应用鹅胚传代细胞系和生物反应器培养小鹅瘟病毒的方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103320393 A (43)申请公布日 2013.09.25 CN 103320393 A *CN103320393A* (21)申请号 201310243434.X (22)申请日 2013.06.19 C12N 7/00(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (71)申请人 浙江美保龙生物技术有限公司 地址 321017 浙江省金华市婺城区宾虹路二 段 298 号 308 室 (72)发明人 李阳 闫艳丽 刘雪 徐晓艳 王二先 (74)专利代理机构 杭州浙科专利事务所 ( 普通 合伙 ) 33213 代理人 吴秉中 (54) 发明名称 应用鹅。

2、胚传代细胞系和生物反应器培养小鹅 瘟病毒的方法 (57) 摘要 应用鹅胚传代细胞系和生物反应器培养小鹅 瘟病毒的方法， 属于兽用生物制品技术领域。其 包括以下工艺步骤 ： 1） 种细胞的培养 ； 2） 繁殖病 毒用细胞的悬浮培养 ； 3） 病毒的培养与收获。本 发明可以缩短生产周期， 降低人员配置， 污染几率 低， 占地面积小， 并且得到的病毒滴度高， 批间差 异小。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103320393 A CN 。

3、103320393 A *CN103320393A* 1/1 页 2 1. 应用鹅胚传代细胞系和生物反应器培养小鹅瘟病毒的方法， 其特征在于包括以下工 艺步骤 ： 1） 种细胞的培养 ： 用细胞生长液对种细胞进行培养 ； 2） 繁殖病毒用细胞的悬浮培养 ： 将步骤 1） 培养得到的种细胞悬浮液接种至灌注袋中， 吸附后在生物反应器中加入细胞生长液进行悬浮培养 ； 3） 病毒的培养与收获 ： 将小鹅瘟病毒悬液接种于生物反应器中， 换用维持液进行培养， 接毒后实时监测糖耗情况， 当糖耗接近 0 时， 即开始收获病毒， 收获病毒后， 反复冻融灌注 袋， 收获全悬病毒液， 经检验合格后置于 -20保存。。

4、 2. 如权利要求 1 所述的应用鹅胚传代细胞系和生物反应器培养小鹅瘟病毒的方法， 其 特征在于所述的步骤 1） 中种细胞为鹅胚成纤维传代细胞系 CGBQ。 3. 如权利要求 1 所述的应用鹅胚传代细胞系和生物反应器培养小鹅瘟病毒的方法， 其 特征在于所述的步骤 1） 中种细胞采用方瓶培养法、 转瓶培养法或微型反应器培养法进行培 养。 4. 如权利要求 1 所述的应用鹅胚传代细胞系和生物反应器培养小鹅瘟病毒的方法， 其 特征在于所述的步骤 2） 中生物反应器为激流灌注式生物反应器、 搅拌式生物反应器或潮汐 式生物反应器。 5. 如权利要求 1 所述的应用鹅胚传代细胞系和生物反应器培养小鹅瘟病毒。

5、的方法， 其 特征在于所述的步骤 2） 中生物反应器的微载体类型为聚酯纤维纸片， 使用前用灭菌 PBS 浸 泡过夜。 6. 如权利要求 1 所述的应用鹅胚传代细胞系和生物反应器培养小鹅瘟病毒的方法， 其 特征在于所述的步骤 2） 中悬浮培养条件为 ： 温度 37 38， pH7.0 7.6， 溶解氧 30% 60%， 接种量为 3 6109个细胞。 7. 如权利要求 1 所述的应用鹅胚传代细胞系和生物反应器培养小鹅瘟病毒的方法， 其 特征在于所述的步骤 2） 中悬浮培养时根据细胞糖耗情况随时补糖或者补加细胞生长液， 确 保残糖不低于 2g/L。 8. 如权利要求 1 所述的应用鹅胚传代细胞系和。

6、生物反应器培养小鹅瘟病毒的方法， 其 特征在于所述的步骤 3） 中培养条件为 ： 温度 37 38， pH7.4 7.6， 溶解氧 30% 50%。 9. 如权利要求 1 所述的应用鹅胚传代细胞系和生物反应器培养小鹅瘟病毒的方法， 其特征在于所述的细胞生长液含 90%Ham s F12K 或者 DMEM、 10% 胎牛血清， 其 pH 为 7.0 7.6、 溶解氧为 30% 60%， 含糖 4.0g/L ； 所述的维持液含 97%Ham s F12K 或者 DMEM、 3% 胎 牛血清， 其 pH 为 7.4 7.6、 溶解氧为 30% 50%， 含糖 4.0g/L。 权 利 要 求 书 CN。

7、 103320393 A 2 1/4 页 3 应用鹅胚传代细胞系和生物反应器培养小鹅瘟病毒的方法 技术领域 0001 本发明属于兽用生物制品技术领域， 具体涉及应用鹅胚传代细胞系和生物反应器 培养小鹅瘟病毒的方法。 背景技术 0002 小鹅瘟 （Gosling Plague， GP） 是由小鹅瘟病毒 （Gosling Plague Virus， GPV） 引 起的雏鹅急性或者亚急性的败血性传染病。本病主要侵害出壳后 30 日龄以内的雏鹅及雏 番鸭， 具有传播快， 发病率和死亡率高的特点， 死亡率可达 90%100%。1956 年， 方定一首先 在我国扬州发现本病， 并于1961年用鹅胚分离到该。

8、病毒。 1965年后， 在匈牙利、 德国、 荷兰、 前苏联、 意大利、 英国、 法国、 南斯拉夫、 越南、 以色列等国家先后报道了该病的存在。 目前世 界许多饲养鹅及番鸭地区都有本病的爆发和流行。GPV 是细小病毒科 （Parvoviridae） ， 细 小病毒属 （Parvovirinae） 中的细小病毒 （Parvovirus） 成员， 为无囊膜， 单链 DNA 病毒， 直径 为 2022nm， 是目前已知的动物病毒中较小、 较简单病毒之一。鹅细小病毒以肠道栓塞为特 征性病变， 该病发病急， 死亡率高， 是危害养鹅业的主要传染病之一。 病鹅表现为精神萎顿、 昏睡、 食欲废绝、 排出灰白色或。

9、者淡黄色稀粪便、 混有气泡、 肛门外突， 周围被毛潮湿并有污 染物。临死前出现两腿麻痹或者抽搐症状。目前小鹅瘟无有效治疗药物， 最有效的办法是 对健康鹅实施疫苗接种加以预防。 0003 目前繁殖培养小鹅瘟病毒的方法基本上为鹅胚培养法、 鸭胚培养法以及转瓶鹅胚 原代成纤维细胞培养法。直接采用胚体进行病毒繁殖易受非免疫胚体来源限制， 同时采用 胚体繁殖病毒， 由于培养的病毒悬液中含有大量杂蛋白会给后续疫苗制备带来安全隐患， 另外胚体废弃物处理不当也会存在散毒的危险。转瓶原代细胞培养技术虽然比较成熟， 但 是制备原代成纤维细胞工序繁琐， 并且批次间差异较大， 培养的病毒量小毒价低， 同时也存 在胚体。

10、源外源病毒污染的生物安全隐患。 0004 近年来， 生物反应器和微载体技术培养细胞、 繁殖病毒在生物制药行业应用广泛。 与传统的胚体和转瓶培养工艺相比， 悬浮培养技术有着巨大的优势 ： 首先单位体积内有效 工作细胞数量增加 ； 其次全密闭、 管道化系统生产流程及过程自动化监控、 控制技术， 不仅 减少了污染细胞的机会， 而且在减轻劳动强度的同时减少人为操作因素影响 ； 再者生物反 应器容积的扩大， 提高了产品的均一性， 也提高了产品的产量和质量 ； 最后生产疫苗所用的 成本远低于传统胚体培养工艺与转瓶培养工艺， 综合成本大大降低。我国的生物反应器悬 浮培养技术起步较晚， 但近几年该技术在国内的。

11、发展非常快。 发明内容 0005 针对现有技术存在的问题， 本发明的目的在于设计提供一种应用鹅胚传代细胞系 和生物反应器培养小鹅瘟病毒的方法的技术方案， 该方法可以缩短生产周期， 降低人员配 置， 污染几率低， 占地面积小， 并且得到的病毒滴度高， 批间差异小。 0006 所述的应用鹅胚传代细胞系和生物反应器培养小鹅瘟病毒的方法， 其特征在于包 说 明 书 CN 103320393 A 3 2/4 页 4 括以下工艺步骤 ： 1） 种细胞的培养 ： 用细胞生长液对种细胞进行培养 ； 2） 繁殖病毒用细胞的悬浮培养 ： 将步骤 1） 培养得到的种细胞悬浮液接种至灌注袋中， 吸附后在生物反应器中加。

12、入细胞生长液进行悬浮培养 ； 3） 病毒的培养与收获 ： 将小鹅瘟病毒悬液接种于生物反应器中， 换用维持液进行培养， 接毒后实时监测糖耗情况， 当糖耗接近 0 时， 即开始收获病毒， 收获病毒后， 反复冻融灌注 袋， 收获全悬病毒液， 经检验合格后置于 -20保存。 0007 所述的应用鹅胚传代细胞系和生物反应器培养小鹅瘟病毒的方法， 其特征在于所 述的步骤 1） 中种细胞为鹅胚传代细胞系 CGBQ。 0008 所述的应用鹅胚传代细胞系和生物反应器培养小鹅瘟病毒的方法， 其特征在于所 述的步骤 1） 中种细胞采用方瓶培养法、 转瓶培养法或微型反应器培养法进行培养。 0009 所述的应用鹅胚传代。

13、细胞系和生物反应器培养小鹅瘟病毒的方法， 其特征在于所 述的步骤 2） 中生物反应器为激流灌注式生物反应器、 搅拌式生物反应器或潮汐式生物反应 器。 0010 所述的应用鹅胚传代细胞系和生物反应器培养小鹅瘟病毒的方法， 其特征在于所 述的步骤 2） 中生物反应器的微载体类型为聚酯纤维纸片， 使用前用灭菌 PBS 浸泡过夜。 0011 所述的应用鹅胚传代细胞系和生物反应器培养小鹅瘟病毒的方法， 其特征在于所 述的步骤 2） 中悬浮培养条件为 ： 温度 37 38， pH7.0 7.6， 溶解氧 30% 60%， 接种量 为 3 6109个细胞。 0012 所述的应用鹅胚传代细胞系和生物反应器培养。

14、小鹅瘟病毒的方法， 其特征在于所 述的步骤 2） 中悬浮培养时根据细胞糖耗情况随时补糖或者补加细胞生长液， 确保残糖不低 于 2g/L。 0013 所述的应用鹅胚传代细胞系和生物反应器培养小鹅瘟病毒的方法， 其特征在于所 述的步骤 3） 中培养条件为 ： 温度 37 38， pH7.4 7.6， 溶解氧 30% 50%。 0014 所述的应用鹅胚传代细胞系和生物反应器培养小鹅瘟病毒的方法， 其特征在于所 述的细胞生长液含 90%Ham s F12K 或者 DMEM、 10% 胎牛血清， 其 pH 为 7.0 7.6、 溶解氧为 30% 60%， 含糖 4.0g/L ； 所述的维持液含 97%H。

15、am s F12K 或者 DMEM、 3% 胎牛血清， 其 pH 为 7.4 7.6、 溶解氧为 30% 50%， 含糖 4.0g/L。 0015 本发明中 Ham s F12K 和 DMEM 均为现有产品， 在市场上均能购得。 0016 本发明具有以下有益效果 ： 1. 本发明采用鹅胚细胞系培养法， 避免了胚体培养中大量杂蛋白的影响， 不含因胚体 带来的外源病毒， 也消除了对环境造成的安全隐患。 本发明制备的病毒抗原纯净品质均一、 稳定， 使用安全无污染。 0017 2. 本发明在培养细胞时根据糖耗情况随时补加营养， 确保细胞的密度， 同时提高 病毒的滴度。 0018 3. 本发明采用了先进。

16、的悬浮培养设备与技术 ：（1） 以糖耗为技术指标以及先进 的控制系统 ；（2） 在细胞培养方面增加了细胞密度 ；（3） 在培养病毒时提高了病毒滴度 ； （4） 可使后续制备的疫苗效价大大提高， 同时降低了疫苗的副反应。 （5） 采用了连续、 完全 封闭的细胞与病毒培养方式， 完善了生产过程中的可控性， 确保病毒悬液的稳定性。 说 明 书 CN 103320393 A 4 3/4 页 5 附图说明 0019 图 1 为本发明的工艺流程图。 具体实施方式 0020 为了使本发明更加容易理解， 下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。应理解， 这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围， 下。

17、列实施例中未提及的具体实 验方法， 通常按常规实验方法进行。 0021 实施例 1 用鹅胚传代细胞系在 AP20C 型激流灌注式反应器上培养繁殖小鹅瘟病 毒， 包括如下步骤 ： （1） 生物反应器的选择 ： 激流式反应器 AP-20C 型， 体积为 10L。 0022 （2） 细胞的选择 ： 鹅胚传代细胞系 CGBQ， 适合小鹅瘟病毒生长的传代细胞系， 无致 癌性， 购于美国菌种保藏中心。 0023 （3） 病毒毒株的选择 ： 选用小鹅瘟病毒 SHM 319 株， 微生物保藏号 ： ATCC VR-696， 保藏于美国菌种保藏中心， 可在美国菌种保藏中心购得。 0024 （4） 种细胞的培养 。

18、： 利用 T175 方瓶中的细胞生长液繁殖 CGBQ 细胞， 一般按 1:3 1:5 传代， 待细胞长满单层后消化、 计数， 将细胞悬液接种至转管中， 每管接种细胞约 3107 个细胞， 置微型反应器中进行培养， 反应器温度设置为 37， 转速设置为 42rpm。 0025 （5） 繁殖病毒用细胞的悬浮培养 ： 首先准备生物反应器 ： 检漏激流袋和灌注袋 ； 采 用灭菌PBS浸泡微载体过夜 ； 校正温度电极、 pH电极和溶氧电极并进行高压灭菌 ； 组装生物 反应器， 注入细胞生产液， 循环 24 小时进行系统的无菌检验。验证合格后， 将步骤 （3） 中培 养好的种子细胞消化、 计数， 无菌条件。

19、下按36109个细胞接种至灌注袋中， 在温度37 38下， 以 40rpm、 60rpm、 90rpm、 120rpm 各循环 30min， 使细胞贴壁， 然后开始 150rpm 循环。 培养过程中适时测定糖耗， 当残糖量至 2g/L 时， 进行补糖或补加培养液。 0026 （6） 所述步骤 （4） 和步骤 （5） 细胞生长液含 90% Ham s F12K、 10% 胎牛血清， 细胞 生长液的 pH 为 7.0 7.6， DO 为 30% 60%， 含糖约 4.0g/L。 0027 （7） 病毒的培养与收获 ： 当细胞培养46天， 当糖耗达到最大时， 将小鹅瘟病毒悬 液按 0.01 1.0M。

20、OI 的接种量接种于激流灌注式生物反应器中， 换用维持液进行培养。接 毒后实时监测糖耗情况， 当糖耗接近 0 时， 即开始收获病毒。收获病毒后， 反复冻融灌注袋 内细胞， 收获全悬病毒液。 0028 （8） 所述步骤 （7） 中的细胞维持液含 97% Ham s F12K、 3% 胎牛血清， 维持液的 pH 为 7.4 7.6， DO 为 30% 50%， 含糖约 4.0g/L。 0029 （9） 全悬病毒液的检测 特异性 ： 将毒种用 Ham s F12K 稀释液稀释为 100TCID50/ml， 与等量抗小鹅瘟特异性血 清混合， 置 37水浴中和 1 小时后， 接种 CGBQ 单层细胞， 。

21、培养观察 96h， 应不产生细胞病变 （CPE） 。 0030 纯净性 ： 按 中华人民共和国兽药典 附录进行检验， 结果无细菌、 霉菌、 支原体、 外 源病毒污染。 0031 病毒含量测定 ： 用 3% 胎牛血清的 Ham s F12K 维持液将病毒的细胞培养物样品 说 明 书 CN 103320393 A 5 4/4 页 6 做 10 倍系列稀释， 取 10-7、 10-8、 10-9三个滴度， 每个滴度接种 96 孔细胞板上生长良好的 CGBQ 细胞单层 8 孔， 每孔 0.1ml。同时设病毒对照和细胞对照孔， 置 37.5、 5%CO2 培养 箱继续培养， 观察 7 日， 记录细胞病变。

22、情况， 根据 Reed-Muench 法计算 TCID50， 病毒含量应 108.0TCID50/0.1ml。 0032 试验表明， 采用鹅胚成纤维传代细胞系通过激流灌注式生物反应器繁殖小鹅瘟病 毒毒价可以提高 10 100 倍。 0033 实施例 2 与转瓶培养的比较 （1） 转瓶细胞培养及病毒繁殖 转瓶细胞培养 ： 在转瓶上培养 CGBQ 细胞， 长满单层后， 细胞数为 5108个 /L。转瓶病 毒繁殖 ： CGBQ 细胞接种 GPV 30h 后， 80% 的细胞出现病变， 病毒滴度为 10-7.0/0.1ml。 0034 （2） 转瓶与反应器培养 CGBQ 繁殖 GPV 对比结果见表 1。 0035 表 1 反应器与转瓶结果对比 通过本发明记载的方法对小鹅瘟病毒CVCC AV240株、 CVCC AV239株、 NEAU0671株或其 它小鹅瘟病毒株进行培养， 最后也能够达到与本发明相同的技术效果。 说 明 书 CN 103320393 A 6 1/1 页 7 图 1 说 明 书 附 图 CN 103320393 A 7 。