双链核酸的电化学变性 本发明涉及对核酸材料的处理方法，以便实现从双链形式向单链形式的全部或部分转变，还涉及用该变性方法扩增或检测核酸的方法。
双链DNA(脱氧核糖核酸)和DNA/RNA(核糖核酸)以及RNA/RNA复合物都处于类似的双螺旋结构，它们都是稳定的分子，因此在体外它们需要在剧烈条件下才能分离核酸的互补双链。常用于链分离的方法需要使用至少60℃，通常100℃的高温、时间约10分钟或更长，或者使用pH11或更高的碱性pH条件。其他方法包括使用螺旋酶(helicase)如大肠杆菌的Rep蛋白(该蛋白以一种未知的方法催化DNA的解旋)，或使用结合蛋白如大肠杆菌噬菌体T4的32-蛋白，该蛋白可稳定DNA的单链形式。用已知的热处理或碱处理方法产生变性单链DNA一般被用于杂交研究或用于扩增循环。
分离是许多种涉及体外对核酸进行操作的方案中的先决条件。这些方案中的一个例子是产生多拷贝靶DNA序列的反应，其中使用热稳定的聚合酶(美国专利No.4683202，K.B.Mullis等人)。这种称为聚合酶链反应(PCR)方法的开发具有十分重要的商业价值，其中链分离一般通过将样品加热至约95℃而实现。不必加热样品可以提供多种好处。例如可以设计紧凑而易控制的设备，以及使用差错率更低地嗜常温酶。
WO92/04470公开了一种使用电场而分离核酸链的方法。用电学方法的优点在专利中被详细阐述，此外还论述了该方法在PCR或连接酶链反应(LCR)等扩增反应中的应用。描述了用于进行反应的电化学槽的形式，还描述了用于提高变性效率的“促进剂”化合物。
在WO92/04470之前，许多其他工作者已经描述过DNA在电化学槽中的变性情况。但是，在任何一种情况下都不能在溶液中获得数量够用的游离单链产物。相反，DNA似乎不可逆地与电极表面结合，在这种情况下便不能进一步参与PCR等反应过程了。在WO92/04470中描述的电变性方法中，单链在溶液中累积起来，随后进行的PCR证实了它们的用途和完整性。
在WO92/04470中，DNA的电变性进行是采用含有光滑的碳质中央杆的电极，它被套在特氟隆筒中，只露出其末端。工作电极具有与特氟隆筒相对放置的铂筛网。使用甘汞参照电极，甘汞电极位于用毛细管与主槽相连的侧腔中(参见Stanley C.J.et al.，J.Immunol.Meth.[1988]，112，153-161)。用该设备时，最快速的变性可在15分钟实现，此时工作电极的电势相对参照电极为-1V。在反应中存在的氯化钠会减缓变性。
在WO92/04470中，进行了PCR反应，它是用所述的电化学槽进行的重复变性操作，中间插有扩增阶段。变性阶段中每一次都进行5分钟或更长时间，因此PCR反应的总时间便非常长。此外，在WO92/04470中进行PCR反应的条件与常规PCR方法的条件有所不同，因此发现不可能使用常规的PCR缓冲液体系。为了获得变性，必须在比缓冲液体系维持的离子强度低得多的离子强度下进行该过程。除去了促进剂甲基紫精，那么反应基本上是在蒸馏水中进行的。
现在发现，可以比WO92/04470中公开的方法快得多地进行电化学变性，而且也可比在该文献中公开的方法快得多地进行扩增。
尽管在WO92/04470中没有明确说明两个工作电极之间的距离，但是事实上距离为几个毫米。
因此，本发明提供了一种使双链核酸变性的方法，它包括，在能使溶液中至少一部分核酸被转变成完全或部分单链形式的条件下，使含有核酸的溶液经受电极间施加的电压，其中溶液中该电极相距为1.5毫米之内。较佳地，电极更接近，例如两者相距为1毫米之内，更佳为0.5毫米之内。理想地，电极被调节到尽可能近，同时又保证它们没有相互接触而发生短路。
优选地，在电极之间施加0.5-3伏的电势差。大于3伏特的电势差似乎会抑制变性，尽管目前还不清楚其机制。
较佳地，该方法地在1.5-2.5伏特的电压(电极间的电势差)下进行。
较佳地，在电极处于最为靠近的情况下，电极中一个或两个是点状的。这种电极可以有一个点或多个点。在施加的理想电压和电极的形状之间似乎存在某种相关性，可能是在电极点处有一个优选的或理想的电场梯度，该梯度可通过调节电压而与电极部分的尖锐程度相适应，从而发生变性反应。任选地，人们可使用电流恒定的电源而不是调节电压来进行变性反应，这可以用于补偿在不同变性操作中电极的几何形状的不同。
使用恒定电流方案时，一般优选的电流为80-160μA，如约100-125μA。
如在WO92/04470中所述，人们可使用促进剂化合物如甲基紫精以便更快地变性。其他促进剂在WO93/15224中有所描述，如多价阳离子如镁。其他有效的、可使用的多价阳离子包括镧(La3+)。用作促进剂的阳离子包括与无机或有机配基复合的无机阳离子如Pt(NH3)64+和Cr(NH3)62+。
促进剂可以是任何增加双螺旋物变性程度率的无机或有机分子。促进剂应溶解于选定的反应介质中。较佳地，它不影响或干扰DNA或其他存在于溶液中的物质如酶或寡核苷酸探针。或者，促进剂也可固定于或包含于制造电极的材料中。
促进剂可以是水溶性二吡啶基系列化合物，尤其是紫精(viologen)如甲基紫精或其盐。尽管这些促进剂的作用机制目前还不能清楚地了解，但是据信带正电荷的紫精分子会在带负电荷的核酸如DNA和带负电荷的电极之间发挥作用，减小其间的静电排斥，从而促进DNA接近电极表面，而在电极表面电场最强。因此，我们优选使用具有间隔的正电荷中心的促进剂化合物，例如两极带正电荷的化合物。较佳地，正电荷中心的间隔距离与紫精中的类似。其他合适的紫精包括乙基紫精、异丙基紫精和苄基紫精。
任选地，本发明方法也可用WO92/04470中描述的三电极系统进行，但是根据本发明使用的溶液体积最好很小如1毫升或更小，较佳为非常小如100微升或更小如约25-40微升。当使用的反应体积非常小时，使用三电极系统一般是不合适的。
本发明方法可在室温下进行，如果需要也可在低于核酸预解链(pre-melt-ing)温度下进行。该方法可以在pH3-10下进行，在pH约7下进行很方便。一般，在较低的pH下，变性进行得更快速。因此出于某些目的，稍低于中性的pH值如约pH5.5是优选的。核酸可溶解在含有缓冲物质的水溶液中，缓冲物质的性质和离子强度应不干扰链分离过程。
较佳地，溶液含有浓度至少为10mM，如约25mM的缓冲剂。任选地，溶液还可进一步含有盐如氯化镁和氯化钠。较佳地，反应是在PCR或LCR中所用的缓冲液中进行。
较佳地，溶液的离子强度大于约20mM，如25-50mM。
本发明的变性方法可作为多种复杂程序如分析和/或扩增核酸的程序中一个步骤。在下面描述了这些程序中某些例子。
我们发现，通过上述的出色的槽设计，可以比WO92/04470中所述方法更快地实现变性，甚至在存在诸如PCR缓冲液之类的物质(这些物质在WO92/04470所述的设备中会阻止变性或过分长地延长变性时间)下也可变性。通过缩短时间，目前便可在3分钟内如1-2分钟或更短时间内结束变性过程。
这样便可以进行重复地使双链核酸变性的过程，在该过程中核酸是用上面描述的方法变性，在该方法中电压以持续时间2分钟之内，较佳仅1分钟之内的一系列重复脉冲形式施加。在脉冲之间，可以关闭电压或者反向施加电压一段时间(时间最好与施加电压的时间相同)。也可采用比上述脉冲频率更高的脉冲，例如1-100赫兹的脉冲。根据进行变性反应的目的，有可能不必在每个变性循环中都使大量的双链核酸转变成单链形式。有时仅仅用电化学方法引发变性便已足够。例如在扩增程序中，如果已有足量的变性供引物结合，那么可依靠核酸酶进行引物延伸，从而在剩余的核酸长度范围中置换掉原始核酸中未结合引物的相对应的结合链。
利用目前变性速度提高的好处，本发明提供了一种扩增核酸靶序列的方法，它包括对核酸的杂交、扩增和变性，其中该变性过程的进行是通过：在能使溶液中至少一部分核酸被转变成完全或部分单链形式的条件下，使含有核酸的溶液经受电极间施加的电压，时间为2分钟之内。较佳地，用于该方法的电极形状如上所述。较佳地，施加的电压是持续时间为2分钟之内，更佳为更短的如1分钟之内或短得多如1-100赫兹的重复脉冲。
较佳地，扩增程序是PCR或LCR。
因此，本发明包括一种复制核酸的方法，它包括：在由电极施加于溶液的电压影响下，分开溶液中样品双链核酸的各链；使分开的核酸链与至少一种寡核苷酸引物杂交结合，该引物可与变性核酸的至少一条链杂交；合成该引物或各引物的延伸产物，延伸产物与核酸的各链具有足够的互补性从而可与其杂交；和将该延伸产物或各延伸产物与刚才发生杂交获得延伸产物的核酸链分开。
在这种由聚合酶介导的复制程序例如聚合酶链反应程序中，没有必要在所有情况下都变性到产生完全单链的核酸分子。产生局部的和/或暂时的双螺旋的弱化或分开并足以使引物结合于其靶序列便已足够。一旦引物位于目标链的一条链上，那么在引物区域目标链的重新杂交便被防止，而其他目标链将因为引物的延伸或进一步的暂时性弱化或分开过程而被逐步置换。
较佳地，该扩增过程还包括循环式地重复上述程序，可重复10个循环以上，如20或30个循环。在扩增过程中，杂交步骤优选用两种引物进行，这两种引物互补于核酸的不同链。
为了获得延伸产物而进行的变性以及对靶核酸的最初变性最好是通过用电极对核酸溶液施加电压而进行。
该方法可以是用于扩增核酸或核酸混合物中含有的至少一个特异性核酸序列的标准的或经典的PCR方法，其中各核酸由等长的或不等长的两个独立的互补链构成，该方法包括：(a)对每个不同的特异性序列，用两种寡核苷酸引物处理链，所处的条件是对扩增的各特异性序列，可合成各引物的与各核酸链互补的延伸产物，其中选择的这些引物与各特异性序列基本互补从而使得用一个引物合成的延伸产物与其互补链分开后，可作为合成另一个引物延伸产物的模板；(b)通过用电极向反应混合物施加电压，将引物延伸产物与合成这些延伸产物所在的模板分开，产生单链分子；和(c)在可合成引物延伸产物的条件下，用步骤(a)引物处理步骤(b)产生的单链分子，其中用步骤(b)中产生的各单链作为模板。
或者，该方法也可是经典的或标准PCR方法的任何变换形式，例如所谓的“反向”PCR方法或“锚式”PCR方法。
因此，本发明包括如上所述的扩增方法，其中引物与环状核酸杂交，并延伸形成双链，该双链用本发明的变性方法进行变性，扩增方法可任选地重复一个或多个循环。
本发明方法可用于连接酶链反应。因此，本发明包括一种扩增靶核酸的方法，它包括步骤：(a)提供作为单链核酸形式的核酸样品；(b)对样品提供至少4种核酸探针，其中：
i)第一和第二探针是主探针，第三和第四探针是次核酸探针；
ii)第一探针是能与靶核酸主链的第一片段杂交的单链；
iii)第二探针是能与靶核酸主链的第二片段杂交的单链；
iv)靶核酸主链的第一片段的5′端相对于靶核酸主链的第二片段的3′端，从而能够在这些探针与该靶核酸主链杂交时，将第一探针的3′端与第二探针的5′连接起来，
v)第三探针能与第一探针杂交；
iv)第四探针能与第二探针杂交；和
(c)重复或连续地进行：
i)使这些探针与该样品中的核酸杂交；
ii)连接杂交的探针，形成重新排列的融合的探针序列；
iii)通过用所述的电极向反应混合物施加电压，使该样品中的DNA变性。
电化学DNA扩增技术可用于分析检测非常少的DNA样品，例如在动物细胞或单个细菌细胞中的单拷贝基因。
进行该方法的温度可以加以选择以适应所用的酶。因此，使用Taq酶作为聚合酶时，优选55-68℃的温度。如果使用Klenow聚合酶，那么室温是合适的。采用已知的蛋白质稳定技术以避免对聚合酶的电损伤是有利的，在使用嗜常温的聚合酶时尤其如此。
本发明包括一种检测在样品中是否存在预定的核酸序列的方法，它包括：用间隔距离如上所述的电极对溶液中样品施加电压，从而使样品双链核酸变性；将变性核酸与针对预定序列的寡核苷酸探针杂交；以及检测是否发生了这种杂交。
因此，本发明方法可用于需要确定某个特异性基因序列的DNA和RNA杂交，其中例如该序列对某特定有机体是特异的，或者对某特定的遗传疾病是特异的，镰型细胞贫血症便是一个例子。为了检测特定序列，首先需要准备处于天然双链形式下的DNA样品，最好是纯化的DNA。准备的方法是已知的。与具有互补于DNA样品序列的标记核苷酸进行杂交步骤之前，有必要将双链DNA转变成单链形式。本发明的变性方法可用于这种目的，一种优选方式是实施下列步骤：—用所述电极施加电压，从而使样品DNA变性，同时可任选地将促进剂加入溶液或结合于电极或作为电极结构的一部分；—用直接或间接标记的、互补于目标序列的寡核苷酸探针与变性DNA杂交；和—确定是否发生了杂交。其中可通过检测探针的存在与否而得以确定，探针可以是放射性标记的、荧光标记的、化学发光标记的或酶标记的，或者是间接标记的探针，例如携带生物素的探针，而随后可用标记的抗生物素蛋白或抗生物素蛋白类型的分子与生物素结合。
在典型的DNA探针分析中，习惯将样品DNA固定于中性或带电的尼龙或硝酸纤维素构成的膜表面。固定是通过电荷相互作用或者通过在烤炉中烘烤含有DNA的膜而完成。样品DNA被加热至高温以保证在结合于膜之前已转变成单链形式，或者用碱处理膜以保证转变成单链形式。这些方法的缺点是：—加热至高温以产生单链DNA会损伤样品DNA。—用碱处理的话，在用标记探针进行杂交之前需要额外的中和步骤。
一种改进的实施DNA探针杂交分析的方法是所谓的“夹心式”技术，其中特异性的寡核苷酸被固定在某个表面。在上面具有特异性寡核苷酸的表面接着与含有单链形式靶DNA的溶液杂交，随后再加入第二种标记的、也能与靶DNA杂交的寡核苷酸。然后洗涤表面去除未结合的标记寡核苷酸，随后检测在表面上与靶DNA结合的标记物。
使用本发明的将双链DNA变性成所需的单链DNA的变性方法，可简化这种程序。工作电极、反电极和任选的参照电极和/或促进剂都被装在进行DNA探针分析的测试表面或孔中，然后加入DNA样品和寡核苷酸探针，施加电压使DNA变性。形成的单链DNA与固定在表面上的特异性寡核苷酸杂交，随后进行夹心式分析的剩余步骤。所有的上述步骤都可以在不需要常规方法中高温或加入碱性试剂的情况下进行。
本发明包括一种用于使核酸变性的电化学槽，它包括一个具有导电内表面的孔作为第一电极，和第二电极，第二电极插入该孔并十分靠近孔底部。较佳地，该孔位于构成第二电极的导电材料体中。孔和第二电极都具有导电碳材料如石墨。
本发明还包括一种用于核酸分析或扩增的试剂盒，它包括这种电化学槽和至少一种用于变性的核酸、寡核酸、一种或多种核苷酸、聚合酶、连接酶和/或缓冲液。
下面结合附图进一步描述和阐述本发明，附图是用于本发明的槽的剖面图。
所述的槽包括一石墨块10，在其上表面有一个直径4毫米的孔12，构成第一电极。第二电极是直径2毫米的石墨棒14，它具有尖端部分16。将第二电极通过塑料材料的绝缘衬18而压入孔中。向下调节该棒直至形成短路，然后尽可能小地稍稍向后提升以断开电路。该槽的液体体积为约25微升。向该装置施加直流电，其中相对该棒而言孔为正极，电压优选为1.6-2.4伏特。
尽管图1所示的棒状电极是平末端的，它在平末端与尖端的细圆锥表面之间有尖锐的边缘。另一种可供选择的形状是将棒削成点状。这可以用常规的削铅笔刀实现。得到的电极还可进一步用刀片或磨具进行打磨。使用点状电极，孔的液体容量可增加至40微升。
根据本发明的多种方法可在含有多个样品接受孔的设备中同时进行，每个孔都配有各自的电极对，各电极对中一个电极可任选地是孔本身。在这种设备的一个优选形式中，含有孔的底块具有一个可开启的盖，在盖上有用于插入孔中的电极。每个孔都在盖上有一对电极，电极的构型可各不相同，例如平行的棒、平行的板(可任选地由筛网构成)或同轴的空心圆柱体(同样，可任选地由筛网构成)。或者，在各个孔的盖上也可仅有一个电极，而含有孔的底块是导电的并作为共同的第二电极。含有孔的底块也可对各孔配有各自的电极。
盖子包括一个平板部分用于安装各孔的电极，以及分开的背部以安装电路连接和电气回路(装配两部分时，用于连接电极)。用于装置的单一电源可用该电气回路分开并且以可控方式向电极供电，使得每个电极都是可控的，例如电压恒定或电流恒定。携带电极的平板部分在不必替换控制电气回路情况下是可拆换的，也可以是一次性的。平板部分和背面部分可以在装配时按针与插孔的相对位置而互相对齐，也可与含有孔的底块对齐。底块也可以是一次性的。
下列实施例阐述了上述设备的用途和本发明方法，并与WO92/04470中所述的技术作了比较。实施例1
在图1所示的槽中进行DNA变性，不同点在于使用点状电极14，电压恒定为2.4伏特。对40微升小牛胸腺DNA(12微克/毫升)的1mM甲基紫精溶液的变性在1-2分钟内完成。对比实施例1
在WO92/04470中所述的三电极电系统中，DNA变性在工作电极对甘汞参照电极呈-1V的情况下进行(约2.4伏特)。对1毫升小牛胸腺DNA(4微克/毫升)的1mM甲基紫精溶液的变性在约25分钟内完成。实施例2
在图1所示的槽，电极间电压恒定为2.4伏特，进行小牛胸腺DNA的变性。不同点在于使用点状电极14。对40微升DNA(20微克/毫升)在25mM磷酸钾，pH6.0，1mM甲基紫精溶液的变性在1-2分钟内完成。对比实施例2
在WO92/04470中所述的三电极电系统中，DNA变性在工作电极对甘汞参照电极呈-1V的情况下进行(约2.4伏特)。对1毫升小牛胸腺DNA(4微克/毫升)在25mM Tris、pH7.5，1mM甲基紫精溶液的变性需要180分钟以上。
尽管上面本发明是用实施例所阐述的优选例子进行描述的，但是在本发明范围之内可以进行各种修改和变动。