一种含有COQ10的植物油体.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103320457 A (43)申请公布日 2013.09.25 CN 103320457 A *CN103320457A* (21)申请号 201310212261.5 (22)申请日 2013.05.31 C12N 15/62(2006.01) C07K 19/00(2006.01) C12N 15/82(2006.01) C12N 5/04(2006.01) (71)申请人 吉林农业大学 地址 130118 吉林省长春市净月开发区新城 大街 2888 号 (72)发明人 杨晶 李校堃 李海燕 王文慧 王沥浩 郭咏昕 官丽莉 王艳芳 (74)专利代理机构 长春市东。

2、师专利事务所 22202 代理人 张铁生 (54) 发明名称 一种含有 CoQ10 的植物油体 (57) 摘要 本发明公开了含油体蛋白与 CoQ10 融合蛋白 的油体。本发明人根据植物偏好性改造了 CoQ10 基因， 利用重组 DNA 技术将拟南芥油体蛋白与 CoQ10蛋白基因融合， 插入以pCAMBIA1301载体为 基本骨架改造的植物特异表达载体 pOBT 中， 拟南 芥油体蛋白与 CoQ10 蛋白融合基因表达质粒表达 载体 pOBT-CoQ10， 转化至油料作物中， 表达了融 合蛋白， 获得了含油体蛋白与 CoQ10 融合蛋白的 油体， 操作简单、 成本低廉、 表达量高， 可直接用于 医。

3、药领域和日化领域广泛应用。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 序列表 4 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书6页 序列表4页 附图3页 (10)申请公布号 CN 103320457 A CN 103320457 A *CN103320457A* 1/1 页 2 1. 一种融合蛋白基因， 它是由拟南芥油体蛋白与重组 CoQ10 基因融合而成， 其碱基序 列如序列表 SEQ ID NO.5 所示。 2. 一种融合蛋白， 它是由其碱基序列如序列表 SEQ ID NO.5 所示的基因表达的蛋白。 3. 一种表达。

4、载体 pOBT CoQ10， 它是由下述方法制备的 ： 1） 以 p1301 为基本骨架， 利用 kpnI 和 SpeI 酶切位点 , 将 35S-Bar 基因， T-DNA 区 NOS 基因前， 获得 p1301-35S-Bar-NOS 基本质粒， 简称 ： pO ； 2） 用 pstI 和 NcoI 分别酶切并连接 pO 质粒和序列表 SEQ ID NO.2 所示基因， 得中间载 体 pOB ； 3） 用 Hind 和 kpnI 分别酶切并连接中间载体 pOB 和序列表 SEQ ID NO.3 所示基因， 得植物特异表达载体 pOBT ； 4） 用 NcoI 与 Hind 分别酶切并连接植。

5、物特异表达载体 pOBT 和序列表 SEQ ID NO.5 所示基因， 得表达载体 pOBT CoQ10。 4. 含油体蛋白与 CoQ10 融合蛋白的油体， 它是由下述方法制备的 ： 将其碱基序列如序 列表 SEQ ID NO.5 所示的基因插入植物表达载体中， 获得的表达质粒， 转化至油料作物中， 收获种子提取油体。 5. 根据权利要求 4 所述的含油体蛋白与 CoQ10 融合蛋白的油体， 其特征在于 ： 所述的 表达质粒是权利要求 3 所述的一种表达载体 pOBT CoQ10。 权 利 要 求 书 CN 103320457 A 2 1/6 页 3 一种含有 CoQ10 的植物油体 技术领域。

6、 0001 本发明属于基因工程领域， 具体涉及一种拟南芥油体蛋白与辅酶 Q10 的融合基因 及其表达的融合蛋白以及含有该融合蛋白的油体。 背景技术 0002 辅酶 Q10（coenzyme Q， CoQ10） 又称泛醌 （ubiquinone， UQ， Q） 。CoQ10 在呼吸链中 是一种和蛋白质结合不紧密的辅酶， 是生物体内广泛存在的脂溶性醌类化合物， 在人体呼 吸链中质子移位及电子传递中起重要作用， 可作为细胞代谢和细胞呼吸激活剂， 还是重要 的抗氧化剂和非特异性免疫增强剂， 能抑制线粒体的过氧化， 具有促进氧化磷酸化反应， 保 护生物膜结构完整性， 对免疫有非特异性的增强作用， 增加抗。

7、体产生， 改善 T 细胞功能。 0003 CoQ10 在很多方面都有广泛的应用， 首先 CoQ10 在医药领域方面的应用包括 1、 CoQ10 在口腔疾病方面的应用 ； 2、 CoQ10 在心血管类疾病方面的应用 ； 3、 CoQ10 在艾滋病方 面的应用 ； 4、 CoQ10在糖尿病方面的研究 ； 5、 其他方面的应用。 近年添加CoQ10的保健食品、 精华素、 乳液及粉底等护肤化妆品迅速走俏市场,作为一种重要的生命营养物质,CoQ10具 有重要功效。1、 CoQ10 具有保护皮肤的功效 ； CoQ10 渗透进入皮肤生长层可以减弱光子的 氧化反应， 在生育醇的协助下可以启动特异性的磷酸化酪氨。

8、酸激酶， 防止 DNA 的氧化损伤， 抑制紫外光照射下人皮肤成纤维母细胞 CoQ10 酶的表达， 保护皮肤免于损伤。2、 辅酶 Q10 在洗化用品中的应用 ； 辅酶 Q10 作为一种天然抗氧化剂， 可用于清除氧自由基， 延缓皮 肤衰老， 能有效地深入皮肤， 激发细胞活性， 改善肤质 ； 具有促进皮肤新陈代谢， 修复皮肤 皱纹等方面的功效， 可根据化妆品不同功能的需求， 调制出各种不同的产品。3、 辅酶 Q10 在 口腔护理用品领域的应用 ； 辅酶 Q10 能改善微循环， 促进组织微循环系统代谢， 增强组织 细胞活力， 加速细胞更新， 利于细胞组织护养、 修复 ； 具有强大的的抗氧化能力， 预防。

9、牙组织 细胞的水肿、 膜破裂及死亡， 增强牙龈保护能力， 预防 D 半乳糖所致牙组织衰老退行性 病变。 0004 由于辅酶 Q10 在医药、 食品添加剂等领域上有极大的使用价值， 因而这一产品的 研究及开发引起越来越多人的关注。在工艺方面， 近几年来， 辅酶 Q10 的新产品在欧美及日 本等发达国家市场上走红 , 中国企业也逐渐掌握了生物提取法、 半化学合成法以及微生物 发酵提取法等先进技术， 因此， 在中国加快开发生产这种市场前景极好的产品已成为当务 之急。 0005 利用植物生物反应器生产药用蛋白， 近年来越来越受到人们的关注， 油体蛋白是 油体中主要的膜蛋白。 油体蛋白是碱性的疏水蛋白，。

10、 三个部分组成油体蛋白 ： 亲脂的C端和 N 端 ， 和中间疏水区域， 它是通过磷脂膜进入到油体内部。N 端和 C 端则镶嵌在油体表面， 暴露在细胞质中。油体蛋白具有表面活性剂， 使其不能与油体结合。油体的这种非结合性 非常适合用作乳化剂。乳化剂能降低互不相溶的液体间的界面张力， 使之成为乳浊液。油 体乳化剂是从天然油料种子中提取出来的， 油体蛋白的结构以及它的特异性， 使油体在生 物技术中得到广泛的应用， 例如它可以作为乳化剂， 携带和固定重组蛋白等等。它还可以 说 明 书 CN 103320457 A 3 2/6 页 4 应用于纯化、 重折叠和固定重组蛋白， 在油体表面， 目的蛋白与油体蛋。

11、白通常通过两种方式 结合， 分别是与油体蛋白融合在油体中表达和通过配体作为亲和标签与油体蛋白连接。本 发明是根据植物油体特性， 使辅酶 Q10 基因连接在油体蛋白基因的 N 端或 C 端， 构建融合 基因， 使目的蛋白在植物油体中特异性表达， 利用油体亲脂疏水的特性， 将种子粉碎后， 经 不同提取液抽提， 回收油相， 既可将融合蛋白与细胞内的其他组份分开， 简化了分离纯化步 骤， 降低了纯化成本与生产成本。 发明内容 0006 本发明的目的是提供一种拟南芥油体蛋白与辅酶 Q10 的融合基因及其表达的蛋 白。 0007 一种融合蛋白基因， 它是由拟南芥油体蛋白与辅酶 Q10 基因融合而成， 其碱。

12、基序 列如序列表 SEQ ID NO.5 所示 ； 一种融合蛋白， 它是由上述基因表达的蛋白 ； 一种表达载体 pOBTCoQ10， 它是由下述方法制备的 ： 1） 以 p1301 为基本骨架， 利用 kpnI 和 SpeI 酶切位点 , 将 35S-Bar 基因插入 T-DNA 区 NOS 基因前， 获得 p1301-35S-Bar-NOS 基本质粒， 简称 ： pO ； 2） 用 pstI 和 NcoI 分别酶切并连接 pO 质粒和序列表 SEQ ID NO.2 所示基因， 得中间载 体 pOB ； 3） 用 Hind 和 kpnI 分别酶切并连接中间载体 pOB 和序列表 SEQ ID 。

13、NO.3 所示基因， 得植物特异表达载体 pOBT ； 4） 用 NcoI 与 Hind 分别酶切并连接植物特异表达载体 pOBT 和序列表 SEQ ID NO.5 所示基因， 得表达载体 pOBTCoQ10。 0008 本发明的另一个目的是提供一种含有 CoQ10 的植物油体。 0009 一种含有 CoQ10 的植物油体， 它是由下述方法制备的 ： 将其碱基序列如序列表 SEQ ID NO.5 所示的基因插入植物表达载体中， 获得的表达质粒， 转化至油料作物中， 收获种子 提取油体 ； 所述的表达质粒是一种表达载体 pOBTCoQ10。 0010 本发明提供了含油体蛋白与 CoQ10 融合蛋。

14、白的油体。本发明人根据植物偏好性改 造了 CoQ10 基因， 利用重组 DNA 技术将拟南芥油体蛋白与 CoQ10 蛋白基因融合， 插入以质粒 为基本骨架改造的植物特异表达载体 pOBT， 拟南芥油体蛋白与 CoQ10 蛋白融合基因表达质 粒表达载体 pOBT-CoQ10， 转化至油料作物中， 表达了融合蛋白， 获得了含油体蛋白与 CoQ10 融合蛋白的油体， 使CoQ10在植物油体中特异性表达并储存在植物油体中。 CoQ10在植物种 子中大量积累， 最终获得较高的表达水平， 以期达到 CoQ10 的大量、 廉价生产， 可直接应于 医药领域和日化领域。油体蛋白与 CoQ10 的融合表达产物可直。

15、接作为活性成分用于相应产 品的生产， 简化了以往 CoQ10 与乳化剂 （或保护剂） 混合的加工工艺， 降低了生产成本。 0011 本方法生产 CoQ10 的方法具有操作简单、 成本低廉、 表达量高等特点 ； 在纯化阶 段， 由于油体蛋白与CoQ10相偶联表达， 所以通过不同浓度梯度离心的方法可以出去95%以 上的杂蛋白， 净化融合蛋白。 说 明 书 CN 103320457 A 4 3/6 页 5 附图说明 0012 图 1 菜豆启动子的核酸电泳图 ； 图 2 菜豆终止子的核酸电泳图 ； 图 3 植物油体表达载体构建 pOBT 示意图 ； 图 4 含有 CoQ10 基因的植物油体表达载体 p。

16、OBT-CoQ10 示意图 ； 图 5 CoQ10 的 SDS-PAGE 检测图 ； 图 6 CoQ10 的 Western blot 检测图。 具体实施方式 0013 实施例 1 ： 辅酶 Q10（CoQ10） 基因的合成 首先根据植物偏好性密码子对从 GENBANK 中找到的人源辅酶 Q10 的核苷酸序列进行 改造， 将植物中含量较少的稀有氨基酸密码子替换成植物偏好的密码子。根据密码子的简 并性消除在本实验中所用到的酶切位点， 送去上海生工生物工程有限公司进行人工合成 CoQ10（SEQ ID NO.1） 。 0014 实施例 2 ： 克隆菜豆种子特异启动子与终止子 为了从菜豆基因组序列中。

17、克隆种子特异启动子与终止子， 利用引物， 采用标准的多聚 酶链式反应 （PCR） ， 从菜豆基因组 DNA 中扩增得到 1548bp 和 1220bp 的 DNA 片段 （如图 1 和 图2） ， 扩增的片段经限制性内切酶消化， 克隆到pUC57克隆载体中， 保存备用。 经测序， 其碱 基序列如序列表 SEQ ID NO.2 和 3 所示。 0015 菜豆启动子引物 Primer5F: GAATTCATTGTACTCCCAG Primer5R ： AGTAGAGTAGTATTGAATATGAG 菜豆终止子引物 tem5F: AATAAGTATGAACTAAAATGC tem5R: TTAGTT。

18、GGTAGGGTGCTAGGAA 实施例 3 ： 构建植物特异表达载体 pOBT 将 pUC57- 菜豆启动子的克隆载体用限制性内切酶 pstI 和 NcoI 消化， 回收目的片段菜 豆启动子序列， 同时用 pstI 和 NcoI 消化基本质粒 pO （以 p1301 为基本骨架， 将其 T-DNA 区 进行改造， 除了保留有 T-DNA 区的 NOS 基因外其余基因均被 35S 和 Bar 基因替换， 以 pEGAD 质粒为模板， 利用 35S-F 上游引物 47bp cggggtaccAtccgtcaacatggtggagcacgacacgcttgtc tact和Bar-R下游引物54bp。

19、 cggaattcactagttcagatctcggtgacgggcaggaccggacggggcggaa cc 进行 PCR， 扩增得到 35S-Bar 基因， 利用 kpnI 和 SpeI 酶切位点将其插入到 pCAMBIA1301 载体 T-DNA 区的 NOS 基因前， 构建了 p1301-35S-Bar-NOS 基本质粒， 简写为 pO 质粒， ） ， 将菜 豆启动子 （用来启动油体蛋白与辅酶 Q10 的融合基因） 与基本质粒 pO 连接， 转化大肠杆菌， 获得 pOB 中间载体 ； 将 pUC57- 终止子的克隆载体用 HindIII 和 kpnI 消化， 回收目的片段菜 豆终止子。

20、， 同时用这两个酶消化 pOB 中间载体， 将终止子与酶切后的 pOB 载体连接， 转化大 肠杆菌， 获得植物特异表达载体 pOBT（见图 3） 。 0016 实施例 4 ： 拟南芥油体蛋白基因的克隆 取拟南芥种子， 提取 DNA 基因组， 用引物 ： 说 明 书 CN 103320457 A 5 4/6 页 6 1 ： CCATGGCGGATACAGCTAGAGG 2 ： CACCGGGTGGAGTAGTGTGCTGG 进行扩增拟南芥油体蛋白基因， 经测序， 其碱基序列如序列表 SEQ ID NO.4 所示 ； 扩增 的片段经限制性内切酶 （NcoI 酶和 EcoRI 酶） 消化， 克隆到 。

21、pUC57 克隆载体中， 保存备用。 0017 实施例 5 ： 构建含有拟南芥油体蛋白与 CoQ10 融合基因的植物油体特异表达载体 pOBTCoQ10 以克隆得到的拟南芥油体蛋白基因和 CoQ10 基因为模板， 设计融合基因引物， 通过融 合 PCR 技术， 获得 oleosin-CoQ10 融合基因， 经测序， 其碱基序列如序列表 SEQ ID NO.5 所 示。将融合基因用限制性内切酶 NcoI 与 HindIII 进行酶切， 同时用这两个酶对 pOBT 载体 进行酶切， 然后将融合基因与酶切后的pOBT载体连接， 转化大肠杆菌， 产生pOBTCoQ10植物 油体表达载体， 见图 4。 。

22、0018 拟南芥油体蛋白与 CoQ10 融合基因引物 1 ： CCATGGCGGATACAGCTAGAGG 2 ： CACCGGGTGGAGTAGTGTGCTGG 3 ： ATGGCTTGGGCTGGTTCTA 4 ： GGTCTGGTGAACCTCGTGG 实施例 6 ： pOBTCoQ10 质粒转化农杆菌 EHA105 (1) 取 100L 农杆菌 EHA105 感受态细胞置于冰浴中 10min 使其融化备用。 (2) 取 1LpOBTCoQ10 质粒加入到农杆菌感受态细胞中， 用移液枪轻轻吹打， 使其混合均 匀， 冰浴30分钟。 (3)冰浴后立即将其置于液氮中冷冻5min， 立刻取出放入。

23、37热击 5min。 (4) 加 1mL 不含抗性 YEP 液体培养基至离心管中， 28， 180rpm/min 摇菌 4h。 (5) 使用离心机 5000rpm， 离心 5min， 弃上清， 加入 100LYEP 培养基重悬。 0019 (6)将重悬液涂布于含三抗 （100 g/mLRif Str、 50 g/mLKan和50g/mL)的 YEP 固体培养基平板内， 在 28恒温箱内培养 23 天。 0020 利用该方法把 pOBTCoQ10 转化到农杆菌感受态中， 挑取单菌落进行液体震荡培 养， 经行菌液PCR筛选转化子， 经鉴定为阳性的菌液即为含目的基因pOBTCoQ10的农杆菌工 程菌。

24、菌株。用 70% 甘油保种阳性菌株， -80冰箱保存。 0021 实施例 7 ： Flori dip 方法进行的遗传转化 首先， 侵染前一天将野生型拟南芥和亚麻芥植株浇水浇透 ； 将农杆菌工程菌株接种至 50ml含有三抗 （100 g/ml Rif、 50 g/ml Str和50 g/ml Kan)的YEP液体培养基中， 进行预培养 （180rpm/min， 28） ； 取预培养的农杆菌 7ml 加入到含有三抗的 YEP 液体培养 基中， 进行扩大培养， 直至 OD5900=1.01.2 ； 把农杆菌菌液移到离心管中， 20， 4000rpm 离 心 20min， 收集菌体， 去除三抗培养基。。

25、用 Floral-Dip Buffer 重悬菌体， 使其 OD590 达到 0.80.9。转化前剪掉种荚、 开花和露白的花芽。在钵体四周插上适当高度的竹签， 以便支 撑倒过来进行侵染的钵体。将拟南芥的茎部和叶片基部浸入重悬的农杆菌菌液中， 静置 7 分钟， 然后吸弃过多的菌液。平放转化后的钵体， 用塑料薄膜等保湿过夜， 第二天可稍露一 小缝， 第三天正常放置。一周后可进行第二次侵染。待种子成熟后， 可隔天采摘发黄成熟的 荚， 收获种子。 0022 实施例 8 ： 农杆菌介导的遗传转化 说 明 书 CN 103320457 A 6 5/6 页 7 取 1g pOBTCoQ10 质粒 DNA 加入。

26、到 100 微升 EHA105 感受态细胞中， 轻轻混匀冰浴放 置5min ； 然后置于液氮中冷冻5min后迅速转至37水浴中温育5min， 加入1mlLB液体培养 基， 在 28摇床上 180rpm 振荡培养 4h， 取适量菌液涂布到含有链霉素和卡那霉素的 LB 固 体培养上， 置 28培养 24h， 经抗性筛选、 PCR 检测阳性单菌落。 0023 从平板上挑取含有 pOBTCoQ10 质粒的农杆菌单菌落， 接种到 5mlLB 液体培养 基中， 振荡培养过夜， 取 100 微升菌液接种到 50mlLB 液体培养基中， 28， 180rpm 振荡培养 至 OD600 为 0.8， 然后离心重。

27、悬， 悬浮液 OD=0.6 即可。 0024 将红花、 油菜、 大豆、 花生等植物子叶节在重悬液中侵染 10min， 放在含有合适激素 的培养基上培养， 然后转到含有0.5%basta和250mg/L头孢霉素的筛选培养基上培养， 大约 30d 后可见抗性芽出现， 待抗性芽伸长到 2cm 后， 转入生根培养基中。 0025 实施例 9 ： 转基因植株的 PCR 检测 提取转基因植株的基因组 DNA， 以基因组为模板， 用拟南芥油体蛋白与 CoQ10 融合基因 引物 ： 1 ： CCATGGCGGATACAGCTAGAGG 4 ： GGTCTGGTGAACCTCGTGG 扩增拟南芥油体蛋白和 Co。

28、Q10 基因融合基因片段， 扩增出预期的目的条带。 0026 实施例 10 ： 筛选表达量高的转基因株系 转基因株系在温室或大田经生长与发育， 然后开花结籽， 形成转基因 T1 代种子， 当 T1 代种子收获后， 每株转基因植株取 200-1000mg， 在提取液中抽提油体蛋白与 CoQ10 的融合 蛋白， 采用 ELISA 法， 按照 CoQ10IV 型 ElISA 试剂盒 （上海拜力生物科技有限公司） 说明书操 作， 检测重组 CoQ10 肽的表达量， 以 p13900RCoQ10 为对照， 筛选出高表达的转基因株系。结 果表明， 本发明构建的 pOBTCoQ10 重组载体经农杆菌介导转化。

29、的红花、 油菜、 大豆、 花生植 株与 p13900RCoQ10 经农杆菌介导转化的植株相比， 表达量明显提高， 如下表所示。 pOBTCoQ10(pg/ml)p13900CoQ10(pg/ml) 红花 2464.229.42254.228.6 油菜 2357.926.82230.825.8 大豆 2287.830.12126.529.5 花生 2399.728.72164.728.8 0027 实施例 11 ： 含有 oleosin-CoQ10 融合蛋白的转基因种子油体提取及 SDS-PAGE 检 测 （1） 取2001000mg转基因种子， 放入研钵中， 加入1ml Buffer A， 用。

30、研棒充分研磨。 直 至溶液变浑浊， 看不见种粒。放入离心机 12000rpm ， 4， 离心 10min ； （2） 离心后溶液分为三层， 即表层为白色油状层， 中间层液体， 和底层沉淀。 将上层油体 部分和液体部分混合均匀， 全部吸出， 注意不要吸出底层沉淀， 将吸出的液体转移至另一离 心管中， 加 Buffer A， 离心 12000rpm， 4， 10min， 重复 1、 2 步骤， 34 次。 0028 （3） 将重复 1、 2 步骤离心后吸出的液体加 500l 的 Buffer B 混匀， 在离心机中 4， 12000rpm， 离心 10min。 0029 （4） 此时离心后分为两层。

31、， 为上层油脂部分和下层液体部分， 将下层液体吸出， 弃 掉。再重复 3、 4 步骤， 34 次。 0030 （5） 往含有油脂部分的 EP 管内， 加入 40l Buffer B 和 10l 上样缓冲液， 混均， 说 明 书 CN 103320457 A 7 6/6 页 8 沸水中煮 10min， 取 15l 用 12% 的 SDS-PAGE 做鉴定， 见图 5。从图 5 中可见转基因植株在 约 55kDa 左右位置出现特异条带， 并且野生型在该处没有条带。进一步证明了 Oleosin 与 CoQ10 融合蛋白已经在拟南芥种子中得到表达。 0031 Buffer A ： 0.4M Sucro。

32、se， 0.5M NaCl， 0.05M Tris-HCl(pH=8.0) ； Buffer B ： 20 mM Na2HPO4， 20 mM NaCl(pH=8.0)。 0032 实施例 12 ： 转基因种子中 CoQ10 的 Western blot 检测 （1） 样品的处理及 SDS-PAGE 电泳， 方法同上。 0033 （2） 转膜 ： 在冰遇冷的转移槽中将蛋白转移至 PVDF 膜上， 恒压 100V， 12h ； （3） 封闭 ： 5%TBST 配制的脱脂奶粉封闭 PVDF 膜， 4过夜。 0034 (4) 抗体孵育 : 用 TBST 洗涤 PVDF 膜 34 次后， 用封闭液稀释。

33、一抗 （1:250） 。 稀释后的一抗对 PVDF 膜进行孵育， 18 ， 1h。TBST 再次洗膜 34 次后， 用 TBST 稀释二抗 （1:250） 。稀释后的二抗再次对膜进行孵育， 18， 1h。 0035 (5)显影及定影:ECL方法显影后， 将X-光片置于膜上进行曝光， 随后用定影液终 止并拍照保存。结果显示， 在约 55kDa 处可检测到特异蛋白条带， 与表达结果相符， 说明表 达的融合蛋白序列正确且具有抗原活性， 见图 6。 说 明 书 CN 103320457 A 8 1/4 页 9 序列表 吉林农业大学 一种含有 CoQ10 的植物油体 5 1 744 DNA 人工 1 a。

34、tggcttggg ctggttctag aagggtgcct gctggtacca gagctgctgc tgagaggtgc 60 tgcaggcttt ctttgtcacc aggagctcag ccagctcctc ctcctggacc tttgcctcct 120 cctaggccta tgaggttctt gacctcatgc tctttgttgt tgccaagggc tgctcagatt 180 cttgctgctg aggcaggttt gccttcttct aggtcattca tgggtttcgc tgctcctttc 240 accaacaaga ggaaggctta 。

35、ttctgagagg aggattatgg gatactctat gcaggagatg 300 tacgaggtgg tgtctaacgt gcaggagtac agggagttcg tgccttggtg caagaagtct 360 ttggtggtgt catcaaggaa gggacacctt aaggctcaat tggaggtggg attccctcca 420 gtgatggaga ggtacacctc tgcagtgtca atggtgaagc ctcacatggt taaggcagtg 480 tgcaccgacg gtaagttgtt caaccacttg gagaccatt。

36、t ggaggttctc acctggtatt 540 cctgcatacc caaggacctg caccgtggat ttctctattt cttttgagtt caggtctttg 600 ttgcactctc agcttgcaac catgttcttc gacgaggtgg tgaagcagaa cgttgctgct 660 ttcgagagga gggcagcaac caagttcggt ccagagaccg ctattcctag ggagttgatg 720 ttccacgagg ttcaccagac ctga 744 2 1548 DNA 菜豆种子 2 gaattcattg ta。

37、ctcccagt atcattatag tgaaagtttt ggctctctcg ccggtggttt 60 tttacctcta tttaaagggg ttttccacct aaaaattctg gtatcattct cactttactt 120 gttactttaa tttctcataa tctttggttg aaattatcac gcttccgcac acgatatccc 180 tacaaattta ttatttgtta aacattttca aaccgcataa aattttatga agtcccgtct 240 atctttaatg tagtctaaca ttttcatatt g。

38、aaatatata atttacttaa ttttagcgtt 300 序 列 表 CN 103320457 A 9 2/4 页 10 ggtagaaagc ataatgattt attcttattc ttcttcatat aaatgtttaa tatacaatat 360 aaacaaattc tttaccttaa gaaggatttc ccattttata ttttaaaaat atatttatca 420 aatatttttc aaccacgtaa atctcataat aataagttgt ttcaaaagta ataaaattta 480 actccataat ttttttattc 。

39、gactgatctt aaagcaacac ccagtgacac aactagccat 540 ttttttcttt gaataaaaaa atccaattat cattgtattt tttttataca atgaaaattt 600 caccaaacaa tcatttgtgg tatttctgaa gcaagtcatg ttatgcaaaa ttctataatt 660 cccatttgac actacggaag taactgaaga tctgctttta catgcgagac acatcttcta 720 aagtaatttt aataatagtt actatattca agatttcat。

40、a tatcaaatac tcaatattac 780 ttctaaaaaa ttaattagat ataattaaaa tattactttt ttaattttaa gtttaattgt 840 tgaatttgtg actattgatt tattattcta ctatgtttaa attgttttat agatagttta 900 aagtaaatat aagtaatgta gtagagtgtt agagtgttac cctaaaccat aaactataag 960 atttatggtg gactaatttt catatatttc ttattgcttt taccttttct tggtatg。

41、taa 1020 gtccgtaact ggaattactg tgggttgcca tggcactctg tggtcttttg gttcatgcat 1080 ggatgcttgc gcaagaaaaa gacaaagaac aaagaaaaaa gacaaaacag agagacaaaa 1140 cgcaatcaca caaccaactc aaattagtca ctggctgatc aagatcgccg cgtccatgta 1200 tgtctaaatg ccatgcaaag caacacgtgc ttaacatgca ctttaaatgg ctcacccatc 1260 tcaaccc。

42、aca cacaaacaca ttgccttttt cttcatcatc accacaacca cctgtatata 1320 ttcattctct tccgccacct caatttcttc acttcaacac acgtcaacct gcatatgcgt 1380 gtcatcccat gcccaaatct ccatgcatgt tccaaccacc ttctctctta tataatacct 1440 ataaatacct ctaatatcac tcacttcttt catcatccat ccatccagag tactactact 1500 ctactactat aataccccaa c。

43、ccaactcat attcaatact actctact 1548 3 1220 DNA 菜豆种子 3 aataagtatg aactaaaatg catgtaggtg taagagctca tggagagcat ggaatattgt 60 atccgaccat gtaacagtat aataactgag ctccatctca cttcttctat gaataaacaa 120 aggatgttat gatatattaa cactctatct atgcacctta ttgttctatg ataaatttcc 180 tcttattatt ataaatcatc tgaatcgtga cggct。

44、tatgg aatgcttcaa atagtacaaa 240 aacaaatgtg tactataaga ctttctaaac aattctaact ttagcattgt gaacgagaca 300 taagtgttaa gaagacataa caattataat ggaagaagtt tgtctccatt tatatattat 360 atattaccca cttatgtatt atattaggat gttaaggaga cataacaatt ataaagagag 420 aagtttgtat ccatttatat attatatact acccatttat atattatact tat。

45、ccactta 480 tttaatgtct ttataaggtt tgatccatga tatttctaat attttagttg atatgtatat 540 gaaagggtac tatttgaact ctcttactct gtataaaggt tggatcatcc ttaaagtggg 600 tctatttaat tttattgctt cttacagata aaaaaaaaat tatgagttgg tttgataaaa 660 序 列 表 CN 103320457 A 10 3/4 页 11 tattgaagga tttaaaataa taataaataa taaataacat a。

46、taatatatg tatataaatt 720 tattataata taacatttat ctataaaaaa gtaaatattg tcataaatct atacaatcgt 780 ttagccttgc tggacgactc tcaattattt aaacgagagt aaacatattt gactttttgg 840 ttatttaaca aattattatt taacactata tgaaattttt tttttttatc ggcaaggaaa 900 taaaattaaa ttaggaggga caatggtgtg tcccaatcct tatacaacca acttccacag。

47、 960 gaaggtcagg tcggggacaa caaaaaaaca ggcaagggaa attttttaat ttgggttgtc 1020 ttgtttgctg cataatttat gcagtaaaac actacacata acccttttag cagtagagca 1080 atggttgacc gtgtgcttag cttcttttat tttatttttt tatcagcaaa gaataaataa 1140 aataaaatga gacacttcag ggatgtttca acccttatac aaaaccccaa aaacaagttt 1200 cctagcaccc 。

48、taccaactaa 1220 4 762 DNA 拟南芥种子 4 atggcggata cagctagagg aacccatcac gatatcatcg gcagagacca gtacccgatg 60 atgggccgag accgagacca gtaccagatg tccggacgag gatctgacta ctccaagtct 120 aggcagattg ctaaagctgc aactgctgtc acagctggtg gttccctcct tgttctctcc 180 agccttaccc ttgttggaac tgtcatagct ttgactgttg caacacctct gc。

49、tcgttatc 240 ttcagcccaa tccttgtccc ggctctcatc acagttgcac tcctcatcac cggttttctt 300 tcctctggag ggtttggcat tgccgctata accgttttct cttggattta caagtaagca 360 cacatttatc atcttacttc ataattttgt gcaatatgtg catgcatgtg ttgagccagt 420 agctttggat caattttttt ggtcgaataa caaatgtaac aataagaaat tgcaaattct 480 agggaacatt tggttaacta aatacgaaat ttgacctagc tagcttgaat gtgtctgtgt 540 atatcatcta tataggtaaa atgcttggta tgatacctat tgattgtgaa taggt。