鸭黄病毒与鸭瘟病毒二重RTPCR检测试剂盒.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103320541 A (43)申请公布日 2013.09.25 CN 103320541 A *CN103320541A* (21)申请号 201310291179.6 (22)申请日 2013.07.11 C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (71)申请人 广西壮族自治区兽医研究所 地址 530001 广西壮族自治区南宁市友爱北 路 51 号 (72)发明人 谢芝勋 张艳芳 谢丽基 刘加波 庞耀珊 范晴 罗思思 邓显文 谢志勤 (74)专利代理机构。

2、 广西南宁公平专利事务所有 限责任公司 45104 代理人 杨立华 (54) 发明名称 鸭黄病毒与鸭瘟病毒二重 RT-PCR 检测试剂 盒 (57) 摘要 本发明公开了一种鸭黄病毒与鸭瘟病毒二重 RT-PCR 检测试剂盒， 该试剂盒含有两对特异性引 物。本发明具有操作简便、 敏感性高、 特异性强和 重复性好等优点， 应用本发明可建立鸭黄病毒和 鸭瘟病毒的二重 PCR 的检测方法， 实现同时检测 和鉴别鸭黄病毒和鸭瘟病毒两种病原体， 用于鸭 黄病毒感染造成的免疫力减低导致的鸭瘟病毒的 混合感染， 既可以节约时间的成本， 又可以减少污 染。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 。

3、页 序列表 2 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 序列表2页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103320541 A CN 103320541 A *CN103320541A* 1/1 页 2 1. 鸭黄病毒与鸭瘟病毒二重 RT-PCR 检测引物组， 其特征在于包括两对特异性引物， 分 别是引物 1 和 2、 引物 3 和 4， 它们分别具有序列表 SEQ.ID.No.1 至 SEQ.ID.No.4 的碱基序 列。 2. 根据权利要求 1 所述的鸭黄病毒与鸭瘟病毒二重 RT-PCR 检测引物组， 其特征在于 ： 所述引。

4、物 1、 引物 2、 引物 3、 引物 4 的摩尔比为 0.5-1 0.5-1 1 1。 3. 根据权利要求 2 所述的鸭黄病毒与鸭瘟病毒二重 RT-PCR 检测引物组， 其特征在于 ： 所述引物 1、 引物 2、 引物 3、 引物 4 的摩尔比为 1 1 1 1。 4. 权利要求 1 所述鸭黄病毒与鸭瘟病毒二重 RT-PCR 检测引物组在二重 PCR 扩增方面 的应用， 其特征在于 ： 所述二重 PCR 扩增的退火温度为 50.0 -60.1。 5. 根据权利要求 4 所述的应用， 其特征在于 ： 所述二重 PCR 扩增的退火温度为 55。 6. 一种鸭黄病毒与鸭瘟病毒二重 RT-PCR 检。

5、测试剂盒， 其特征在于该试剂盒含有以下 试剂 ： A 液 ： PCR 反应液， 含 2Taq PCR Mix、 BYD 上下游引物、 DPV 上下游引物、 ddH2O， BYD 上 下游引物分别是引物 1 和 2， DPV 上下游引物分别是引物 3 和 4， 引物 1 至 4 分别具有序列 表 SEQ.ID.No.1 至 SEQ.ID.No.4 的碱基序列 ； B 液 ： BYD+DPV 模板， 作为阳性对照 ； C 液 ： ddH2O， 作为阴性对照。 7. 权利要求 6 所述鸭黄病毒与鸭瘟病毒二重 RT-PCR 检测试剂盒， 其特征在于 ： 所述 PCR 反应液含 2Taq PCR Mix。

6、12.5L、 BYD 上下游引物各 0.5ul、 DPV 上下游引物各 0.5ul、 ddH2O8.5L， 其中各引物浓度均为50mol/mL ； 所述B液含BYD+DPV模板各1L， 所述C液 为 1L ddH2O。 8. 权利要求 7 所述鸭黄病毒与鸭瘟病毒二重 RT-PCR 检测试剂盒在二重 PCR 扩增方面 的应用， 其特征在于 ： 所述二重 PCR 扩增的退火温度为 50.0 -60.1。 9. 根据权利要求 8 所述的应用， 其特征在于 ： 所述二重 PCR 扩增的退火温度为 55。 权 利 要 求 书 CN 103320541 A 2 1/5 页 3 鸭黄病毒与鸭瘟病毒二重 RT。

7、-PCR 检测试剂盒 技术领域 0001 本发明属于 RT-PCR 检测试剂盒技术领域， 尤其涉及一种鸭黄病毒与鸭瘟病毒二 重 RT-PCR 检测试剂盒。 背景技术 0002 鸭黄病毒 (Bai yang dian virus， BYD) 又名鸭坦布苏病毒， 主要引起种鸭和蛋鸭 食欲急剧减退、 产蛋急剧下降， 卵泡变性， 卵泡膜出血为主要特征。2010 年以来， 我国福建、 浙江、 江苏、 山东、 安徽、 河南、 河北、 广东等地相继报道暴发了一种引起鸭产蛋大幅下降的 疾病， 给蛋鸭养殖业造成了很大的经济损失。鸭瘟病毒 (Duck plague virus， DPV) 是引起 鸭、 鹅等水禽的。

8、急性败血性传染病的一种疱疹病毒， 该病为一种广泛嗜全身性感染的传染 病， 不同日龄、 性别的鸭均可感染， 但以番鸭、 麻鸭、 绵鸭易感性最高， 在自然流行中， 成年鸭 和产蛋母鸭发病较为严重， 自然感染则多见于大鸭， 尤其是产蛋的母鸭， 1 月龄以下的雏鸭 发病较少。各养鸭国家和地区均有该病的发生和流行， 是危害养鸭业的最为严重的传染病 之一。 0003 由于BYD与DPV均可引起母鸭产蛋下降， 发病特征在临床上有相似之处， 特别是有 混合感染时， 更增加了临床诊断工作的难度。因此迫切需要建立一种快速敏感的鸭黄病毒 和鸭瘟病毒检测方法， 在感染早期就能检测出这些病毒， 从而为这些疾病的控制争取。

9、宝贵 的时间。目前， 这两种病毒的传统检测方法有血清中和试验、 琼脂扩散试验和 ELISA 等， 但 这些检测存在耗时长、 敏感性较低、 不易标准化等缺点， 在实际应用中具有一定的局限性。 0004 PCR 技术实现了对模板的定量， 而且具有敏感、 特异、 准确可靠、 能实现多重反应等 特点。实际应用中， 当样品量非常大时， 单重 PCR 在成本和时间方面存在一定劣势， 迫切需 要一种高通量、 低成本、 高效率的方法来进行批量的快速检测。多重荧光 PCR 采用多对引物 扩增检测多个模板， 克服了单重 PCR 的不足。但是， 建立一个二重 PCR 方法比单重的要复杂 得多， 其对试剂和引物的要求。

10、更高， 同时需要保证不同引物间无相互干扰。目前， 还未见应 用二重 PCR 技术同时对鸭黄病毒和鸭瘟病毒进行检测和诊断的报道。 发明内容 0005 本发明要解决的技术问题是提供一种敏感性好、 特异性高、 准确可靠、 快速方便的 鸭黄病毒与鸭瘟病毒二重 RT-PCR 检测试剂盒， 以实现同时检测和鉴别鸭黄病毒和鸭瘟病 毒两种病原体。 0006 为解决上述技术问题， 本发明采用以下技术方案 ： 鸭黄病毒与鸭瘟病毒二重 RT-PCR 检测引物组， 包括两对特异性引物， 分别是引物 1 和 2、 引物 3 和 4， 它们分别具有序 列表 SEQ.ID.No.1 至 SEQ.ID.No.4 的碱基序列。。

11、 0007 引物 1、 引物 2、 引物 3、 引物 4 的摩尔比为 0.5-1 0.5-1 1 1。 0008 引物 1、 引物 2、 引物 3、 引物 4 的摩尔比为 1 1 1 1。 0009 上述鸭黄病毒与鸭瘟病毒二重RT-PCR检测引物组在二重PCR扩增方面的应用， 二 说 明 书 CN 103320541 A 3 2/5 页 4 重 PCR 扩增的退火温度为 50.0 -60.1。 0010 二重 PCR 扩增的退火温度为 55。 0011 鸭黄病毒与鸭瘟病毒二重 RT-PCR 检测试剂盒， 该试剂盒含有以下试剂 ： A 液 ： PCR 反应液， 含 2Taq PCR Mix、 B。

12、YD 上下游引物、 DPV 上下游引物、 ddH2O， BYD 上下游引物分别 是引物 1 和 2， DPV 上下游引物分别是引物 3 和 4， 引物 1 至 4 分别具有序列表 SEQ.ID.No.1 至 SEQ.ID.No.4 的碱基序列 ； B 液 ： BYD+DPV 模板， 作为阳性对照 ； C 液 ： ddH2O， 作为阴性对 照。 0012 PCR 反应液含 2Taq PCR Mix12.5L、 BYD 上下游引物各 0.5ul、 DPV 上下游引物 各 0.5ul、 ddH2O8.5L， 其中各引物浓度均为 50mol/mL ； LB 液含 BYD+DPV 模板各 1L， LC 。

13、液为 1L ddH2O。 0013 引物 1 至 4 在 PCR 反应液中的终浓度分别为 0.2mol/mL、 0.2mol/mL、 1mol/ mL、 1mol/mL。 0014 上述鸭黄病毒与鸭瘟病毒二重RT-PCR检测试剂盒在二重PCR扩增方面的应用， 二 重 PCR 扩增的退火温度为 50.0 -60.1。 0015 二重 PCR 扩增的退火温度为 55。 0016 针对目前缺乏对鸭黄病毒和鸭瘟病毒同时进行检测和诊断的有效可靠的技术， 发 明人研究设计了两对特异性引物， 据此建立了鸭黄病毒和鸭瘟病毒的二重 PCR 的检测方 法， 并制备了相应的检测试剂盒。本发明具有操作简便、 敏感性高。

14、、 特异性强和重复性好等 优点， 应用本发明可同时检测和鉴别鸭黄病毒和鸭瘟病毒两种病原体， 用于鸭黄病毒感染 造成的免疫力减低导致的鸭瘟病毒的混合感染， 既可以节约时间的成本， 又可以减少污染。 附图说明 0017 图 1 是实施例 2 中二重 PCR 最佳引物浓度优化试验结果电泳图， 图中 ： M ： 100bp DNA ladder ； 1-7 ： DPV 引物 0.1L、 0.2L、 0.4L、 0.5L、 0.6L、 0.8L、 1.0L ； 1-7 ： BYD 引物 1.0L、 0.8L、 0.6L、 0.5L、 0.4L、 0.2L、 0.1L ； N ： 阴性对照。 0018 图。

15、 2 是实施例 2 中二重 PCR 最佳退火温度优化试验结果电泳图， 图中 M ： 100bp DNA ladder ； 1 ： 50.0 ； 2 ： 50.7 ； 3 ： 51.5 ； 4 ： 52.3 ； 5 ： 53.4 ； 6 ： 54.4 ； 7 ： 55.5 ； 8:56.6 ； 9 ： 57.7 ； 10 ： 58.6 ； 11 ： 59.5 ； 12 ： 60.1。 0019 图 3 是实施例 2 中二重 PCR 特异性试验结果电泳图， 图中 M ： 100bp DNA ladder ； N ： 阴性对照 （ddH2O） ； 1 ： 鸭黄病毒的 cDNA+ 鸭瘟病毒的 DNA(。

16、 等体积混合 ) ； 2 ： 鸭瘟病毒的 DNA ； 3 ： 鸭黄病毒的 cDNA ； 4 ： 新城疫病毒的 cDNA ； 5 ： 鸭肝炎病毒的 cDNA ； 6 ： 番鸭细小病毒 的 DNA ； 7 ： 鸭圆环病毒的 DNA ； 8 ： H9 亚型流感病毒的 cDNA ； 9 ： 减蛋综合症病毒的 DNA。 0020 图 4 是实施例 2 中二重 PCR 敏感性试验结果电泳图， 图中 M ： 100bp DNA ladder ； 1 ： 50ng鸭新黄病毒cDNA和60ng鸭瘟病毒DNA ； 2 ： 5ng鸭黄病毒cDNA和6ng鸭瘟病毒DNA ； 3 ： 500pg 鸭黄病毒 cDNA 和。

17、 600pg 鸭瘟病毒 DNA ； 4 ： 50pg 鸭黄病毒 cDNA 和 60pg 鸭瘟病毒 DNA ； 5 ： 5pg 鸭黄病毒 cDNA 和 6pg 鸭瘟病毒 DNA ； 6 ： 500fg 鸭黄病毒 cDNA 和 600fg 鸭瘟病 毒 DNA ； 7 ： 50fg 鸭黄病毒 cDNA 和 60fg 鸭瘟病毒 DNA ； 8 ： 5fg 鸭黄病毒 cDNA 和 6fg 鸭瘟病 毒 DNA。 0021 图 5 是实施例 4 中二重 PCR 检测临床样本部分结果电泳图， 图中 M 为 100bp DNA 说 明 书 CN 103320541 A 4 3/5 页 5 ladder ； N 。

18、为阴性对照 (ddH2O) ； 1 为阳性对照 ( 鸭黄病毒 cDNA+ 鸭瘟病毒 DNA) ； 2-16 分别 是鸭病料临床样本。 具体实施方式 0022 以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明， 均为常规方法 ； 所用的材料、 试剂 等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。具体所用材料和试剂如下 ： 0023 鸭黄病毒记载在 “4株广西鸭源坦布苏病毒分离及初步鉴定” ， 中国动物检疫， 已收 录， 待发表。 0024 鸭瘟病毒 AV1221 购自中国兽医药品监察所 ； 0025 新城疫病毒记载在 “新城疫植物油乳剂苗的研究” ， 中国预防兽医学报， 2000， (04):23-27， 。

19、公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得 ； 0026 鸭肝炎病毒 AV2111 株 （以下简称为 DHV I） 购自中国兽医药品监察所 ； 0027 番鸭细小病毒记载在 “广西番鸭细小病毒的分离和鉴定” ， 广西畜牧兽医， 2002， 18(6):5-7， 公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得 ； 0028 鸭圆环病毒记载在 “广西部分地区鸭圆环病毒感染情况调查” ， 中国畜牧兽医， 2010， 37（11):156-158， 公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得 ； 0029 H9 亚型禽流感病毒记载在 “多重反转录聚合酶链反应快速检测鉴别 H9 亚型禽流 感病毒方法的建立” ， 中国人兽共患。

20、病学报， 2006， (09):858-860， 公众可从广西壮族自治区 兽医研究所获得 ； 0030 减蛋综合症病毒记载在 “减蛋综合症植物油乳剂苗的研究” ， 中国预防兽医学报， 2000， (04):23-27， 公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。 0031 试剂 ： 100bp Marker ladder、 2Taq PCR Mix、 DNA/RNA 提取试剂盒、 反转录试 剂均购自北京全式金生物技术有限公司 ； 胶回收试剂盒购自广州东盛生物科技有限公司 ； pMD18T vector 试剂盒购自大连宝生物公司。 0032 实施例 1、 引物的设计与合成 0033 根据 GenBa。

21、nk 中 BYD 的 E 基因与 DPV 的 UL6 基因的保守序列， 采用利用 DNAStar 软件进行多序列比对， 在保守区用 primer5.0 设计引物。引物由北京六合华大基因科技股 份有限公司合成 （表 1） 。 0034 表 1 引物信息 0035 0036 实施例 2、 二重 RT-PCR 检测方法的建立 0037 一、 核酸的提取及 RNA 的反转录 说 明 书 CN 103320541 A 5 4/5 页 6 0038 参照 DNA/RNA 提取试剂盒说明书， 提取鸭瘟病毒、 番鸭细小病毒和鸭圆环病毒和 减蛋综合症病毒的 DNA ； 同时抽提鸭黄病毒、 鸭肝炎病毒、 H9 亚。

22、型禽流感病毒、 鸭源新城疫 病毒的 RNA， 按反转录说明书将 RNA 反转录成 cDNA， 具体如下 ： 建立如下反转录体系， 总反 应体积为 20L， 上述病毒 RNA 按反转录说明书 （北京全式金， AT301-02） ， RNA8L， 随机引 物 1L， 2TS Reaction Mix10L， TransScript RT/RI Enzyme Mix1L， 25 10min， 42 30min， 85 5min， 4结束， 得到鸭黄病毒、 鸭肝炎病毒、 H9 亚型禽流感病毒、 鸭源新城 疫病毒的 cDNA， -30保存。 0039 二、 二重 RT-PCR 扩增体系的建立 0040 。

23、1、 反应体系的优化 0041 对鸭黄病毒引物、 鸭瘟病毒引物、 模板等用量进行优化， 多次重复试验后确定 最佳反应用量， 最终确定二重 PCR 反应体系为 25L ： 2Taq PCR Mix( 北京全式金， AS111-12)12.5L、 BYD 上下游引物 （引物 1 和 2） 各 0.5L( 引物浓度均为 50mol/mL， 在 反应体系中的终浓度均为 1mol/mL)、 DPV 上下游引物 （引物 3 和 4） 各 0.5L( 引物浓度 均为 50mol/mL， 在反应体系中的终浓度均为 1mol/mL)、 模板各 1L， 加水至 25L。引 物优化结果如图 1 所示， 确定最佳引物。

24、浓度为 BYD 上下游引物各 0.5L， DPV 上下游引物各 0.5L。 0042 2、 反应条件的优化 0043 按照上述反应体系， 模板为鸭黄病毒的 cDNA 和鸭瘟病毒的 DNA 的等体积混合 物， 将退火温度按 50.0 -60.1依次递增， 多次重复试验后确定最佳退火温度。结果如 图 2 所示， 可见， 最佳退火温度为 54.4。确定最佳的反应条件 ： 94 5min ； 94 1min ； 54.4 1min ； 72 1min， 35 个循环 ； 72 10min。 0044 三、 二重 RT-PCR 特异性试验 0045 按照上述二优化的 PCR 反应体系和优化的反应条件进行。

25、二重 PCR 扩增， 不同的是 模板分别如下 ： 0046 鸭黄病毒的 cDNA+ 鸭瘟病毒的 DNA( 等体积混合 )、 鸭瘟病毒 DNA、 鸭黄病毒的 cDNA、 鸭新城疫病毒的 cDNA、 鸭肝炎病毒的 cDNA、 番鸭细小病毒的 DNA、 鸭圆环病毒的 DNA、 H9 亚型流感病毒的 cDNA、 减蛋综合症病毒的 DNA。结果如图 3 所示， 可见， 1-3 有 257bp 和 454bp的目的片段， 其余均没有目的片段。 说明， 本发明的引物和方法有高特异性， 可应用于 鉴定未知样本是否感染鸭黄病毒和鸭瘟病毒 ： 若得到 257bp 的片段， 则样本中含有鸭黄病 毒， 反之则没有 ；。

26、 若得到 454bp 的片段， 则样本中含有鸭瘟病毒， 反之则没有 ； 若得到 257bp 和 454bp 的片段， 则样本中含有鸭黄病毒和鸭瘟病毒， 反之则没有。 0047 四、 二重 PCR 的敏感性试验 0048 用 DU800 紫外分光光度计测得鸭黄病毒和鸭瘟病毒的核酸浓度分别为 50ng/L 和 60ng/L， 将二者分别进行 10 倍梯度稀释后等体积混合作为模板， 按照上述优化的 PCR 反应体系和优化的反应条件进行二重 PCR 扩增。结果如图 4 所示， 可见， 1-6 均有目的片段 扩出， 因此建立的二重 PCR 方法对鸭黄病毒的核酸最低检出限为 500fg ； 对鸭瘟病毒的核。

27、酸 最低检出限为 600fg。 0049 实施例 3、 检测试剂盒的组装 0050 根据实施例 1 和 2 的研究结果， 组装检测试剂盒以方便使用。 说 明 书 CN 103320541 A 6 5/5 页 7 0051 A液 ： PCR反应液， 含2Taq PCR Mix(北京全式金， AS111-12)12.5L、 BYD上下游 引物各0.5L(引物浓度均为50mol/mL， 在反应体系中的终浓度均为1mol/mL)、 DPV上 下游引物各 0.5L( 引物浓度均为 50mol/mL， 在反应体系中的终浓度均为 1mol/mL)， 加 ddH2O8.5L。 0052 B 液 ： 含 BYD。

28、+DPV 模板各 1L， 作为阳性对照。 0053 C 液 ： 含 ddH2O1L， 作为阴性对照。 0054 实施例 4、 二重 PCR 检测临床样本 0055 取实验室采集的 40 份 ( 编号为 1-40) 鸭病料， 分别提取鸭病料 DNA 和 RNA， 并将 RNA 反转录得到 cDNA， 将各个样本的 DNA 和 cDNA 混合 ( 体积比为 1 1)， 得到编号为 1-40 的混合样本。分别将上述编号为 1-40 的混合样本作为模板， 按照实施例 2 优化的 PCR 反应 体系和优化的反应条件进行二重 PCR 扩增。参考上述诊断标准， 若得到 257bp 的片段， 则样 本中含有鸭。

29、黄病毒， 反之则没有 ； 若得到 454bp 的片段， 则样本中含有鸭瘟病毒， 反之则没 有 ； 若得到 257bp 和 454bp 的片段， 则样本中含有鸭黄病毒和鸭瘟病毒， 反之则没有。 0056 扩增结果如图 5（其他病料电泳结果无条带显示， 故未附） 所示， 可以看出， 4、 7、 8、 12 有 257bp 目的片段， 其余均无目的片段， 40 份鸭病料中只有检出 4 份鸭黄病毒， 含有鸭黄 病毒病毒的感染率为 10.0 (4/40)。 说 明 书 CN 103320541 A 7 1/2 页 8 0001 0002 序 列 表 CN 103320541 A 8 2/2 页 9 序 列 表 CN 103320541 A 9 1/1 页 10 图 1 图 2 图 3 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 103320541 A 10 。