行分子 - 性状关联分析， 取 P 0.01， 获得 RGA9、 RGA132、 RGA170、 RGA198、 RGA255、 RGA305 和 RGA306 与稻曲病抗性相 关联 ； 0012 联 RGA 标记相对应抗病同源序列测序及比对， 利用关联 RGA 标记对稻曲病抗感种 说 明 书 CN 103333884 A 6 3/9 页 7 质进行克隆测序。 0013 进一步， 关联RGA标记相对应抗病同源序列测序及比对， 利用关联RGA标记对稻曲 病抗感种质进行克隆测序的具体过程如下 : 0014 抗 病 同 源 序 列 克 隆 PCR 扩 增 体 系 50l ： 1。

19、l DNA,10buffer5l， 10mM dNTP2l,10M 引物各 3l， 高保真 Taq 酶 0.5， 超纯水 35.5l ； 0015 PCR 反应程序 ： 94 5min;95 20s,57 45s,72 1min, 共 35 个循环 ； 然后 72 延长 7min ； 最后 4保存 ； 0016 PCR 产物在 1% 琼脂糖电泳分离， 用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的片段。再将用 将目的片段构建到 PMD19-T 质粒载体， 然后将构建好的载体转化到感受态大肠杆菌 DH5 中， 最后送样测序。 0017 进一步， 序列比对分析， 序列 RGA132-3 共 562bp， 通过在线。

20、软件对抗感种质的 PCR 片段比对发现两者存在两个碱基缺失 ； 通过比对， RGA132-3 与 LOC_Os08g07930 在 939-1449bp 之间 99% 的同源 ； 序列 RGA132-3 推测编码一个 NBS-LRR 抗性蛋白 ； 0018 序列 RGA170-2 共 1521bp， 编码一个 284 个氨基酸的 NBS 蛋白结构域。通过 DNAMAN6.0 对抗感种质的 PCR 片段比对发现两者在蛋白质序列中存在 1 个氨基酸突变 ； 通 过比对， RGA132-3 与 LOC_Os08g07930 在 193-1712bp 之间 99% 的同源 ； 0019 序列 RGA1。

21、98-2 共 954bp， 编码一个 154 个氨基酸， 属于 zf-BED 超级家族。 。通过 DNAMAN6.0 对抗感种质的 PCR 片段比对发现两者在蛋白质序列中存在 1 个氨基酸突变 ； 通 过比对， RGA198-2 与 LOC_Os04g53160 在 382-1050bp 之间 94% 的同源。 0020 序列RGA255-2共1108bp， 通过在线软件对抗感种质的PCR片段比对发现两者存在 多个碱基缺失或突变 ； 通过比对， RGA255-2 与 LOC_Os12g28070 在 24743516bp 之间 96% 的 同源 ； 0021 序列 RGA305-2 共 100。

22、1bp， 编码一个 226 个氨基酸的 PLN03210 蛋白结构域。通过 DNAMAN6.0 对抗感种质的 PCR 片段比对发现两者在蛋白质序列中存在 7 个氨基酸插入 / 缺 失 ； 通过比对， RGA305-2 与 LOC_Os05g31550 在 2650-3630bp 之间 99% 的同源 ； 0022 序列 RGA306-2 共 603bp， 通过在线软件对抗感种质的 PCR 片段比对发现两者存在 多个碱基插入缺失 ； 通过比对， RGA306-2 与 LOC_Os05g31570 在 235-624bp 之间 74% 的同 源 ； 0023 序列 RGA9-2 共 1347bp，。

23、 编码一个 327 个氨基酸的 B-Lectin 蛋白结构域。通过 DNAMAN6.0 对抗感种质的 PCR 片段比对发现两者在蛋白质序列中存在多个氨基酸突变 ； 通 过比对， RGA132-3 与 LOC_Os08g07930 在 193-1712bp 之间 99% 的同源 ； 0024 序列 RGA116-5 共 1189bp， 编码一个 181 个氨基酸。通过 DNAMAN6.0 对抗感种质的 PCR 片段比对发现两者在蛋白质序列中存在 1 个氨基酸突变 ； 通过比对， RGA116-5 与 LOC_ Os06g37840 在 173-867bp 之间 98% 的同源。 0025 本发明。

24、通过对全基因组抗病同源序列 （Resistance Gene Analog， RGA） 设计RGA引 物,获得137份美国农业部核心水稻种质的RGA基因型， 通过稻曲病病菌微注射法获得137 份核心种质的抗稻曲病表型， 结合RGA基因型和抗稻曲病表型进行分子-性状关联分析， 获 得与抗稻曲病有关的分子标记以及相对应的抗病基因同源序列。 本发明是利用抗病同源序 列设计的 RGA 标记， 更能准确地标记抗稻曲病基因 ； 由于抗病同源序列本身是植物抗病基 说 明 书 CN 103333884 A 7 4/9 页 8 因的一部分， 通过对抗感种质抗病同源序列测序比对， 发现抗病同源序列关联抗稻曲病性。。

25、 0026 鉴于稻曲病表型鉴定周期长和易受环境影响， 利用常规育种手段往往难以有效地 导入和聚合不同的抗稻曲病基因位点。本发明是在利用表型与 RGA 基因型关联分析的基础 上， 借助分子标记辅助选择 （Marker-assisted selection,MAS） 技术则可以有目的地进行 抗稻曲病基因位点的背景选择和抗稻曲病基因位点的聚合， 选育抗稻曲病品种， 缩短选育 年限， 简化育种程序。 本发明所获得抗病同源序列编码的蛋白质与水稻抗稻曲病有关， 通过 遗传转化和杂交， 将其导入普通栽培水稻品种， 能够提高水稻对稻曲病的抗性， 从而减轻稻 曲病危害， 达到增产和稳产的目的。 附图说明 002。

26、7 图 1. 抗病同源序列标记 RGA132 在核心种质的电泳图。 0028 图 2. 抗病同源序列标记 RGA170 在核心种质的电泳图。 0029 图 3. 抗病同源序列标记 RGA198 在核心种质的电泳图。* 代表与抗稻曲病关联的 条带。 0030 图 4. 抗病同源序列标记 RGA255 在核心种质的电泳图。* 代表与抗稻曲病关联的 条带。 0031 图 5. 抗病同源序列标记 RGA305 在核心种质的电泳图。* 代表与抗稻曲病关联的 条带。 0032 图 6. 抗病同源序列标记 RGA306 在核心种质的电泳图。* 代表与抗稻曲病关联的 条带。 0033 图 7. 抗病同源序列标。

27、记 RGA9 在核心种质的电泳图。* 代表与抗稻曲病关联的条 带。 0034 具体实施方式 0035 为了使本发明的目的、 技术方案及优点更加清楚明白， 以下结合附图及实施例， 对 本发明进行进一步详细说明。 应当理解， 此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明， 并 不用于限定本发明。 0036 本发明的目的是提供一种水稻抗稻曲病基因位点分子标记， 通过检测这些与抗稻 曲病关联的分子标记， 可以预测水稻植株的稻曲病抗性， 加快抗稻曲病水稻新品种的选育 速度， 简化选育手段。 0037 本发明另一目的是提供了与抗稻曲病关联的抗病同源序列， 通过遗传转化和杂 交， 将其导入普通栽培水稻品种， 能。

28、够提高水稻对稻曲病的抗性。 0038 本发明通过候选基因法和关联作图的相结合方法， 通过对全基因组抗病同源序列 （Resistance Gene Analog， RGA） 设计 RGA 引物 , 获得 137 份美国农业部核心水稻种质的 RGA 基因型， 通过稻曲病病菌微注射法获得 137 份核心种质的抗稻曲病表型， 结合 RGA 基因 型和抗稻曲病表型进行分子 - 性状关联分析， 获得与抗稻曲病有关的分子标记以及相对应 的抗病基因同源序列。 水稻抗稻曲病基因位点的分子标记及其对应的抗病同源序列在Rice Genome Annotatation Project(http:/rice.plant。

29、biologymsu.edu/)上的注释号 （Locus identifier） 如表 1 所示。 说 明 书 CN 103333884 A 8 5/9 页 9 0039 本发明获得抗稻曲病 RGA 标记对应的抗病同源序列， 通过对抗感种质的克隆测 序， 证实这些抗稻曲病 RGA 标记对应的抗病同源序列在抗感种质中存在 DNA 序列的缺失 / 插入、 或是碱基突变 （如表 1） ， 认为所发现的抗病同源序列关联水稻稻曲病抗性。 0040 本领域技术人员应能理解， 根据本发明公开的抗病同源序列用来做遗传转化可用 于增加水稻稻曲病抗性， 其序列产生的分子标记可用于抗稻曲病分子辅助选择育种。 004。

30、1 本发明通过如下步骤获得 RGA 标记及其对应抗病同源序列 ： 0042 1.RGA 引物设计 0043 根据从 Rice Genome Annotatation Project(http:/rice.plantbiology.msu. edu/) 上检索到的全基因组抗病同源序列 （任鄄胜， 肖培村， 陈勇， 吕启明， 王玉平， 赵慧霞， 李仕贵 . 水稻全基因组编码抗病基因同源序列分析 . 生物信息学， 2010， 8（2） ： 91-97） ， 利 用引物设计软件 PrimerPremier6 设计了水稻全基因组 RGA 引物。 0044 2.137 份全球核心种质 RGA 基因型鉴定 。

31、0045 用CTAB法 （Murray95 20s,57 45s,72 1min, 共 35 个循环 ； 然后 72 延长 7min ； 最后 4保存。 0054 PCR 产物在 1% 琼脂糖电泳分离， 用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的片段。再将用 说 明 书 CN 103333884 A 9 6/9 页 10 将目的片段构建到宝生物工程有限公司生产的 PMD19-T 质粒载体， 然后将构建好的载体转 化到感受态大肠杆菌 DH5 中， 最后送样测序。 （见序列附表） 0055 5. 序列比对分析 0056 序列 RGA132-3 共 562bp， 通过在线软件 http:/blast.ncbi.。

32、nlm. nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastSearch&PROG_DEF=blastn&BLAST_PROG_ DEF=megaBlast&SHOW_DEFAULTS=on&BLAST_SPEC=blast2seq&LINK_LOC=align2se q 对抗感 种质的 PCR 片段比对发现两者存在两个碱基缺失 ； 通过 http:/rice.plantbiology.msu. edu/analyses_search_blast.shtml 比对， RGA132-3 与 LOC_Os08g07930 在 939-1449bp 之 间 99% 的同源。序列 RG。

33、A132-3 推测编码一个 NBS-LRR 抗性蛋白。 0057 序列 RGA170-2 共 1521bp， 编码一个 284 个氨基酸的 NBS 蛋白结构域。通过 DNAMAN6.0 对抗感种质的 PCR 片段比对发现两者在蛋白质序列中存在 1 个氨基酸突变 ； 通 过 http:/rice.plantbiology.msu.edu/analyses_search_blast.shtml 比 对， RGA132-3 与 LOC_Os08g07930 在 193-1712bp 之间 99% 的同源。 0058 序列 RGA198-2 共 954bp， 编码一个 154 个氨基酸， 属于 zf-。

34、BED 超级家族。 。通过 DNAMAN6.0 对抗感种质的 PCR 片段比对发现两者在蛋白质序列中存在 1 个氨基酸突变 ； 通 过 http:/rice.plantbiology.msu.edu/analyses_search_blast.shtml 比 对， RGA198-2 与 LOC_Os04g53160 在 382-1050bp 之间 94% 的同源。 0059 序 列 RGA255-2 共 1108bp， 通 过 在 线 软 件 http:/blast.ncbi.nlm. nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastSearch&PROG_DEF=blast。

35、n&BLAST_PROG_ DEF=megaBlast&SHOW_DEFAULTS=on&BLAST_SPEC=blast2seq&LINK_LOC=align2seq 对 抗感种质的 PCR 片段比对发现两者存在多个碱基缺失或突变 ； 通过 http:/rice. plantbiology.msu.edu/analyses_search_blast.shtml 比对， RGA255-2 与 LOC_ Os12g28070 在 2474-3516bp 之间 96% 的同源。 0060 序列 RGA305-2 共 1001bp， 编码一个 226 个氨基酸的 PLN03210 蛋白结构域。通 过。

36、 DNAMAN6.0 对抗感种质的 PCR 片段比对发现两者在蛋白质序列中存在 7 个氨基酸插入 / 缺失 ； 通过 http:/rice.plantbiology.msu.edu/analyses_search_blast.shtml 比对， RGA305-2 与 LOC_Os05g31550 在 2650-3630bp 之间 99% 的同源。 0061 序列RGA306-2共603bp， 通过在线软件http:/blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast. cgi?PAGE_TYPE=BlastSearch&PROG_DEF=blastn&BLAST_PROG_DEF=meg。

37、aBlast&SHOW_ DEFAULTS=on&BLAST_SPEC=blast2seq&LINK_LOC=align2seq 对抗感种质的 PCR 片段比对 发现两者存在多个碱基插入缺失 ； 通过 http:/rice.plantbiology.msu.edu/analyses_ search_blast.shtml 比对， RGA306-2 与 LOC_Os05g31570 在 235-624bp 之间 74% 的同源。 0062 序列 RGA9-2 共 1347bp， 编码一个 327 个氨基酸的 B-Lectin 蛋白结构域。通过 DNAMAN6.0 对抗感种质的 PCR 片段比对发。

38、现两者在蛋白质序列中存在多个氨基酸突变 ； 通 过 http:/rice.plantbiology.msu.edu/analyses_search_blast.shtml 比 对， RGA132-3 与 LOC_Os08g07930 在 193-1712bp 之间 99% 的同源。 0063 序列 RGA116-5 共 1189bp， 编码一个 181 个氨基酸。通过 DNAMAN6.0 对抗感 种质的 PCR 片段比对发现两者在蛋白质序列中存在 1 个氨基酸突变 ； 通过 http:/ rice.plantbiology.msu.edu/analyses_search_blast.shtml。

39、 比对， RGA116-5 与 LOC_ 说 明 书 CN 103333884 A 10 7/9 页 11 Os06g37840 在 173-867bp 之间 98% 的同源。 0064 表1水稻抗稻曲病关联RGA引物及其产生的抗病同源序列片段以及相对应的抗病 同源序列在 Rice Genome Annotatation Project 上的注释号 0065 0066 实施例 ： 抗稻曲病表型 -RGA 基因型关联分析 0067 1. 分子 - 抗稻曲病表型关联分析 0068 通过对全基因组抗病同源序列 （Resistance Gene Analog， RGA） 共设计了 472 对 RGA 。

40、引物 ,472 对 RGA 引物在 137 份美国农业部核心水稻种质 （引自美国农业部服务署水稻 研究中心） 的共扩增出 719 条 PCR 片段， 有 138 对 RGA 引物在 137 份核心种质中扩增出多态 性。 0069 在 2009 年 -2011 年， 通过稻曲病病菌微注射法， 连续三年对 37 份核心种质的稻曲 病抗性鉴定， 获得 137 份核心种质的抗稻曲病表型。 0070 结合RGA基因型和抗稻曲病表型， 利用单个分子标记分析法， 用SAS统计软件的方 差分析法进行分子 - 性状关联分析， 获得 8 个 RGA 位点关联稻曲病抗性 （如表 2） 。 0071 Table2. 。

41、利用单分子标记关联分析法获得的与稻曲病抗性相关的 RGA 等位位点 0072 说 明 书 CN 103333884 A 11 8/9 页 12 0073 * 代表关联稻曲病抗性的等位位点。 0074 2. 关联稻曲病抗性 PCR 片段克隆 0075 对关联水稻抗稻曲病抗性的 PCR 片段进行了克隆测序。抗性种质选取连续三年未 发病的 WC2811、 Italica Carolina、 Djimoron、 IR9660-48-1-1-2、 IARI6621， 感病种质选取 连续三年均发病较重的 DJ53、 H232-44-1-1、 NINGHUI18（表 3） 。将获得的抗病同源序列片 段进行生。

42、物学分析。首先， 将其序列进行 Blastn 比对， 观察是否标记的是引物设计来源的 抗病同源序列， 结果是所获得PCR片段均为用来设计RGA引物的抗病同源序列， 同源性均在 90%以上 ； 利用在线软件 http:/linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=fgenesh&gr oup=programs&subgroup=gfind预测蛋白质序列， 并进行Blastp比对， 发现抗感种质的DNA 序列或是蛋白质序列片段均出现碱基或氨基酸差异。因此， 认为所标记的抗病同源序列与 水稻抗稻曲病相关。 0076 表 3. 所标记抗病同源序列克隆测序的种质及其稻曲。

43、病抗性。 0077 说 明 书 CN 103333884 A 12 9/9 页 13 0079 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已， 并不用以限制本发明， 凡在本发明的精 神和原则之内所作的任何修改、 等同替换和改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。 0078 说 明 书 CN 103333884 A 13 1/4 页 14 0001 序 列 表 CN 103333884 A 14 2/4 页 15 0002 0003 序 列 表 CN 103333884 A 15 3/4 页 16 0004 序 列 表 CN 103333884 A 16 4/4 页 17 序 列 表 CN 103333884 A 17 1/3 页 18 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 103333884 A 18 2/3 页 19 图 4 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 103333884 A 19 3/3 页 20 图 7 说 明 书 附 图 CN 103333884 A 20 。