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1、(10)申请公布号 CN 103525905 A (43)申请公布日 2014.01.22 CN 103525905 A (21)申请号 201310303406.2 (22)申请日 2013.07.17 C12Q 1/68(2006.01) A61K 48/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (71)申请人 上海交通大学医学院附属瑞金医院 地址 200025 上海市卢湾区瑞金二路 197 号 (72)发明人 宁光 何娟 王卫庆 李小英 曹亚南 (74)专利代理机构 上海伯瑞杰知识产权代理有 限公司 31227 代理人 吴瑾瑜 (54) 发明名称 miRNA 用于制。
2、备治疗原发性醛固酮增多症腺 瘤的药物和诊断试剂 (57) 摘要 本发明涉及医药和生物技术领域， 具体为根 据原发性醛症增多症腺瘤及增生组织中 miRNA 不 同的表达水平， 以及 miR-375 的表达水平与醛固 酮瘤的肿瘤大小相关， 用miR-375或miR-7中的至 少一种制备和筛选治疗原发性醛固酮增多症腺瘤 的药物 ； 以及将 miR-375 或 miR-7 的检测试剂用 于制备原发性醛固酮增多症腺瘤的诊断试剂。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 9 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书9页 附图1页 (1。
3、0)申请公布号 CN 103525905 A CN 103525905 A 1/1 页 2 1.miRNA 在制备或筛选治疗原发性醛固酮增多症腺瘤的药物中的应用， 其特征在于， 所 述的 miRNA 为 miRNA-375 和 miRNA-7 中的至少一种。 2.miRNA 检测试剂用于制备原发性醛固酮增多症腺瘤的诊断试剂， 其特征在于， 所述的 miRNA 为 miRNA-375 和 miRNA-7 中的至少一种。 权 利 要 求 书 CN 103525905 A 2 1/9 页 3 miRNA 用于制备治疗原发性醛固酮增多症腺瘤的药物和诊 断试剂 技术领域 0001 本发明涉及医药和生物技。
4、术领域， 具体为用 miRNA 制备和筛选治疗原发性醛固酮 增多症腺瘤的药物及诊断试剂。 背景技术 0002 1954 年 4 月， 密歇根大学的医学教授 Jerome W.Conn 面对一位表现为高血压、 严 重低血钾伴明显神经肌肉症状， 被诊断为 “失钾性肾炎” 的女性患者， 根据他对肾上腺的病 理生理研究， 报道了世界上首例原发性醛固酮增多症 ( 原醛症 )， 继而分泌醛固酮的肾上腺 瘤疾病也被命名为 Conn s 综合征。1957 年， 上海瑞金医院邝安堃、 陈家伦教授等诊断和报 道了中国第一例原醛症。在过去几十年， 原醛症一直被认为是一种罕见的肾上腺疾病， 在 高血压人群中患病率可能。
5、低于 1% 2%。尽管 Conn 曾根据其收集的 145 份病例提出高达 20% 原发性高血压病人可能是原发性醛固酮增多症， 但该调查并未受到重视。1981 年日本 学者 Hiramatsu 首次提出了以相对稳定的醛固酮 / 肾素活性， 即 ARR（Aldosterone-renin ratio） 进行原醛症的筛查， 显著提高了人群检出率， 并使得学者对于原醛症有了新的认识 与了解。目前已有的原醛症高血压发病率研究等报道其在一般高血压患者中患病率约占 5 13%， 在难治性高血压患者中， 原醛症患病率更高达 17%-23%。这些数据表明， 原醛症实 际上是一种常见的肾上腺疾病， 其已成为内分泌。
6、源性高血压的第一大原因， 继发性高血压 中的最常见病因。 而且， 相对于原发性高血压患者， 原醛症患者的心、 肾、 血管等高血压靶器 官的损害更为严重， 发生心肌肥厚、 舒张功能障碍、 心力衰竭和肾功能受损的风险更。 因此， 对原醛症的诊断、 治疗以及发生、 发展机制的深入研究不仅是肾上腺疾病相关领域， 也是内 分泌和高血压疾病的研究领域中十分重要的问题。 0003 原 醛 症 分 为 五 种 类 型，其 中 双 侧 特 发 性 醛 固 酮 增 多 症 （idiopathic hyperaldosteronism,IHA） 及醛固酮瘤 （aldosterone-producing adenom。
7、a,APA） 为最常见 的亚型， 两者之和约占原醛症各亚型总和的 90% 左右， 单侧肾上腺增生或原发性肾上腺皮 质增生症 （primary adrenal hyperplasia,PAH） 较少见， 家族性醛固酮增多症 （familial hyperaldosteronism,FH） 及分泌醛固酮的肾上腺皮质癌则较罕见。目前， 原醛症患者的 分型诊断仍是临床上的难点， 且在很大程度上影响了治疗方案的选择。根据临床指南， 原 醛症的分型诊断主要依靠肾上腺 CT、 体位试验及双侧肾上腺静脉采血 (adrenal venous sampling,AVS)。 肾上腺CT对诊断醛固酮瘤的敏感性及特异性。
8、分别为70-80%和60-70%， 而 体位试验的诊断敏感性及特异性较低， 虽然 AVS 的敏感性及特异性高达 90%， 但其只能作为 判定双侧肾上腺有无优势分泌的依据， 并不能作为诊断醛固酮瘤的金标准。诊断方法和技 术上的不足， 导致原醛症筛查和诊断过程复杂且成本较高， 部分患者可能由于诊断和分型 困难而漏诊或影响治疗效果和预后。因此， 探索原醛症相关分子生物标志物和创新性的诊 断方法， 以及通过分子机制研究探索原醛症治疗和预后的新技术是现在迫切需要解决的问 题。 说 明 书 CN 103525905 A 3 2/9 页 4 0004 相对于其它常见肾上腺和内分泌相关疾病， 原发性醛固酮增多。
9、症的基础研究报道 较少， 其发生发展的分子及遗传机制也尚不清楚。有研究报道了基因多态性， 融合基因产 生及染色体 7p22 候选基因改变等与原醛症之间的关系。另有研究证实醛固酮瘤患者在进 行一系列激发试验后， 相当一部分会出现醛固酮水平的异常升高， 同时肿瘤组织中也发现 LHR、 MC2R、 AVPR、 GIPR、 5-HT4R 的异常表达， 推测异位受体的异常表达可能与醛固酮瘤的发 生相关。Choi 等研究者利用外显子测序技术对 22 个外周血和组织配对的醛固酮瘤标本进 行基因突变的筛选， 结果发现了钾通道基因 (KCNJ5) 的突变可导致肾上腺细胞钠离子内流 增加， 细胞去极化引起电压门控。
10、钙通道开放， 胞内钙离子浓度的升高增加醛固酮合成酶的 表达， 促使原醛症发生。不仅如此， 携带有 KCNJ5 突变的 APA 患者在 AVS 检测中发现其醛固 酮分泌较无突变者明显增加。但在不同的研究中， KCNJ5 在原醛腺瘤中的突变率变异较大 ( 波动于 14%-100%)。同时其他钾通道蛋白的功能研究， 如 TASK-1， TASK-3 等也提示可能同 原醛症中激素的高分泌相关。 最近， 同样是通过外显子测序， Beuschlein等人发现在APA患 者中存在 ATP 酶的体细胞基因突变， 该突变同醛固酮的自分泌增强相关。尽管上述研究从 不同侧面解释了原醛症中醛固酮高分泌的机制， 但这些。
11、未能解释肾上腺组织增生及腺瘤形 成的具体原因， 提示原醛症和醛固酮瘤发生和发展的分子机制仍需要进一步的大量研究， 其中引起同一疾病不同表型和预后差异的精确机制是十分重要的问题。 0005 近年来， 随着表观遗传学的兴起， 越来越多的研究开始关注非编码核糖核酸 （noncoding RNA,ncRNA） ， 其中的microRNA(miRNA)更成为发育、 代谢、 肿瘤等各个领域的新 兴研究热点。microRNAs(miRNAs) 是一类长约 19-25 个核苷酸大小的在进化上非常保守的 内源性非编码 RNA， 通过转录后调控对靶基因的表达水平产生影响 ； microRNAs 在动植物和 微生物。
12、中广泛存在， 由 DNA 经 RNA 聚合酶 II 或 III 转录生成前体 miRNA （pri-miRNA） ， 之后 pri-miRNA 被 Drosha 酶切割形成长度大约 70-100 碱基的、 具发夹结构的 pre-miRNA。这些 发夹结构的 RNA 被核输出蛋白 exportin5 转运到细胞质， 再被胞浆中的 Dicer 酶切割形成 成熟的 miRNAs 产物， 同 Ago2、 TRBP 等蛋白一起形成 RNA 诱导的沉默复合体 （RNA-induced silencing complex,RISC） 。它们通过同靶基因 mRNA 的 3 端非翻译区 （3 untransla。
13、ted region,3 UTR） 的碱基完全或不完全配对， 引起靶基因 mRNA 的降解和 / 或抑制该 mRNA 的 翻译， 从而直接抑制蛋白质的表达。 近几年来通过高通量测序等研究方法， 已发现了上千种 可编码 miRNA 的基因， 而超过 30% 的编码蛋白质基因受到这些 miRNA 的调控。 0006 自2002年Calin等人首次报道了在慢性淋巴细胞白血病中存在miR-15及miR-16 的表达缺失及下调， miRNA 在肿瘤发生、 发展中的作用及对肿瘤治疗疗效、 预后判断的影响 逐渐为人们所认识。 现已有大量文献报道了在乳腺癌、 胃癌、 肺癌、 前列腺癌、 肝癌等多种肿 瘤性疾病。
14、中 miRNA 表达的异常及其调控机制， 其或扮演了原癌基因或抑癌基因的角色。而 miRNA 在内分泌相关代谢和肿瘤发生过程中的功能也已成为了研究热点， 如在胰腺癌， 甲状 腺、 垂体、 卵巢肿瘤中均可见 miRNAs 表达异常的相关报道。在肾上腺疾病中， 对于基因表达 差异及其与疾病和预后的相关性也有一些研究报道近期有研究报道了嗜铬细胞瘤、 库欣综 合征、 肾上腺皮质癌等肾上腺肿瘤组织中 miRNA 的表达差异， 而对于原醛症， 尚未见任何报 道研究非编码 RNA 的表达和功能， 其中对于肾上腺皮质细胞增生的机制研究更加缺少。相 较其他肿瘤的研究情况， 这在很大程度上制约了人们对原醛症的认识。
15、， 限制了诊断和治疗 技术手段的发展。越来越多证据显示， miRNA 参与了肿瘤生物学行为的多个环节。而 miRNA 说 明 书 CN 103525905 A 4 3/9 页 5 在原醛症肾上腺组织中的表达及其在疾病发生发展中的作用机制目前尚未见报道。 发明内容 0007 本发明旨在将 miRNA 应用于制备或筛选治疗醛固酮瘤的药物。 0008 本发明还将检测 miRNA 的试剂用于制备醛固酮瘤的诊断试剂。 0009 本发明根据原发性醛症增多症腺瘤及增生组织中 miRNA 不同的表达水平， 发现 原发性醛症增多症腺瘤中， miR-375 及 miR-7 表达水平下降， 而且具有统计学意义 ； 。
16、并且 miR-375 的表达水平与原发性醛固酮增多症腺瘤 （醛固酮瘤） 的肿瘤大小相关。 0010 miRNA-375 可作为药物效果的参数， 用以制备及筛选治疗醛固酮瘤的药物 ； 同时， 通过检测 miRNA-375 的表达水平， 有助于判断增生的组织是否为原发性醛症增多症所引发 的， 因而本发明将 miRNA-375 的检测试剂用于制备醛固酮瘤的诊断试剂。 附图说明 0011 图1为实施例3中， 原发性醛固酮增多症中腺瘤、 结节样增生组织及正常对照组织 中 miRNA-375 的表达差异。 0012 图2为实施例3中， 原发性醛固酮增多症中腺瘤、 结节样增生组织及正常对照组织 中 miRN。
17、A-7 的表达差异。 0013 图3为实施例3中， 原发性醛固酮增多症中腺瘤、 结节样增生组织及正常对照组织 中 miRNA-29a 的表达差异。 0014 图4为实施例3中， 原发性醛固酮增多症中腺瘤、 结节样增生组织及正常对照组织 中 miRNA-29b 的表达差异。 0015 图5为实施例3中， 原发性醛固酮增多症中腺瘤、 结节样增生组织及正常对照组织 中 miRNA-29c 的表达差异。 具体实施方式 0016 实施例 1 0017 确诊为原发性醛固酮增多症 （PA） 并行手术治疗的患者 128 例 0018 I. 筛查对象选择标准 ： 0019 （1） JNC（Joint Natio。
18、nal Committee on the Prevention,Evaluation,and Treetment of High BLood Pressure） 高血压分级2级(BP160179/100109mmHg)、 3 级 (BP 180/110mmHg) ； 0020 （2） 难治性高血压 （联合使用 3 种降压药物治疗， 其中必须包括利尿剂， 且每种降 压药物均达常规治疗剂量， 血压仍大于 140/90mmHg） ； 0021 （3） 自发性或利尿剂所致的低钾血症 ； 0022 （4） 肾上腺意外瘤 ； 0023 （5） 早发性高血压家族史或早发 （小于 40 岁） 脑血管意外家族史。
19、 ； 0024 （6） 原醛患者中存在高血压的一级亲属。 0025 II. 选择对象的诊断 0026 醛固酮 / 肾素 (ARR) ： 所有研究对象停用对 RASS 系统有影响药物， 包括利尿剂、 甘 说 明 书 CN 103525905 A 5 4/9 页 6 草及其制剂 4 周以上， 停用血管紧张素转换酶抑制剂、 血管紧张素受体拮抗剂、 二氢吡啶类 钙离子拮抗剂、 受体阻滞剂、 非甾体类抗炎药 2 周以上， 降压可改用非二氢吡啶类钙离子 拮抗剂或 受体阻滞剂控制血压。 0027 清晨起床保持非卧位状态2h(可以站立、 走动、 座位)， 休息15min后于1000前 坐位抽取血醛固酮及肾素，。
20、 并计算 ARR。ARR300 需进一步行生理盐水试验。同时完善其他 激素水平及生化检测， 包括血、 尿电解质， 同时完善血 ACTH、 血皮质醇、 尿游离皮质醇、 血浆 甲氧基肾上腺素 （MN） 、 血浆甲氧基去甲肾上腺素 （NMN） 检测。 0028 确诊 ： 参照 2008 年国际内分泌学会发表的 原发性醛固酮增多症诊断及治 疗指南 （Case Detection,Diagnosis,and Treatment of Patients with Primary Aldosteronism:An Endocrine Society Clinical Practice Guideline） 。
21、推荐的确诊原醛 的试验方法， 我们采用了其中的生理盐水抑制试验生理盐水试验 ： 试验前须卧床休息 1h， 800开始， 在4h内静脉滴注生理盐水2000ml(500ml/h， 滴速恒定)， 在整个过程中需要密 切监测血压和心率变化。在静滴前和静滴后分别测定血醛固酮及血钾。生理盐水后醛固酮 水平 100pg/mL 原醛诊断成立。 0029 分型诊断 0030 （1） 肾上腺 CT 扫描 ： 为定位诊断首选检查方式， 患者常规行双侧肾上腺平扫加增 强 CT 扫描， 层厚 3.75mm。CT 扫描可提示肾上腺形态正常， 单侧肾上腺肢增厚， 双侧肾上腺 结节样增生， 单侧或双侧腺瘤。 0031 （2）。
22、 肾上腺静脉采血 （AVS） ： 是区分单侧和双侧原发性醛固酮增多症的金标准实 验。插管在清晨 8:00-9:00 开始 , 整个过程中患者保持卧位。插管在 DSA 引导下进行， 经 右侧股静脉穿刺后， 插管至肾静脉水平的下腔静脉和左右肾上腺静脉内， 采样送检， 分析比 较双侧肾上腺静脉及下腔静脉的醛固酮和皮质醇水平。 双侧肾上腺静脉皮质醇比下腔静脉 皮质醇均 3 提示插管成功 ； 较高一侧醛固酮与皮质醇比值比对侧醛固酮与皮质醇比值 2 提示有优势分泌。若发现优势则行手术治疗。 0032 通过病理诊断判定肾上腺结节样增生或肾上腺腺瘤。 0033 III. 样本采集及保存 0034 纳入研究的经。
23、手术治疗的原发性醛固酮患者共计 128 例， 术后病理诊断为腺瘤者 88例， 结节样增生者40例。 所有原发性醛固酮增多症患者的手术标本均于手术室由有经验 的医师在无菌状态下从取出的病变肾上腺皮质组织中切除， 并立即放于液氮中保存直至使 用。基本临床资料如表 1。 0035 正常对照标本为 ： 肾上腺无功能腺瘤患者手术切除的瘤旁肾上腺皮质组织切除部 分组织行冰冻切片， HE 染色， 由有经验的病理科医师判断为正常肾上腺皮质后， 将剩余肾上 腺皮质组织作为实验正常对照组保存 （8 例） 。 0036 表 1. 患者基本临床资料 0037 说 明 书 CN 103525905 A 6 5/9 页 。
24、7 0038 0039 连续性变量用均数 SD 或中位数 （四分位数） 表示， 分类变量用数量 （百分比） 表 示 0040 在原醛症腺瘤患者中男性 40 例， 结节样增生患者中男性 18 例， 两组性别构成 比无差异 （p=0.964） 。高血压病程、 收缩压及舒张压水平在两组间无明显差异。原发性 醛固酮增多症腺瘤患者与结节样增生患者的临床特征相似， 但前者血清醛固酮水平明 显高于后者 ： 血清醛固酮水平在腺瘤组为 560.6(329.1-901.7)pg/ml， 结节样增生组为 436.5(233.1-655.2)pg/ml， 两者差异有统计学意义 （p=0.026） 。醛固酮肾素活性比 。
25、ARR 在醛固酮瘤组比结节样增生组中明显升高， 差异有统计学意义 （p=0.005） 。而血浆肾素 活性、 比值、 血钾、 血钠、 24 小时尿钾及尿钠在两组间比较差异均无统计学意义。在肾上 腺 CT 扫描中， 腺瘤患者病灶直径为 1.50(1.20-2.00)cm， 同结节样增生患者病灶大小 1.50(1.00-2.00)cm 比较， 两者差异亦无统计学意义。 0041 实施例 2 0042 取实施例 1 获得的总 RNA 进行 microRNA 芯片分析 0043 （1） RNA 质量控制检测 说 明 书 CN 103525905 A 7 6/9 页 8 0044 提取好的原发性醛固酮增多。
26、症 （PA） 腺瘤、 结节样增生组织及正常肾上腺皮质组织 送 LC Sciences 公司进行 RNA 质量的检测。质量合格的 RNA 进行下一步微阵列基因表达检 测。 0045 （2） ParafloTMmicroRNA 微阵列基因表达实验 0046 送测芯片的样本包括了腺瘤组织 RNA6 例， 结节样增生组织 RNA6 例以及正常肾上 腺皮质组织RNA3例。 微阵列基因表达检测实验由LC Sciences公司完成。 具体实验流程如 下 ： 进行微阵列实验需要 10g 总 RNA 样品。总 RNA 通过 YM-100(Millipore) 微离心过滤 柱分离得到长度小于 300nt 的小 R。
27、NA。在分离得到的小 RNA3 端运用 Poly(A) 聚合酶加上 poly(A)尾巴， 再在该poly(A)尾巴后连接1个寡聚核苷酸标记以用于后续的荧光标记。 若 是双样品实验， 选用两个不同的标记物标记两个小RNA样品。 在ParafloTM微流体芯片上 利用微循环泵 （Atactic Technologies） 的循环作用， 过夜进行杂交反应。在 ParafloTM 微流体芯片上， 每条检测探针都是由一个与目标 microRNA 互补的化学修饰核苷酸编码段 （来源于 miRBase， http:/microrna.sanger.ac.uk/sequences/） 或是与其他同质控或是 客。
28、户定制序列互补的 RNA 以及一个由聚乙二醇组成的扩大编码段与基质的间距的间隔段 组成。所有检测探针使用 PGR（photogenerated reagent） 化学法原位合成。化学修饰的 检测探针用于平衡杂交解链温度。以含有 25% 甲酰胺的 100L6xSSPE（0.90M NaCl， 60mM Na2HPO4， 6mM EDTA， pH6.8） 作为杂交缓冲液， 杂交温度为 34 C。杂交后检测特异性的 Cy3 和 Cy5 荧光染料。杂交结束后， 利用激光扫描仪 （GenePix4000B， Molecular Device） 采集 图像并使用 Array-Pro 图像分析软件 （Med。
29、ia Cybernetics） 对结果进行图像数字化转换。 0047 （3）数据分析首先是减除背景值， 然后使用 LOWESS 过滤 （Locally-Weighted Regression） 进行信号归一化处理。对于双标实验， 计算两组检测信号的比值 （log2 变换， 平衡） ， 进行 t-test， 分析 p-values ； 当 p-value0.01 时， 被认为是显著差异性表达。 0048 在进行芯片检测过程中， 我们选择了原醛症腺瘤组织 6 例， 结节样增生组织 6 例， 正常肾上腺皮质组织3例， 每个样本的总RNA分别进行了ParafloTMmicroRNA微阵列基因 表达谱分。
30、析。 结果显示， 在芯片平均信号强度大于500的miRNAs中， 经方差分析得到在正常 肾上腺皮质组织、 结节样增生组织及腺瘤组织中表达差异 p0.01 的 miRNAs 共有 30 个， 其 中在原醛组织中表达上调的 miRNA8 个， 表达下调的 22 个 ； 具表达差异的 p0.05 的 miRNAs 有 65 个， 其中在原醛组织中表达上调的 39 个， 表达下调的 26 个。同时可以看到多个 miRNA 表达水平的上调或下调从正常肾上腺皮质到增生再到腺瘤组织呈现逐渐递增或递减性改 变， 即增生或腺瘤组织的形成原因可能同 miRNA 表达改变的程度不同相关。 0049 分析芯片表达谱数。
31、据， 可见在醛固酮瘤中表达丰度较高的 miRNA 包括 miR-1260b， miR-29 家族， 而表达明显降低的 miRNA 有 miR-375 和 miR-7， 其中又以 miR-375 在醛固酮瘤 及正常肾上腺组织中的表达差异最为明显。且在结节样增生组织中这几类 miRNA 的表达丰 度介于醛固酮瘤及正常对照之间， 呈递进关系， 如表 2 所示。 0050 表 2 腺瘤、 增生及正常肾上腺组织 miRNA 表达差异分析 0051 说 明 书 CN 103525905 A 8 7/9 页 9 0052 实施例 3 0053 根据实施例 2 种芯片结果 miRNA 表达差异的分析， 对原发。
32、性醛固酮增多症中腺 瘤、 结节样增生组织及正常肾上腺皮质的 miR-375， miR-7 和 miR-29a/b/c 表达水平进行 real-time PCR 的扩大样本验证 （扩大的样本中包括了原送芯片检测的腺瘤组织 6 例， 结节 样增生组织 6 例及正常肾上腺皮质组织 3 例） 。结果如图 1- 图 5。步骤为 ： 0054 I. 逆转录为 cDNA 0055 逆转录过程操作按 Exiqon Universal cDNA synthesis kit 说明书进行。该逆转 录方式可一次性将所有的 microRNA 逆转录出来以备后续 real-time PCR 使用。 0056 II.Rea。
33、l-time PCR 0057 （1） 引物设计及合成 ： 均由 Exiqon 公司完成。引物包括 ： hsa-miR-375(204362)， hsa-miR-7(204592)，hsa-miR-29a(204698) ： hsa-miR-29b(204679)， hsa-miR-29c(204729)， U6snRNA(203907)。 0058 （2） 引物送到后， 用离心机 4， 以 17000g 转速快速离心放引物的 Eppendorf 管， 将引物收集于管底后， 分别加入不含核酸酶的三蒸水 110l 溶解 LNA Fwd Primer 及 LNA Rev Primer， 涡旋混匀，。
34、 离心收集， 冰上溶解15min后， 混合两管引物， 充分混匀， 并分装后置 于 -20冰箱保存备用。 0059 （3） 取出逆转录好的 cDNA， 在冰上溶解， 按 1:80 的比例以不含核酸酶的三蒸水稀 释 cDNA， 涡旋混匀， 离心收集。 0060 （4） 取出 Real-time PCR 扩增试剂 （SYBR Green master mix， Exiqon） ， 冰上溶解 15min， 避光。上下颠倒混匀试剂， 然后用离心机轻微离心收集后使用。 0061 （5） 配 Real-time PCR 反应液混合液 （反应液配制要在冰上进行） ， 并分装加入到 384 孔板中 ； Real。
35、-time PCR 反应体系Green master mix（2） 5l， 引物 1l， 说 明 书 CN 103525905 A 9 8/9 页 10 加入 cDNA 模板并补足至 10l ； 添加完各组分后， 以塑封膜封板。 0062 （6） 用 3000 转 / 分转速， 离心 3min， 使反应液收集于管底。 0063 （7） 使用 Roche LightCycler480Real-time PCR 扩增仪进行扩增 ： Real-time PCR 反应条件 ： 预变性 95， 10min ； 45 个循环， 95， 10s， 60， 1min ； 变温速度 1.6 /s 0064 （8。
36、）检测结果的分析计算 ： 根据 real-time PCR 的 Ct 值计算标准化后的 Ct 值 （Normalized CT value） 进行组间 microRNA 表达水平的比较。 Ct 为同一样本的目的基 因与内参基因的 Ct 值之差， 即 Ct=Ctgene-CtU6。 Ct 为同一组样本目的基因 Ct 值均值与 同一组样本内参基因 Ct 值均值之差， 即 Ct=Ctgene-CtU6。Ct标化= Ct+ Ct。各组之间 microRNA 表达水平的差异分析使用上述统计量， Ct标化值越大说明该样本中 microRNA 表达 水平越低。 0065 当以标化后的 Ct 值进行组间比较时。
37、可见， 同正常对照组 （17.880.9096） 相比， 醛固酮腺瘤组织中 miR-375 表达的 Ct 值最高 （27.970.2681， p0.0001） ， 结节样增生组 织 miR-375 表达 Ct 值 （25.370.5249） 介于腺瘤及正常对照组之间， 提示 miR-375 在原发 性醛固酮增多症患者病变肾上腺组织中表达均降低， 以在腺瘤组织中更为明显。 与miR-375 表达相类似， miR-7在原醛症患者病变肾上腺组织中表达同样降低 （APA:27.650.2409;Hy perplasia:25.650.5257） ， 腺瘤组织中表达更低 （p0.0001） ， miR-。
38、375 同 miR-7 表达丰度 存在较好的相关性 （r=0.9667， p0.0001） 。 0066 在芯片结果中， miR-29a 在腺瘤组织中的表达较正常对照组升高了 3.51 倍， 然而 在扩大样本验证过程中， 仅看到其在腺瘤组织中的表达有升高趋势 （8.8750.1275） ， 但同 正常对照 （9.0780.1912） 及结节样增生组织 （9.0440.1700） 比较， 差异无统计学意义。 miR-29b 及 miR-29c 在三组中表达水平差异类似， 即相对正常对照组， 在腺瘤组织中两者表 达均明显升高 （miR-29b:9.7780.1248vs11.480.3191,p0。
39、.001 ； miR-29c:6.1600.1 187vs7.3610.2140,p0.001） ， 在结节样增生组织中表达亦有升高 （miR-29b:10.050.1 513vs11.480.3191,p0.001;miR-29c:6.4190.1491vs7.3610.2140,p0.01） ，且 同 腺瘤组织的表达差异有统计学意义。以上结果与 miRNA 表达芯片结果基本一致。 0067 各临床指标参数正态分布的连续变量以均数 标准差 （meansSD） 表示， 非正 态分布的连续变量以中位数 （四分位数） 表示， 分类变量以数量 （百分数） 表示。MicroRNAs real-time。
40、 PCR结果以标化后Ct值表示， 数值变量以均数标准误 （meansSEM） 表示。 本 研究中正态分布的连续变量两组间比较均采用双尾 Student t 检验的统计方法。非正态分 布的连续变量和分类变量两组间比较用 Mann-Whitney U 检验的统计方法。当 p0.05 时， 认为两组之间具有统计学差异。 0068 实施例 4 0069 根据实施例 3 的结果， 对 miR-375 表达水平同原发性醛固酮增多症患者临床资料 相关性分析， miR-375 表达水平在醛固酮腺瘤中同肿瘤大小相关， 结果如表 3。 0070 表 3miR-375 表达水平同原醛症患者临床表型相关性 0071 。
41、说 明 书 CN 103525905 A 10 9/9 页 11 0072 0073 在全部参与研究的 128 例原发性醛固酮增多症患者中， 当以标化后的 Ct 值表示 miR-375 表达水平进行相关性分析时可见， 其 Ct 值同患者血清醛固酮水平呈正相关关系 （r=-0.222， p=0.018） ， 即随着 miR-375 表达水平降低， 患者血清醛固酮水平升高 ； miR-375 表达的Ct值同肾上腺病灶大小呈明显正相关性 （r=0.350， p0.0001） ， 即随着miR-375表达 水平的降低， 肾上腺病灶体积增大。在校正了上述病灶大小的影响下， 在 PA 患者中血清醛 固酮水。
42、平同 miR-375 表达水平仅呈一定相关趋势。而病程、 收缩压、 舒张压、 血浆肾素活性、 ARR、 血钾、 血钠水平在全部原醛症患者中无论是否校正病灶大小均同 miR-375 表达水平无 相关性。 0074 将全部患者进行分组比较， 在 40 例结节样增生患者中， 发现病灶大小同 miR-375 表达水平仅有相关趋势 （p=0.066） ， 而血清醛固酮、 ARR 同 miR-375 标化后 Ct 值呈正相关 （ALDO ： r=-0.394， p=0.019 ； ARR ： r=0.408， p=0.023） ， 即随着miR-375表达水平降低， 患者血 清醛固酮及 ARR 水平均升高。
43、， 当校正结节性增生病灶大小后该相关性消失。余收缩压、 舒张 压、 血肾素活性、 血钾、 血钠水平均与 miR-375 表达水平无相关性。 0075 在醛固酮瘤患者中， 仅发现肿瘤大小同 miR-375 标化后 Ct 值呈正相关 （r=0.312， p=0.004） ， 即随着 miR-375 表达水平降低， 肿瘤直径逐步增大。血钾水平同 miR-375 表达水 平存在一定相关趋势 （p=0.073） ， 但无统计学意义， 且在考虑肿瘤大小的影响后， 该相关趋 势亦消失。余收缩压、 舒张压、 血醛固酮、 血浆肾素活性、 ARR、 血钠指标均与 miR-375 表达水 平无相关性。 0076 由此可见， miR-375 表达水平在醛固酮腺瘤中与肿瘤大小相关， 可用于制备、 筛选 治疗原发性醛固酮增多症引起的腺瘤的药物 ； 或者， 将检测 miR-375 的试剂用于制备醛固 酮瘤的诊断试剂。 说 明 书 CN 103525905 A 11 1/1 页 12 图 1 图 2 图 3 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 103525905 A 12 。