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1、(10)申请公布号 CN 103320416 A (43)申请公布日 2013.09.25 CN 103320416 A *CN103320416A* (21)申请号 201310241578.1 (22)申请日 2013.06.18 C12N 9/50(2006.01) (71)申请人 华南师范大学 地址 510631 广东省广州市天河区中山大道 西 55 号 (72)发明人 李海航 倪贺 陈方媚 范晓敏 (74)专利代理机构 北京市立方律师事务所 11330 代理人 刘延喜 王增鑫 (54) 发明名称 从水浮莲根中提取和制备蛋白酶的方法 (57) 摘要 本发明公开一种从水浮莲根中提取和制备。
2、蛋 白酶的方法， 其包括以下步骤 ： 将新鲜水浮莲根 切碎匀浆， 用水或磷酸盐缓冲液提取 ； 提取液用 有机溶剂沉淀分离蛋白酶， 经干燥后获得高活性 蛋白酶粉。 本发明利用水浮莲生产高活性蛋白酶， 变废为宝， 节能环保， 操作简单， 产品生产成本低， 便于大规模生产。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书3页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103320416 A CN 103320416 A *CN103320416A* 1/1 页 2 1. 一种从水浮莲根中提取和制备。
3、蛋白酶的方法， 其特征在于， 其包括以下步骤 ： （1） 准备新鲜水浮莲的根部 ； （2） 用所述步骤 （1） 中的水浮莲根的重量的 1 2 倍的水或缓冲液与所述水浮莲根混 合匀浆， 浸提， 然后分离上清和沉淀， 其上清为蛋白酶提取液 ； （3） 在所述步骤 （2） 中获得的蛋白酶提取液中加入有机溶剂至终浓度为 60% 90%， 静 置， 然后分离上清和沉淀， 其沉淀为蛋白酶 ； （4） 将所述步骤 （3） 获得的蛋白酶浓缩和干燥保存。 2. 如权利要求 1 所述的从水浮莲根中提取和制备蛋白酶的方法， 其特征在于 ： 所述步 骤 （2） 中的缓冲液为磷酸缓冲液。 3. 如权利要求 1 所述的从。
4、水浮莲根中提取和制备蛋白酶的方法， 其特征在于 ： 所述步 骤 （2） 中的浸提时间为 0.5 1 小时。 4. 如权利要求 1 所述的从水浮莲根中提取和制备蛋白酶的方法， 其特征在于 ： 所述步 骤 （3） 中的有机溶剂为乙醇或丙酮。 5. 如权利要求 4 所述的从水浮莲根中提取和制备蛋白酶的方法， 其特征在于 ： 所述步 骤 （3） 中静置沉淀的时间为 0.5 1 小时。 6. 如权利要求 1 或 5 所述的从水浮莲根中提取和制备蛋白酶的方法， 其特征在于 ： 所 述步骤 （2） 和 （3） 中通过离心或过滤分离上清和沉淀。 7. 如权利要求 6 所述的从水浮莲根中提取和制备蛋白酶的方法，。
5、 其特征在于 ： 所述步 骤 （4） 的干燥方法为真空冷冻干燥、 真空干燥或喷雾干燥。 8. 如权利要求 1 所述的从水浮莲根中提取和制备蛋白酶的方法， 其特征在于 ： 还包括 步骤 （5） ， 回收所述步骤 （3） 获得的上清中的有机溶剂。 9. 如权利要求 8 所述的从水浮莲根中提取和制备蛋白酶的方法， 其特征在于 ： 所述步 骤 （5） 采用减压蒸馏回收有机溶剂。 权 利 要 求 书 CN 103320416 A 2 1/3 页 3 从水浮莲根中提取和制备蛋白酶的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种蛋白酶的提取和制备技术， 尤其涉及一种从水浮莲根中提取和制 备蛋白酶的方法。 背景技术。
6、 0002 水浮莲的中文学名为凤眼莲， 又名水葫芦、 水葫芦苗、 凤眼蓝， 拉丁学名为 Eichhornia crassipes， 英文名 ： water hyacinth。单子叶植物纲、 鸭蹠草目、 雨久花科、 凤 眼莲属的凤眼莲， 是一种繁殖能力极强的水上浮生植物。近年来， 由于气候和环境的不断 恶化， 水浮莲在世界各地和我国华南、 华东、 华中和华北地区生长泛滥， 被视为一种污染环 境的有害生物， 困扰着我国绝大多数南方城市， 造成了严重的环境和社会问题， 包括阻断航 道， 影响航运和排泄 ； 限制水体流动， 破坏水生生态环境 ； 破坏饮水资源 ； 加大水的蒸发量， 造成水源流失等。 0。
7、003 目前， 水浮莲主要是作为城市垃圾处理， 不仅造成了资源和资金的浪费， 而且易腐 烂和产生高浓度有机废水， 严重污染环境。 为解决水浮莲产生的危害， 研究者们对水浮莲进 行资源化开发， 包括利用水浮莲生产动物饲料， 制备生物有机肥和用于生物能源等。但是， 水浮莲的这些资源化开发需要投入大量的开发成本， 水浮莲的利用率低， 产生的附加值低。 发明内容 0004 本发明的目的是提供一种水浮莲开发应用的途径， 提供一种从水浮莲根中提取和 制备蛋白酶的方法， 将水浮莲变废为宝， 缓解水浮莲带来的环境危害。 0005 为达到以上技术目的， 本发明采用的技术方案如下 ： 0006 一种从水浮莲根中提。
8、取和制备蛋白酶的方法， 其包括以下步骤 ： 0007 （1） 准备新鲜水浮莲的根部 ； 0008 （2） 用所述步骤 （1） 中的水浮莲根的重量的 1-2 倍的水或缓冲液与所述水浮莲根 混合匀浆， 浸提， 然后分离上清和沉淀， 其上清为蛋白酶提取液 ； 0009 （3） 在所述步骤 （2） 中获得的蛋白酶提取液中加入有机溶剂至终浓度为 60% 90%， 静置， 然后分离上清和沉淀， 其沉淀为蛋白酶 ； 0010 （4） 将所述步骤 （3） 获得的蛋白酶浓缩和干燥保存。 0011 具体地， 所述步骤 （2） 中的缓冲液为磷酸缓冲液， 同时， 其浸提时间为 0.5 1 小 时。 0012 进一步地。
9、， 所述步骤 （3） 中的有机溶剂为乙醇或丙酮， 同时， 其静置沉淀的时间为 0.5 1 小时。 0013 优选地， 所述步骤 （2） 和 （3） 中通过离心或过滤分离上清和沉淀。 0014 所述步骤 （4） 的干燥方法为真空冷冻干燥、 真空干燥或喷雾干燥。 0015 进一步地， 还包括步骤 （5） ， 回收所述步骤 （3） 获得的上清中的有机溶剂， 具体地， 采用减压蒸馏回收有机溶剂。 说 明 书 CN 103320416 A 3 2/3 页 4 0016 与现有技术相比较， 本发明具有如下优势 ： 0017 （a） 经蛋白酶活性测定， 水浮莲蛋白酶活性高于目前常用的植物材料木瓜中的蛋 白酶。
10、的活性， 因此， 水浮莲可作为制备高活性蛋白酶的优质来源 ； 0018 （b） 本发明设备投资少， 操作简单， 产品生产成本低， 便于大规模生产 ； 0019 （c） 本发明将水浮莲高效利用， 变废为宝， 不仅缓解了水浮莲带来的环境危害问 题， 还可带来巨大的经济和社会效益 ； 0020 （d） 沉淀蛋白酶用的有机溶剂可完全回收重复利用， 实现了生产过程中的无污染 和零排放。 附图说明 0021 图 1 为本发明从水浮莲根中提取和制备蛋白酶的方法的流程图。 0022 图 2 为用本发明从水浮莲根中提取和制备蛋白酶的方法从不同的生物材料中提 取的蛋白酶的酶活性对比图。 0023 图 3 为本发明。
11、从水浮莲根中提取和制备蛋白酶的方法中在不同浓度的乙醇下蛋 白酶的沉淀情况对比图。 0024 图 4 为本发明从水浮莲根中提取和制备蛋白酶的方法中在不同浓度的丙酮下蛋 白酶的沉淀情况对比图。 0025 图 5 为本发明从水浮莲根中提取和制备蛋白酶的方法中提纯的蛋白酶粉末在不 同酸碱度的缓冲液中保温后的酶活性对比图。 具体实施方式 0026 以下结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细描述。 0027 实施例 1 0028 如图 1 的流程图所示， 本发明从水浮莲根中提取和制备蛋白酶的方法的具体步骤 如下 ： 0029 （1） 准备新鲜的水浮莲用水冲洗干净， 切下所述水浮莲的根部， 称取该水浮莲。
12、根 100 克 ； 0030 （2） 在所述称取好的水浮莲根中加入 100 毫升的水或磷酸缓冲液进行匀浆混合， 浸提 1 小时后， 通过离心机分离所述匀浆的上清和沉淀， 其上清为蛋白酶提取液 ； 0031 （3） 取所述蛋白酶提取液， 加入乙醇至终浓度为 80%， 或者加入丙酮至终浓度为 70% 90%， 静置 1 小时， 通过离心机分离上清和沉淀， 其沉淀为蛋白酶 ； 0032 （4） 将所述步骤 （3） 获得的蛋白酶沉淀经真空冷冻干燥、 真空干燥或喷雾干燥后保 存， 获得高活性蛋白酶粉 ； 0033 （5） 采用减压蒸馏回收所述步骤 （3） 获得的上清中的乙醇或者丙酮。 0034 实施例 。
13、2 0035 将所述实施例 1 中步骤 （2） 获得的蛋白酶提取液、 步骤 （3） 获得的蛋白酶沉淀物和 步骤 （4） 获得的蛋白酶粉经酪蛋白水解法处理后， 再用含 0.1% 明胶的聚丙烯酰胺电泳凝胶 自显影法测定蛋白酶的酶活性， 其结果如下 ： 0036 请参考图 2， 除了从水浮莲根中提取和制备蛋白酶， 作为对比， 同时选取了其他不 说 明 书 CN 103320416 A 4 3/3 页 5 同的生物材料来进行蛋白酶的提取和制备， 包括 ： 苹果、 火龙果、 蘑菇、 橙、 梨、 龙眼、 香蕉、 菠萝和木瓜， 其中木瓜是常用的蛋白酶提取原料， 通过对从不同生物材料中提取的蛋白酶 的酶活性对。
14、比表明， 从水浮莲根中提取的蛋白酶的提取量和酶活性均明显高于其他生物材 料， 包括木瓜。 0037 请参考图 3， 泳道 1 的蛋白酶来源于所述水浮莲根的蛋白酶提取液， 其余泳道的蛋 白酶为经不同浓度的乙醇沉淀后的蛋白酶沉淀物。 结果表明用乙醇作为水浮莲根蛋白酶沉 淀剂时， 乙醇的浓度为80%90%时最适宜， 经此浓度的乙醇沉淀分离的蛋白酶蛋白条带清 晰、 完整， 表明经乙醇沉淀分离的蛋白酶仍然保持催化活性。 0038 请参考图 4， 泳道 1 的蛋白酶来源同样源于所述水浮莲根的蛋白酶提取液， 其余泳 道的蛋白酶为经不同浓度的丙酮沉淀后的蛋白酶沉淀物。结果表明， 用丙酮作为水浮莲根 蛋白酶沉淀。
15、剂时， 丙酮的浓度为70%90%时最适宜， 经此浓度的丙酮沉淀分离的蛋白酶蛋 白条带清晰、 完整， 表明经丙酮沉淀分离的蛋白酶仍然保持催化活性。 0039 请参考图 5， 将经过干燥的水浮莲根蛋白酶粉经不同酸碱度的缓冲液 （分别为碱性 缓冲液、 酸性缓冲液和中性缓冲液） 保温后再进行酶活性检测， 结果表明， 水浮莲根蛋白酶 在酸性缓冲液中不稳定， 其酶活性较低， 其中， 最酶活性最高的是在中性缓冲液中保温的蛋 白酶， 即水浮莲根的中性蛋白酶活性最高。 0040 所述中性酶蛋白是一类最适作用 pH 值在 6.0 7.5 之间， 分子量为 35000 40000， 等电点为 8 9 的蛋白酶。中性。
16、蛋白酶是最早发现并广泛应用于工业化生产的蛋白 酶制剂， 可用于焙烤食品工业中、 阿斯巴甜的合成、 蛋白水解物苦昧的去除， 大米深加工领 域以及医药治疗等领域。 0041 与此同时， 经其他方法对所述水浮莲根的中性蛋白酶的酶活性检测， 每千克新鲜 水浮莲根可获得 4130 酶活单位的中性蛋白酶 ； 每千克新鲜水浮莲根可制备 2 克蛋白酶粉， 每克酶粉的中性蛋白酶活性为 2070， 相对酶活性为每克蛋白质 3236 酶活性单位。 0042 综上所述， 本发明从水浮莲根中提取和制备蛋白酶的方法利用水浮莲生产高活性 蛋白酶， 变废为宝， 节能环保， 操作简单， 产品生产成本低， 便于大规模生产。 0043 上述实施例为本发明较佳的实施方式， 但并不仅仅受上述实施例的限制， 其他的 任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、 修饰、 替代、 组合、 简化， 均应为等效的 置换方式， 均包含在本发明的保护范围之内。 说 明 书 CN 103320416 A 5 1/2 页 6 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103320416 A 6 2/2 页 7 图 3 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 103320416 A 7 。