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1、(10)申请公布号 CN 103340902 A (43)申请公布日 2013.10.09 CN 103340902 A *CN103340902A* (21)申请号 201310269183.2 (22)申请日 2009.05.20 PCT/US2008/064895 2008.05.27 US 200980118954.X 2009.05.20 A61K 35/12(2006.01) A61K 35/32(2006.01) A61K 38/19(2006.01) A61P 9/10(2006.01) A61P 9/04(2006.01) C12N 5/07(2010.01) C12N 5/。
2、0775(2010.01) (71)申请人 梅奥医学教育和研究基金会 地址 美国明尼苏达州 (72)发明人 安德烈泰尔齐奇 阿塔贝法尔 (74)专利代理机构 北京三友知识产权代理有限 公司 11127 代理人 丁香兰 庞东成 (54) 发明名称 含有心源性因子的组合物和相关方法、 细胞， 以及所述组合物、 方法和细胞的应用 (57) 摘要 本发明涉及含有心源性因子的组合物， 还涉 及通过在这些因子的存在下培养初始细胞从而获 得细胞的方法， 还涉及通过所述方法获得的细胞， 以及所述组合物、 方法和细胞在制造用于治疗缺 血性心肌病、 心肌梗塞或心力衰竭的药物中的应 用。 (30)优先权数据 (62。
3、)分案原申请数据 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 14 页 附图 11 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书14页 附图11页 (10)申请公布号 CN 103340902 A CN 103340902 A *CN103340902A* 1/2 页 2 1. 一种组合物， 所述组合物包含 TGF-1、 BMP4、 - 凝血酶、 IL-6 和视黄酸。 2. 如权利要求 1 所述的组合物， 所述组合物包含选自由 FGF-2、 IGF-1、 活化素 -A、 TNF-、 FGF-4、 LIF、 VEGF-A 及其组合组成的组的至少一。
4、种化合物。 3. 如前述权利要求中任一项所述的组合物， 所述组合物包含 FGF-2、 IGF-1 和活化 素 -A。 4. 如权利要求 1 所述的组合物， 所述组合物不包含选自由 TNF-、 FGF-4、 LIF 和 VEGF-A 组成的组的至少一种化合物。 5. 如权利要求 1 至 4 中任一项所述的组合物， 其中当一种化合物存在于所述组合物中 时， 其存在量为 ： 所述TGF-1以1ng/ml至5ng/ml的量存在， 所述BMP4以1ng/ml至10ng/ ml的量存在， 所述-凝血酶以0.5单位/ml至5单位/ml的量存在， 所述FGF-2以1ng/ml 至 10ng/ml 的量存在， 。
5、所述 IGF-1 以 10ng/ml 至 100ng/ml 的量存在， 所述活化素 -A 以 1ng/ ml 至 50ng/ml 的量存在， 所述 TNF- 以 1ng/ml 至 50ng/ml 的量存在， 所述 FGF-4 以 1ng/ ml 至 20ng/ml 的量存在， 所述 IL-6 以 10ng/ml 至 100ng/ml 的量存在， 所述 LIF 以 1 单位 / ml 至 10 单位 /ml 的量存在， 所述 VEGF-A 以 1ng/ml 至 50ng/ml 的量存在， 所述视黄酸以每 ml 中 0.1M 至 1.0M 的量存在。 6. 如 权 利 要 求 1 所 述 的 组 。
6、合 物， 所 述 组 合 物 包 含 以 组 合 方 式 使 用 的 重 组 TGF-1(2.5ng/ml)、 BMP4(5ng/ml)、 活 化 素 -A(5ng/ml)、 FGF-2(10ng/ml)、 IL-6(100ng/ ml)、 因子 IIa(h- 凝血酶、 1U/ml)、 IGF-1(50ng/ml) 和视黄酸 (1M)。 7.如权利要求1至6中任一项所述的组合物， 所述组合物包含在培养基中， 所述培养基 选自由含有胎牛血清、 人血清、 血小板裂解物及其混合物的培养基组成的组。 8. 一种由初始细胞获得分化细胞的方法， 所述分化细胞以提高水平表达选自由 MEF2c mRNA、 M。
7、ESP-1mRNA、 Tbx-5mRNA、 GATA4mRNA、 Flk-1mRNA、 GATA6mRNA、 Fog-1mRNA 及其组合组 成的组的至少一种 mRNA， 和 / 或具有选自由 Nkx2.5 多肽、 MEF2C 多肽、 Tbx-5 多肽、 FOG-2 多 肽、 GATA-4 多肽、 MESP-1 多肽及其组合组成的组的至少一种多肽， 其中所述至少一种多肽 与所述分化细胞的细胞核相关， 其中所述方法包括在权利要求 1 至 7 中任一项的组合物的 存在下培养初始细胞。 9. 如权利要求 8 所述的方法， 其中所述分化细胞表达提高水平的 MEF2c mRNA 和 MESP-1mRNA。
8、。 10. 如权利要求 8 和 9 中任一项所述的方法， 其中所述初始细胞是间充质干细胞。 11. 如权利要求 10 所述的方法， 其中所述间充质干细胞是骨髓来源的干细胞。 12. 如权利要求 8 至 11 中任一项所述的方法， 其中所述间充质干细胞在细胞表面表达 CD90、 CD105、 CD133、 CD166、 CD29 和 CD44， 并且在细胞表面不表达 CD14、 CD34 和 CD45。 13. 如权利要求 8 至 12 中任一项所述的方法， 其中所述分化细胞是心脏修复细胞。 14. 通过权利要求 8 至 13 中任一项所述的方法获得的细胞。 15. 如权利要求 14 所述的细胞。
9、， 其中所述细胞是心脏修复细胞。 16.权利要求1至7中任一项所述的组合物在制造用于治疗缺血性心肌病、 心肌梗塞或 心力衰竭的药物中的应用。 17.如权利要求16所述的应用， 其中， 所述组合物包含选自由FGF-2、 IGF-1、 活化素-A、 TNF-、 FGF-4、 LIF、 VEGF-A 及其组合组成的组的至少一种化合物。 权 利 要 求 书 CN 103340902 A 2 2/2 页 3 18. 如权利要求 16 所述的应用， 其中， 所述组合物包含 FGF-2、 IGF-1 和活化素 -A。 19. 如权利要求 16 所述的应用， 其中， 所述组合物不包含选自由 TNF-、 FGF。
10、-4、 LIF 和 VEGF-A 组成的组的至少一种化合物。 20. 如权利要求 16 至 19 中任一项所述的应用， 其中， 当一种化合物存在于所述组合 物中时， 其存在量为 ： 所述 TGF-1 以 1ng/ml 至 5ng/ml 的量存在， 所述 BMP4 以 1ng/ml 至 10ng/ml 的量存在， 所述 - 凝血酶以 0.5 单位 /ml 至 5 单位 /ml 的量存在， 所述 FGF-2 以 1ng/ml 至 10ng/ml 的量存在， 所述 IGF-1 以 10ng/ml 至 100ng/ml 的量存在， 所述活化素 -A 以 1ng/ml 至 50ng/ml 的量存在， 所。
11、述 TNF- 以 1ng/ml 至 50ng/ml 的量存在， 所述 FGF-4 以 1ng/ml 至 20ng/ml 的量存在， 所述 IL-6 以 10ng/ml 至 100ng/ml 的量存在， 所述 LIF 以 1 单位 /ml 至 10 单位 /ml 的量存在， 所述 VEGF-A 以 1ng/ml 至 50ng/ml 的量存在， 所述视黄 酸以每 ml 中 0.1M 至 1.0M 的量存在。 21. 如权利要求 20 所述的应用， 其中， 所述组合物还包含 - 凝血酶、 FGF-2、 IGF-1 和 活化素 -A。 22. 如权利要求 21 所述的应用， 其中， 所述组合物包含 1。
12、U/ml- 凝血酶、 10ng/ mlFGF-2、 50ng/ml IGF-1 和 5ng/ml 活化素 -A。 23. 如权利要求 16 所述的应用， 其中， 所述组合物包含以组合方式使用的重组 TGF-1、 BMP4、 活化素 -A、 FGF-2、 IL-6、 因子 IIa、 IGF-1 和视黄酸。 24. 如权利要求 23 所述的应用， 其中， 所述组合物包含 2.5ng/ml 重组 TGF-1、 5ng/ml BMP4、 5ng/ml活化素-A、 10ng/ml FGF-2、 100ng/ml IL-6、 1U/ml因子IIa、 50ng/ml IGF-1和 1M 视黄酸。 25. 如。
13、权利要求 24 所述的应用， 其中， 所述因子 IIa 是 h- 凝血酶。 26. 如权利要求 16 所述的应用， 其中， 所述组合物包含在培养基中， 所述培养基选自由 含有胎牛血清、 人血清、 血小板裂解物及其混合物的培养基组成的组。 27. 引导心脏修复的细胞群在制造用于治疗哺乳动物的缺血性心肌病、 心肌梗塞或心 力衰竭的药物中的应用， 其中所述引导心脏修复的细胞群通过包括下述步骤的方法获得 ： (i) 在含有 TGF-1、 BMP4、 - 凝血酶、 IL-6 和视黄酸的组合物的存在下培养初始细胞， 和 (ii) 确定来自所述引导心脏修复的细胞群的细胞样品包含这样的细胞 ： 该细胞以提高 。
14、水平表达选自由 MEF2c mRNA、 MESP-1mRNA、 Tbx-5mRNA、 GATA4mRNA、 Flk-1mRNA、 GATA6mRNA、 Fog-1mRNA 及其组合组成的组的至少一种 mRNA， 和 / 或具有选自由 Nkx2.5 多肽、 MEF2C 多 肽、 Tbx-5 多肽、 MESP-1 多肽、 GATA-4 多肽、 FOG-2 多肽及其组合组成的组的至少一种多肽， 其中所述多肽与所述细胞的细胞核相关。 28. 如权利要求 27 所述的应用， 其中， 所述方法包括采用逆转录聚合酶链式反应。 29. 如权利要求 27 或 28 所述的应用， 其中， 所述引导心脏修复的细胞群。
15、适合于通过选 自由全身施用、 心脏内施用和冠脉内施用组成的组的程序进行施用。 权 利 要 求 书 CN 103340902 A 3 1/14 页 4 含有心源性因子的组合物和相关方法、 细胞， 以及所述组合 物、 方法和细胞的应用 0001 本申请是分案申请， 其原申请的国际申请号为 PCT/US2009/044714， 国际申请日为 2009年5月20日， 中国国家申请号为200980118954.X， 进入中国国家阶段的进入日为2010 年 11 月 24 日， 国际公开发明名称译文为 “利用细胞治疗心脏组织的组合物和方法” 。 0002 相关申请交叉引用 0003 本申请要求于 2008。
16、 年 5 月 27 日提交的国际申请 PCT/US2008/064895 的优先权权 益。 技术领域 0004 本发明涉及用于获得和使用心脏细胞的方法和材料。例如， 本发明涉及用于向哺 乳动物心脏组织提供可作为功能性心肌细胞导入心脏组织的细胞 ( 例如分化心肌祖细胞 (cardioprogenitor cell) 或心脏修复细胞 (cardiopoietic cell) 的方法和材料。 背景技术 0005 尽管病人处理不断进步， 心血管疾病还是世界范围内发病和死亡的主要因素。与 具有高度修复能力的组织相比， 心脏组织容易受到无法修复的损伤。因此在临床环境中一 直在寻求基于细胞的再生心血管药物。。
17、 0006 最近出现的干细胞生物学将现有的实践模式的范围由传统的缓解扩展至治愈性 修复。 通常而言， 临床经验基于由自体来源收集并以未改变的状态进行输送的成体干细胞。 第一代生物制剂是天然人体干细胞， 被认为是易得的细胞类型。已显示出经输送天然人体 干细胞使得特定患者得以改善。 发明内容 0007 定义 0008 在本说明书的框架范围内， 除非有相反指示， 以下引号内的术语的定义如下。 0009 术语 hMSCs 指人间充质干细胞。 0010 细胞的 心生成潜力 是指该细胞在注入受损心脏后能成功产生心脏细胞例如心 肌的能力。 0011 心脏修复细胞 (CP) 是指处于由未分化细胞分化的途径中的。
18、细胞。 “心脏修复细 胞” 表现出由早期心转录因子 Nkx2.5 和晚期心转录因子 MEF2C 的核转位所确定的心分化 (Behfar等， Derivation of a cardiopoietic population from human mesenchymal stem yields progeny,Nature Clinical Practice,Cardiovascular Medicine,March2006vol.3 supplement1,pages S78S82)。 能观察到心转录因子GATA4的核转位。 心脏修复细胞可缺 少肌节并缺少肌节蛋白的表达。心脏修复细胞保留自身分裂。
19、的能力。因为心脏修复细胞可 以分化为心肌细胞， 所以也称为 “心肌细胞前体” 或 “心肌细胞祖细胞” 。在本文的内容中， 心脏修复细胞可来源于人成体间充质干细胞 (hMSC)。 CP-hMSCs 则指那些来源于人成体 说 明 书 CN 103340902 A 4 2/14 页 5 间充质干细胞的心脏修复细胞。 0012 鸡尾酒式混合物 或 心源性鸡尾酒式混合物 指含有至少两种心源性物质的组 合物。 0013 心源性物质 是改善细胞的心生成潜力的物质。 0014 鸡尾酒式混合物 - 引导细胞 或 引导心脏修复的细胞 是已经与鸡尾酒式混合 物相接触并进而进入分化的细胞。 0015 分化 是较少特化。
20、细胞变为更加特化细胞的过程。 0016 射血分数 意指在一次心跳中泵出的血液的分数。未限定时， 术语射血分数专指 左心室的射血分数 ( 左心室射血分数或 LVEF)。 0017 射血分数变化 指在指定时间后测量的经注射细胞至其梗塞心脏而治疗的动物 的心脏的射血分数与注射前测量的射血分数之间的差别。 0018 除非另外定义， 本文中所使用的技术和科学术语均与本发明所属领域的普通技术 人员所通常理解的含义相同。 虽然与本文所描述的方法和材料相似或者等价的方法和材料 也能用于实现本发明， 但适宜的方法和材料如下所述。本文中提到的公报、 专利申请、 专利 和其他参考文献均以参考的方式整体引入。在矛盾的。
21、情况下， 以本发明说明书包括定义为 准。此外， 所述材料、 方法和实例仅是描述性的， 而不具有限制性。 0019 本发明涉及包含 TGF-1、 BMP4、 - 凝血酶、 选自心营养素 (Cardiotrophin) 和 IL-6的化合物、 以及选自Cardiogenol C和视黄酸的化合物的组合物。 在优选实施方式中， 本发明的组合物包含 TGF-1、 BMP4、 - 凝血酶、 心营养素和 Cardiogenol C。本发明的组 合物可以包含选自 FGF-2、 IGF-1、 活化素 -A(Activin-A)、 TNF-、 FGF-4、 LIF、 VEGF-A 及其 组合的至少一种化合物。本发。
22、明的组合物还可以包含 FGF-2、 IGF-1 和活化素 -A。本发明 的其他优选组合物包含活化素 -A、 FGF-2、 IL-6、 IGF-1 和视黄酸。根据替代性实施方式， 本 发明的组合物可以不包括选自 TNF-、 FGF-4、 LIF 和 VEGF-A 的至少一种化合物。 0020 当在本发明的组合物中存在以下化合物中的一种时， 其存在量如下 ： 所述 TGF-1 以 1ng/ml 至 5ng/ml 的量存在， 所述 BMP4 以 1ng/ml 至 10ng/ml 的量存在， 所述心 营养素以 0.5ng/ml 至 5ng/ml 的量存在， 所述 - 凝血酶以 0.5 单位 /ml 至。
23、 5 单位 /ml 的 量存在， 所述 Cardiogenol C 以 50nM 至 500nM 的量存在， 所述 FGF-2 以 1ng/ml 至 10ng/ml 的量存在， 所述 IGF-1 以 10ng/ml 至 100ng/ml 的量存在， 所述活化素 -A 以 1ng/ml 至 50ng/ ml的量存在， 所述TNF-以1ng/ml至50ng/ml的量存在， 所述FGF-4以1ng/ml至20ng/ml 的量存在， 所述 IL-6 以 10ng/ml 至 100ng/ml 的量存在， 所述 LIF 以 1 单位 /ml 至 10 单位 /ml 的量存在， 所述 VEGF-A 以 1n。
24、g/ml 至 50ng/ml 的量存在， 所述视黄酸以每 ml 中 0.1M 至 1.0M 的量存在。 0021 本发明的优选组合物包含以组合方式使用的重组 TGF-1(2.5ng/ml)、 BMP4(5ng/ ml)、 心营养素 (1ng/ml)、 Cardiogenol C(100nM)。本发明特别优选的组合物包含所述化 合物， 并还包含 - 凝血酶 (1U/ml)、 FGF-2(10ng/ml)、 IGF-1(50ng/ml) 和活化素 -A(5ng/ ml)。 0022 本发明的其他优选组合物包含以组合方式使用的重组 TGF-1(2.5ng/ml)、 BMP4(5ng/ml)、 活化素。
25、 -A(5ng/ml)、 FGF-2(10ng/ml)、 IL-6(100ng/ml)、 因子 IIa(h- 凝血 酶、 1U/ml)、 IGF-1(50ng/ml) 和视黄酸 (1M)。 说 明 书 CN 103340902 A 5 3/14 页 6 0023 优选的是， 本发明的组合物包含在培养基中， 所述培养基选自含有胎牛血清、 人血 清、 血小板裂解物及其混合物的培养基。 0024 本发明还涉及一种由最初的细胞获得分化细胞的方法， 所述分化细胞以提高水 平 表 达 选 自 MEF2c mRNA、 MESP-1mRNA、 Tbx-5mRNA、 GATA4mRNA、 Flk-1mRNA、 。
26、GATA6mRNA、 Fog-1mRNA 及其组合的至少一种 mRNA， 和 / 或具有选自 Nkx2.5 多 肽、 MEF2C 多肽、 Tbx-5 多 肽、 FOG-2 多肽、 GATA-4 多肽、 MESP-1 多肽及其组合的至少一种多肽， 其中所述至少一种多 肽与所述分化细胞的细胞核相关， 其中所述方法包括在本发明的组合物的存在下培养初始 细胞。在所述方法中， 所述分化细胞优选表达提高水平的 MEF2c mRNA 和 MESP-1mRNA。 0025 在本发明的优选实施方式中， 所述初始细胞是间充质干细胞。这些细胞是骨髓来 源的干细胞。它们能在细胞表面表达 CD90、 CD105、 CD。
27、133、 CD166、 CD29 和 CD44， 并且在细胞 表面不表达 CD14、 CD34 和 CD45。 0026 最优选的是， 所述分化细胞是心脏修复细胞。 0027 本发明另一方面是将分化细胞输送至哺乳动物的方法， 其中所述方法包括 ： 0028 (a) 确定分化细胞群的细胞样品包含这样的细胞 ： 该细胞以提高水平表达选自 MEF2c mRNA、 MESP-1mRNA、 Tbx-5mRNA、 GATA4mRNA、 Flk-1mRNA、 GATA6mRNA、 Fog-1mRNA 及其 组合的至少一种 mRNA， 和 / 或具有选自 Nkx2.5 多肽、 MEF2C 多肽、 Tbx-5 。
28、多肽、 MESP-1 多肽、 GATA-4 多肽、 FOG-2 多肽及其组合的至少一种多肽， 其中所述多肽与所述分化细胞的细胞 核相关， 和 0029 (b) 向所述哺乳动物施用来自所述分化细胞群的细胞。可以由在本发明的任何一 种所述组合物的存在下培养的所述初始细胞获得所述分化细胞群。在具体实施方式中， 所 述步骤 (a) 可以包括采用逆转录聚合酶链式反应或采用免疫细胞化学反应。所述施用步骤 包括通过选自全身施用、 心内施用和冠脉内施用的施用进行所述细胞的施用。 0030 本发明的另一个方面是向心脏组织提供心肌细胞的方法， 其中所述方法包括向所 述心脏组织施用通过与本发明的组合物相接触而得到的。
29、所述分化细胞。 0031 本发明的一个或多个实施方式的细节在附图和以下描述中进行阐述。 本发明的其 他特征、 目的和优点通过说明书和权利要求书是显而易见的。 附图说明 0032 图 1 表示在用来源于 11 名冠状动脉疾病患者的骨髓的天然人间充质干细胞 (hMSC) 治疗之前和之后以 % 表示的射血分数变化 (EF)。 0033 图2是在用DAPI免疫染色后通过共聚焦显微镜获得的， 显示了治疗之后未表现出 正射血分数变化的患者2(左图)和表现出正射血分数变化的患者9(右图)的心肌转录 因 子含量的蛋白表达。 0034 图 3 显示了 11 名患者的 hMSC 中两种重要的心肌转录因子 mRNA。
30、 的 mRNA 表达。 0035 图 4 显示了以任意单位 (A.U.) 表示的未经处理的天然 hMSC( 左侧 ) 和用心源性 鸡尾酒式混合物处理的 CP-hMSC( 右侧 ) 中分别为 Nkx2.5mRNA、 GATA-6mRNA 和 Fog-1mRNA 的心肌转录因子的 mRNA 表达。 0036 图 5 所示的通过共聚焦显微镜获得的图像显示， 与天然 hMSC( 左侧 ) 相比较， 用心 源性鸡尾酒式混合物处理的 CP-hMSC( 右侧 ) 中的 Nkx2.5、 MEF2C、 FOG-2 和 GATA4 多肽的核 说 明 书 CN 103340902 A 6 4/14 页 7 转位。 。
31、0037 图 6 描述了由天然 hMSC 向 “鸡尾酒式混合物引导的” CP-hMSC 的渐进转变 ( 于 D0 天、 D5 天、 D15 天和 D20 天 )， 并最终转化为心肌细胞 (CM)。 0038 图 7 显示了天然 hMSC 和鸡尾酒式混合物引导的心肌细胞的透射电子显微镜超微 结构。 0039 图 8 显示了光学显微镜下的鸡尾酒式混合物引导的心肌细胞。 0040 图9中左侧第一幅图表示来自于图1各患者的天然hMSC和CP-hMSC的Tbx-5mRNA 表达 (AU)， 天然细胞的结果位于直方图右侧， CP 细胞的结构位于直方图左侧。位于中间的 第二幅图表示 MEF2C mRNA 表。
32、达， 位于右侧的第三幅图表示 MESP-1mRNA 表达。所有患者的 天然细胞的平均值和所有患者的 CP 细胞的平均值在直方图背景中给出。 0041 图 10 表示在用不同量的天然 hMSC( 十二名患者中的各患者直方图的右侧部分 ) 进行心脏治疗后， 与用 CP-hMSC， 即鸡尾酒式混合物引导的 hMSC(CP-hMSC) 进行心脏治疗后 相比的射血分数变化 ( 射血分数 )。 0042 图 11 表示未治疗的 ( 左图 ) 和用心脏修复细胞治疗 ( 右图 ) 的梗塞心脏的超声 心动图， 显示了经 CP-hMSC 治疗后好得多的前壁恢复。 0043 图 12 是与图 5 相似的图， 显示了。
33、在梗塞心肌膜中注入天然细胞 ( 左侧 ) 和心脏修 复细胞 ( 右侧 ) 之后射血分数变化 (EF)。假治疗组没有细胞的注入。 0044 图 13 显示了治疗开始的六个月以后用天然 hMSC 和 CP-hMSC 治疗的鼠梗塞心脏。 动脉瘤和瘢痕在天然hMSC治疗的心脏中未得到修复， 而在诱导了重新肌化的CP-hMSC治疗 中都得到消解。 0045 图 14 显示了共聚焦解析所揭示的， 通过人特异性核纤层蛋白免疫染色验证， 在心 脏修复hMSC治疗的鼠心肌中， 广泛存在对人类物种具有特异性的h-ALU DNA序列为正染色 的人源性细胞， 所有这些在梗塞对照中均不存在。 0046 图 15 显示了。
34、在经心脏修复 hMSC 治疗的心脏中通过人心肌肌钙蛋白 -I 和 - 辅 肌动蛋白共定位来追踪的人源的心肌细胞。在经天然 hMSC 治疗的心脏中不存在人源的心 肌细胞。梗塞前壁内的量化揭示了经天然 hMSC 治疗的心脏相比经 CP-hMSC 治疗的心脏中 心肌细胞核为 32% 和 255%， 意味着经心脏修复 hMSC 治疗可增强移植并入。 0047 图 16 包含针对人肌钙蛋白、 心室肌球蛋白轻链 mlC2V 和 DAPI 染色的天然和 CP hMSC的照片。 通过经修复的前壁中心室肌球蛋白轻链mlC2V免疫染色对人类肌钙蛋白阳性 细胞的进行的对比染色 ( 如图 15 所示 )， 或者如图 。
35、17 中所示的消解的瘢痕， 从而证实了心 室细胞表型。 0048 图 17 是针对人肌钙蛋白、 心室肌球蛋白轻链 mlC2V 和 DAPI 染色的的残余瘢痕的 照片。 0049 图18包含经CP-hMSC治疗的再生心肌的照片， 这证实了堵塞冠状血管远端的血管 生成。 0050 图 19 通过心肌脉管系统中人 PECAM-1(CD-31) 的表达证实了 CP-hMSC 有助于新血 管生成。 0051 图 20 是描绘了在细胞输送之后相对于假治疗组的 射血分数 (%) 对比时间 ( 以 月计 ) 的图。跟踪 CP-hMSC 治疗的长期影响超过 1 年， 或者鼠寿命的三分之一， 可换算为 25 说 。
36、明 书 CN 103340902 A 7 5/14 页 8 年的人类寿命。相对于假治疗组， 天然 hMSC 的治疗在 6 个月和 12 个月时分别显示了 5% 和 2.5% 射血分数效果。相比而言， 心脏修复 hMSC 治疗的梗塞小鼠于 6 个月和 12 个月时表现 出相对于假治疗组 25% 的显著射血分数提高。 0052 图 21 是描绘了细胞移植后 射血分数 (%) 对比时间 ( 以月计 ) 的图。将梗塞组 分类以评价在干预时患有经证实的明显心力衰竭 ( 射血分数 50% 的死 亡率。相反， 利用心脏修复 hMSC 治疗得到 80% 的存活率。 0054 图 23 描述了用病理检查和心电图。
37、确定的 CP-hMSC 治疗的安全性。 具体实施方式 0055 本说明书提供了涉及心脏细胞 ( 例如， 分化心肌祖细胞 ) 的方法和材料。例如， 本说明书提供了具有作为功能性心肌细胞导入心脏组织的能力的细胞， 制造这种细胞的方 法， 制造这种细胞的组合物， 以及确定细胞群(例如分化心肌祖细胞)是否包含具有作为功 能性心肌细胞并入心脏组织的能力的细胞。本说明书还提供了向心脏组织 ( 例如人心脏组 织 ) 提供功能性心肌细胞的方法和材料。 0056 本文所提供的分化心肌祖细胞可来自于任何物种， 包括但不限于人、 猴、 马、 狗、 猫、 大鼠或小鼠。例如， 分化心肌祖细胞可以是哺乳动物 ( 例如人 。
38、) 分化心肌祖细胞。 0057 在一些情况下， 本文提供的分化心肌祖细胞具有作为功能性心肌细胞并入心脏组 织的能力。 0058 可以采用任何适宜的方法获得分化心肌祖细胞。例如， 分化心肌祖细胞可来源于 干细胞， 诸如哺乳动物 ( 例如， 人 ) 干细胞。 0059 在一些情况下， 分化心肌祖细胞可来源于胚胎干细胞。 在一些情况下， 分化心肌祖 细胞可来源于间充质干细胞。间充质干细胞可由任何来源获得。例如， 间充质干细胞可由 哺乳动物 ( 例如人 ) 组织， 如骨髓和骨小梁获得。间充质干细胞可以体外培养。例如， 间充 质干细胞可以在体外增加数量。间充质干细胞可在细胞表面表达或者不表达多肽标记物。。
39、 例如， 间充质干细胞可在细胞表面表达 CD133、 CD90、 CD105、 CD166、 CD29 和 CD44， 并且可在 细胞表面不表达 CD14、 CD34 和 CD45。 0060 可以采用任何合适的方法由干细胞 ( 例如间充质干细胞 ) 得到分化心肌祖细胞。 例如， 可以通过将间充质干细胞与组合物 ( 例如培养基 ) 进行温育从而由所述间充质干细 胞得到分化心肌祖细胞。所述组合物可以是含有一种或多种因子的任何合适的组合物。所 述因子可以是任何类型的因子， 如多肽、 类固醇、 荷尔蒙和小分子。这些因子的例子包括但 不限于 TGF、 BMP、 FGF-2、 IGF-1、 活化素 -A。
40、、 心营养素、 - 凝血酶和 Cardiogenol C。 0061 在 一 个 实 施 方 式 中， 可 以 采 用 含 有 TGF、 BMP、 心 营 养 素、 - 凝 血 酶 和 Cardiogenol C 的培养基由干细胞 ( 例如间充质干细胞 ) 得到分化心肌祖细胞。在这些情 况下， 可以 在使用含有 TGF、 BMP、 心营养素、 - 凝血酶和 Cardiogenol C 的培养基进行 的最初培养期 ( 例如一天或两天 ) 之后， 在所述培养基中加入 FGF-2、 IGF-1、 活化素 -A 或 说 明 书 CN 103340902 A 8 6/14 页 9 其组合。 0062 T。
41、GF可以是任何具有TGF活性的多肽， 诸如人TGF。 例如， TGF可以是重组 TGF 或合成 TGF。在一个实施方式中， TGF 可以是 TGF-1。可以使用任何适宜浓度 的 TGF。例如， 可以使用 1ng/ml 至 10ng/ml 的 TGF-( 例如， 约 2.5ng/ml 的 TGF1)。 0063 BMP 可以是任何具有 BMP 活性的多肽， 诸如人 BMP。例如， BMP 可以是重组 BMP 或 合成 BMP。在一个实施方式中， BMP 可以是 BMP4。可以使用任何浓度的 BMP。例如， 可以使 用 1ng/ml 至 20ng/ml 的 BMP( 例如， 约 5ng/ml 的 。
42、BMP4)。 0064 FGF-2 可以是任何具有 FGF-2 活性的多肽， 诸如人 FGF-2。例如， FGF-2 可以是重 组 FGF-2 或合成 FGF-2。可以使用任何浓度的 FGF-2。例如， 可以使用 1ng/ml 至 20ng/ml 的 FGF-2( 例如， 约 5ng/ml 的 FGF-2)。 0065 IGF-1 可以是任何具有 IGF-1 活性的多肽， 诸如人 IGF-1。例如， IGF-1 可以是重 组 IGF-1 或合成 IGF-1。可以使用任何浓度的 IGF-1。例如， 可以使用 10ng/ml 至 100ng/ml 的 IGF-1( 例如， 约 50ng/ml 的 。
43、IGF-1)。 0066 活化素 -A 可以是任何具有活化素 -A 活性的多肽， 诸如人活化素 -A。例如， 活化 素 -A 可以是重组活化素 -A 或合成活化素 -A。可以使用任何浓度的活化素 -A。例如， 可以 使用 1ng/ml 至 50ng/ml 的活化素 -A( 例如， 约 10ng/ml 的活化素 -A)。 0067 - 凝血酶可以是任何具有 - 凝血酶活性的多肽， 诸如人 - 凝血酶。例如， - 凝血酶可以是重组 - 凝血酶或合成 - 凝血酶。可以使用任何浓度的 - 凝血酶。 例如， 可以使用 0.5 单位 /ml 至 10 单位 /ml 的 - 凝血酶 ( 例如， 约 1 单位。
44、 /ml 的 - 凝 血酶 )。 0068 心营养素可以是任何具有心营养素活性的多肽， 诸如人心营养素-1。 例如， 心营养 素可以是重组心营养素或合成心营养素。可以使用任何浓度的心营养素。例如， 可以使用 0.5ng/ml 至 10ng/ml 的心营养素 ( 例如， 约 1ng/ml 的心营养素 -1)。 0069 IL-6可以是任何具有IL-6活性的多肽， 诸如人IL-6。 例如， IL-6可以是重组IL-6 或合成 IL-6。可以使用任何浓度的 IL-6。例如， 可以使用 100ng/ml 至 200ng/ml 的 IL-6。 0070 可以使用任何浓度的 Cardiogenol C 或。
45、其可药用盐 ( 例如盐酸 Cardiogenol C)。 例 如， 可以使用 10nM 至 1000nM 的 Cardiogenol C( 例如， 约 100nM 的 Cardiogenol C)。 0071 视黄酸可以是任何具有视黄酸活性分子， 诸如合成视黄酸、 天然视黄酸、 维生素 A 代谢物、 维生素A的天然衍生物或维生素A的合成衍生物。 可以使用任何浓度的视黄酸。 例 如， 可以使用 110-6M 至 210-6M 的视黄酸。 0072 在一些情况下， 可以使用补充有 TGF-1( 例如， 2.5ng/ml)、 BMP4( 例如， 5ng/ml)、 FGF-2( 例如， 5ng/ml)。
46、、 IGF-1( 例如， 50ng/ml)、 活化素 -A( 例如， 10ng/ml)、 心营养素 ( 例 如， 1ng/ml)、 - 凝血酶 ( 例如， 1 单位 /ml) 和 Cardiogenol C( 例如， 100nM) 的含有血清 或不含有血清的培养基由干细胞 ( 例如， 间充质干细胞 ) 得到分化心肌祖细胞。在一些情 况下， 所述培养基 ( 例如含有血清或不含有血清的培养基 ) 可含有血小板裂解物 ( 例如， 人 血小板裂解物 )。 0073 在一些情况下， 用以由间充质干细胞获得分化心肌祖细胞的组合物可含有其他可 选的因子， 诸如 TNF-、 LIF 和 VEGF-A。 007。
47、4 TNF- 可以是任何具有 TNF- 活性的多肽， 诸如人 TNF-。例如， TNF- 可以 说 明 书 CN 103340902 A 9 7/14 页 10 是重组 TNF- 或合成 TNF-。可以使用任何浓度的 TNF-。例如， 可以使用 5ng/ml 至 50ng/ml 的 TNF-。 0075 LIF 可以是任何具有 LIF 活性的多肽， 诸如人 LIF。例如， LIF 可以是重组 LIF 或 合成 LIF。可以使用任何浓度的 LIF。例如， 可以使用 2.5ng/ml 至 100ng/ml 的 LIF。 0076 VEGF-A 可以是任何具有 VEGF-A 活性的多肽， 诸如人 V。
48、EGF-A。例如， VEGF-A 可以 是重组 VEGF-A 或合成 VEGF-A。可以使用任何浓度的 VEGF-A。例如， 可以使用 5ng/ml 至 200ng/ml 的 VEGF-A。 0077 本文提供的组合物可含有任意组合的因子。例如， 本文提供的组合物可含有 TGF-1、 BMP4、 活化素 -A、 心营养素、 - 凝血酶和 Cardiogenol C。在一些情况下， 本文提 供的组合物可含有 TGF-1、 BMP4、 FGF-2、 IGF-1、 心营养素、 - 凝血酶和 Cardiogenol C。 在一些情况下， 本文提供的组合物可含有 TGF-1、 BMP4、 FGF-2、 。
49、IGF-1、 心营养素、 - 凝 血酶和 Cardiogenol C。在一些情况下， 本文提供的组合物可不含有 TNF-、 IL-6、 LIF、 VEGF-A、 视黄酸或其任何组合 ( 例如， IL-6、 LIF、 VEGF-A 和视黄酸 ； LIF、 VEGF-A 和视黄酸 ； 或 TNF-、 IL-6、 LIF 和 VEGF-A)。 0078 本文提供的组合物可以采用任何适宜的方法进行制备。例如， 可以使用商售因子 制备本文提供的组合物。在一些情况下， 本文提供的组合物经制备可包含细胞裂解物 ( 例 如血小板裂解物)或来自诸如心肌细胞或TNF-刺激的内胚层细胞等细胞的条件培养基。 例如， 可以使用补充有商售因子的血小。