一种发酵法生产番茄红素的方法.pdf

《一种发酵法生产番茄红素的方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种发酵法生产番茄红素的方法.pdf（8页完整版）》请在专利查询网上搜索。

1、(10)申请公布号 CN 103525871 A (43)申请公布日 2014.01.22 CN 103525871 A (21)申请号 201310522440.9 (22)申请日 2013.10.29 C12P 5/02(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (71)申请人 山东祥维斯生物科技有限公司 地址 261061 山东省潍坊市潍坊滨海经济开 发区临港工业园北环路以西 (72)发明人 马兴群 刘雨 宋琦 (74)专利代理机构 上海新天专利代理有限公司 31213 代理人 王巍 (54) 发明名称 一种发酵法生产番茄红素的方法 (57) 摘要 本发明提供了一种发酵法。

2、生产番茄红素的方 法， 该方法采用三孢布拉氏霉菌 （+） 和三孢布拉 氏霉菌 （-） 菌株， 通过斜面培养 ： 在 26-28培养 箱中培养 6-7 天 ； 种子培养 36-46h 后， 发酵培养， 第一次加入甜菜碱于 26-28， 200-250r/min 的 条件下发酵培养 100-120h， 在发酵 42h 时加阻断 剂， 同时第二次加入甜菜碱， 至发酵结束。过滤发 酵液收集湿菌体， 经真空冷冻干燥后得到含番茄 红素的干菌体。本发明加入甜菜碱后能有效促进 菌体的呼吸链系统， 提高菌体的氧消耗速率 ； 同 时能有效的缓解菌体在发酵过程中受到的渗透压 呼吸抑制， 加快氧的传递速率， 降低能耗。

3、 ； 提高了 菌体生长率和番茄红素的含量， 降低了生产成本。 本发明方法操作简单， 甜菜碱无任何毒副作用， 使 用方便、 安全， 适于工业化生产， 有较大的应用价 值。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书6页 (10)申请公布号 CN 103525871 A CN 103525871 A 1/1 页 2 1. 一种发酵法生产番茄红素的方法， 其特征在于， 该方法包括下列步骤 ： 1） 斜面培养 采用 PDA 培养基， 取去皮马铃薯 20g， 切成小块， 加水 1000 毫升煮沸 20 分。

4、钟， 滤去马铃 薯块， 滤液加入 2g 葡萄糖， 0.3g K2HPO4， 0.2g MgSO47H2O， 0.8mg VB1， 2g 琼脂， 溶解后定溶 至 100ml， 倒入试管， 115灭菌 20min， 趁热摆斜面， 制得固体 PDA 培养基 ； 分别取三孢布拉 氏霉菌 （+） 和三孢布拉氏霉菌 （-） 菌株划斜面， 在 26-28培养箱中培养 6-7 天 ； 2） 种子培养 种 子 培 养 基 组 成 为 ：玉 米 粉 30-60g/L, 黄 豆 粉 18-30g/L,KH2P040.5-2g/ L,MgSO4 7H2O0.5-2g/L， VBl0.001-0.02g/L,pH6.5。

5、 ； 种子培养基按 50-80ml 每瓶分装至 4 个 500ml 的三角瓶中， 8 层纱布封口， 115灭菌 20 分钟， 接种时， 三孢布拉氏霉菌 （+） 和三孢 布拉氏霉菌 （-） 斜面试管各用 10ml 无菌生理盐水洗下孢子， 经玻璃珠打散并过滤后制成孢 子悬液 ； 三孢布拉氏霉菌 （+） 菌孢子悬液每次取 1ml 接入 1 瓶种子培养基中 ； 三孢布拉氏霉 菌 （-） 菌孢子悬液每次取 4ml， 依次接入 3 瓶种子培养基中， 在 26-28， 180-200r/min 的条 件下培养 36-46h， 分别得到 1 瓶三孢布拉氏霉菌 （+） 菌和 3 瓶三孢布拉氏霉菌 （-） 菌种子。

6、 液 ； 3） 发酵培养 发 酵 培 养 基 组 成 为 ： 玉 米 粉 15-25g/L, 黄 豆 粉 35-50g/L, 棉 籽 油 60-100ml/ L,KH2P043-7g/L,MgSO47H2O0.1-2g/L， VBl0.005-0.1g/L,pH6.5 ； 发酵培养基按 40-60ml 每 瓶分装至500ml的三角瓶中， 8层纱布封口， 115灭菌20分钟， 将种子液发酵培养得到的三 孢布拉氏霉菌 “+” 菌种培养液和 “-” 菌种培养液以 1:3 的比例混合得到混合种子液， 含发 酵培养基的三角瓶每瓶分别转接 5-10ml 的混合种子液， 含发酵培养基的三角瓶中第一次 加入甜。

7、菜碱， 于 26-28， 200-250r/min 的条件下发酵培养 100-120h， 发酵 42h 时三角瓶中 加阻断剂， 同时第二次加入甜菜碱， 发酵结束， 用纱布过滤发酵液收集湿菌体， 经真空冷冻 干燥后得到含番茄红素的干菌体。 2. 根据权利要求 1 所述的一种发酵法生产番茄红素的方法， 其特征在于， 所述步骤 （3） 甜菜碱选自一水甜菜碱、 无水甜菜碱或盐酸盐甜菜碱。 3. 根据权利要求 2 所述的一种发酵法生产番茄红素的方法， 其特征在于， 所述步骤 （3） 甜菜碱为盐酸盐甜菜碱。 4. 根据权利要求 1 所述的一种发酵法生产番茄红素的方法， 其特征在于， 所述步骤 （3） 第一。

8、次甜菜碱的加入量为发酵培养基接种前发酵培养基体积的 0.05-7g/L ； 第二次甜菜碱 的加入量为发酵 42h 时发酵液体积的 0.1-3.5g/L。 5. 根据权利要求 4 所述的一种发酵法生产番茄红素的方法， 其特征在于， 所述步骤 （3） 第一次甜菜碱的加入量为发酵培养基接种前发酵培养基体积的 1.5-4.5g/L ； 第二次甜菜 碱的加入量为发酵 42h 时发酵液体积的 1-2g/L。 6. 根据权利要求 1 所述的一种发酵法生产番茄红素的方法， 其特征在于， 所述步骤 （3） 阻断剂为烟碱或咪唑， 阻断剂的加入量为发酵液体积的 0.7-1.0mg/ml。 7. 根据权利要求 1 所。

9、述的一种发酵法生产番茄红素的方法， 其特征在于， 所述步骤 （3） 阻断剂为咪唑， 加入量为发酵液体积的 0.8mg/ml。 权 利 要 求 书 CN 103525871 A 2 1/6 页 3 一种发酵法生产番茄红素的方法 技术领域 0001 本发明涉及生物工程， 具体涉及发酵工程， 尤其涉及一种发酵法生产番茄红素的 方法。 背景技术 0002 番茄红素是一种类胡萝卜素， 作为植物所含的一种天然色素， 主要存在于茄科植 物西红柿的成熟果实中。 研究证明番茄红素具有提高人体免疫力、 抗癌、 抗氧化、 降血脂、 保 护皮肤等功效。 随着人们越来越注重绿色、 健康， 番茄红素不断受到人们的广泛关注。

10、， 但是， 作为功能性天然色素的番茄红素， 人类自身不能合成， 需通过膳食等方式补充。据美国 CMR （客户管理关系） 国际公司预测， 番茄红素产品销售将年增 35%， 预计两三年内到达 200 亿美 元的销售量， 世界跨国医药巨头和国内的医药巨头们纷纷进军番茄红素产业。 0003 当前番茄红素的生产方法主要有天然提取、 化学合成、 微生物发酵等。目前， 已证 实天然番茄红素比化学合成的番茄红素更易吸收， 而且， 化学合成化学物残留的存在， 因 此， 近年来已转向天然产品的开发。从植物原料中提取天然番茄红素易受到条件和产率限 制， 而微生物发酵法生产天然番茄红素从品质、 技术、 资源、 成本及。

11、环境等因素考虑均优于 上述两种方法， 因而更具应用前景。目前利用微生物发酵法生产番茄红素的不足之处是微 生物不能高水平的积累番茄红素， 导致发酵产率低、 生产成本较高。 利用基因工程菌生产番 茄红素尚处于实验室阶段， 距离工业化生产尚有很大差距， 因而， 工业上利用发酵促进剂等 方式来优化发酵条件， 仍是提高番茄红素产量的主要方式。 0004 目前工业上主要是利用三孢布拉霉菌发酵生产番茄红素。 三孢布拉霉菌是一种高 嗜氧菌， 发酵过程对氧的需求很大 ； 所使用的培养基固形物含量高、 粘度大， 使菌体所处外 部环境的渗透压增加， 而且培养基中还含有 8% 左右的植物油 （为代谢提供双键） ， 致。

12、使发酵 系统的溶氧速率较低 ； 同时生产过程中往往受到转速等因素的影响菌体聚集成团， 导致氧 呼吸受阻， 造成代谢异常、 生物量和代谢产物量降低。为改进此缺陷， 已有专利报道在发酵 培养基中加入液态烷烃、 活性炭来增加氧气含量 （CN101555490A） 。 但是， 液态烷烃添加浓度 过大会对菌体造成伤害， 后期分离提取也要经过脱毒处理， 操作繁琐。 添加活性炭也存在增 加了设备动力损耗、 易堵塞管道、 前期处理及后提前工序繁琐等问题。 0005 甜菜碱， 又名 N,N,N- 三甲基甘氨酸， 是一种季胺型水溶性生物碱。因最初从甜菜 中提取而得名甜菜碱， 纯品为白色片状结晶， 有甜味， 易吸潮。

13、， 可速溶于水， 易被消化吸收， 使用安全， 无毒副作用。大量的研究已经证明， 在微生物发酵中， 甜菜碱除了可以作为甲基 供体， 参与甲基化反应以及能提高代谢途径中关键酶的酶活， 来加快菌体生长速率及代谢 物产量外， 还能调节细胞膜透性， 促进微生物的呼吸链系统， 能显著提高菌体的呼吸特性。 此外， 甜菜碱作为广泛应用的渗透压保护剂， 能够调节细胞内外渗透压， 降低高渗透压导致 的呼吸抑制， 加快氧气传递速率， 降低能耗， 因此是一种优良的发酵助剂。 0006 甜菜碱作为发酵助剂的作用已经得到广泛的证实和应用。 赵琳琳等研究甜菜碱对 脱氮假单胞杆菌发酵产VB12的影响证实， 在脱氮假单胞菌产V。

14、B12的发酵过程中， 甜菜碱显 说 明 书 CN 103525871 A 3 2/6 页 4 著提升了 VB12 的产量， 其原因， 一是甜菜碱对菌体的氧利用有快速的刺激作用， 缓解高渗 透压对细胞呼吸代谢的刺激作用 ； 二是甜菜碱能提高VB12合成途径关键酶的活性。 甜菜碱 对各种氨基酸的发酵的影响在 CN101235401 等专利中得到证实。因而， 如何利用甜菜碱提 高三孢布拉氏霉菌液体深层次发酵生产番茄红素的产量是关注的热点。 发明内容 0007 本发明所要解决的技术问题在于提高三孢布拉氏霉菌液体深层次发酵生产番茄 红素的产量， 研究设计加入甜菜碱的方法。 0008 本发明提供了一种发酵。

15、法生产番茄红素的方法。具体地， 提供了一种加入一定数 量的甜菜碱， 发酵法生产番茄红素的方法。 0009 本发明方法包括下列步骤 ： 0010 1） 斜面培养 0011 采用 PDA 培养基， 取去皮马铃薯 20g， 切成小块， 加水 1000 毫升煮沸 20 分钟， 滤去 马铃薯块， 滤液加入 2g 葡萄糖， 0.3g K2HPO4， 0.2g MgSO47H2O， 0.8mg VB1， 2g 琼脂， 溶解后 定溶至 100ml， 倒入试管， 115灭菌 20min， 趁热摆斜面， 制得固体 PDA 培养基 ； 分别取三孢 布拉氏霉菌 （+） 和三孢布拉氏霉菌 （-） 菌株划斜面， 在 26。

16、-28培养箱中培养 6-7 天 ； 0012 2） 种子培养 0013 种 子 培 养 基 组 成 为 ： 玉 米 粉 30-60g/L, 黄 豆 粉 18-30g/L,KH2P040.5-2g/ L,MgSO4 7H2O0.5-2g/L， VBl0.001-0.02g/L,pH6.5 ； 种子培养基按 50-80ml 每瓶分装至 4 个 500ml 的三角瓶中， 8 层纱布封口， 115灭菌 20 分钟， 接种时， 三孢布拉氏霉菌 （+） 和三孢 布拉氏霉菌 （-） 斜面试管各用 10ml 无菌生理盐水洗下孢子， 经玻璃珠打散并过滤后制成孢 子悬液 ； 三孢布拉氏霉菌 （+） 菌孢子悬液每次。

17、取 1ml 接入 1 瓶种子培养基中 ； 三孢布拉氏霉 菌 （-） 菌孢子悬液每次取 4ml， 依次接入 3 瓶种子培养基中， 在 26-28， 180-200r/min 的条 件下培养 36-46h， 分别得到 1 瓶三孢布拉氏霉菌 （+） 菌和 3 瓶三孢布拉氏霉菌 （-） 菌种子 液 ； 0014 3） 发酵培养 0015 发酵培养基组成为 ： 玉米粉 15-25g/L, 黄豆粉 35-50g/L, 棉籽油 60-100ml/ L,KH2P043-7g/L,MgSO47H2O0.1-2g/L， VBl0.005-0.1g/L,pH6.5 ； 发酵培养基按 40-60ml 每 瓶分装至50。

18、0ml的三角瓶中， 8层纱布封口， 115灭菌20分钟， 将种子液发酵培养得到的三 孢布拉氏霉菌 “+” 菌种培养液和 “-” 菌种培养液以 1:3 的比例混合得到混合种子液， 含发 酵培养基的三角瓶每瓶分别转接 5-10ml 的混合种子液， 含发酵培养基的三角瓶中第一次 加入甜菜碱， 于 26-28， 200-250r/min 的条件下发酵培养 100-120h， 发酵 42h 时三角瓶中 加阻断剂， 同时第二次加入甜菜碱， 发酵结束， 过滤发酵液收集湿菌体， 经真空冷冻干燥后 得到三孢布拉氏霉菌干菌体。 0016 本发明方法所述步骤 （3） 甜菜碱选自一水甜菜碱、 无水甜菜碱或盐酸盐甜菜碱。

19、， 优 选盐酸盐甜菜碱。 0017 所述步骤 （3）第一次甜菜碱的加入量为发酵培养基接种前发酵培养基体积 的 0.05-7g/L， 优选 1.5-4.5g/L ； 第二次甜菜碱的加入量为发酵 42h 时发酵液体积的 0.1-3.5g/L， 优选 1-2g/L。 说 明 书 CN 103525871 A 4 3/6 页 5 0018 所述步骤 （3） 阻断剂为烟碱或咪唑， 阻断剂的加入量为发酵 42h 时发酵液体积的 的 0.7-1.0mg/ml。优选阻断剂为咪唑， 加入量为发酵 42h 时发酵液体积的 0.8mg/ml。 0019 本发明方法使用的菌种来源 ： 0020 本发明生产番茄红素的菌。

20、种为三孢布拉氏霉菌 （Blakeslea trispora） ,分三孢布 拉氏霉菌 “+” 和三孢布拉氏霉菌 “-” 两种菌株， 购自美国模式培养物集存库 （ATCC） , 菌号 为 14059（+） 和 14060（-） 。 0021 HPLC 测定本发明得到的番茄红素含量比不加甜菜碱的对照组提高 72%-95%。另外 选择在发酵 42h 第二次加甜菜碱， 是经过多次试验选择确定的， 并且在加阻断剂的同时加 入， 更利于操作。 0022 本发明的效果在于 ： 加入甜菜碱后能有效促进菌体的呼吸链系统， 提高菌体的氧 消耗速率 ； 同时能有效的缓解菌体在发酵过程中受到的渗透压呼吸抑制， 加快氧的。

21、传递速 率， 降低能耗 ； 而且甜菜碱本身是一种优良的甲基供体， 能有效的提供甲基参与代谢过程中 的甲基化反应， 从而促进并加快了菌体代谢反应速率， 提高了菌体生长率和番茄红素的产 量， 降低了生产成本。 本发明工艺操作简单， 而且甜菜碱本身是由生物体在逆境条件下产生 的保护剂， 无任何毒副作用， 使用安全。本发明方法适于工业化生产， 有较大的应用价值。 具体实施方式 0023 以下实施例使用的菌种来源 ： 0024 本发明生产番茄红素的菌种为三孢布拉氏霉菌 （Blakeslea trispora） ,分三孢布 拉氏霉菌 “+” 和三孢布拉氏霉菌 “-” 两种菌株， 购自美国模式培养物集存库 。

22、（ATCC） , 菌号 为三孢布拉氏霉菌） 14059（+） 和三孢布拉氏霉菌 14060（-） 。 0025 实施例 1 0026 种子培养 0027 种子培养基组成为 ： 玉米粉 47g/L, 黄豆粉 23g/L,KH2P040.5g/L,MgSO4 7H2O0.5g/ L， VBl0.01g/L,pH6.5。种子培养基按 60ml 每瓶分装至 4 个 500ml 的三角瓶中， 8 层纱布封 口， 115灭菌 20 分钟。接种时， 三孢布拉氏霉菌 （+） 菌和三孢布拉氏霉菌 （-） 菌斜面每支 试管统一用 10ml 无菌生理盐水洗下孢子， 经玻璃珠打散并过滤后制成孢子悬液 ； 三孢布拉 氏。

23、霉菌 （+） 菌孢子悬液每次取 1ml 接入 1 瓶种子培养基中 ； 三孢布拉氏霉菌 （-） 菌孢子悬液 每次取4ml， 依次接入3瓶种子培养基中。 在26-28， 180-200r/min的条件下培养36-44h， 得到 1 瓶三孢布拉氏霉菌 （+） 菌种子液和 3 瓶三孢布拉氏霉菌 （-） 菌种子液。 0028 发酵培养 0029 发酵培养基组成为 ： 玉米粉 18g/L, 黄豆粉 42.5g/L, 棉籽油 85ml/L,KH2P045.5g/ L,MgSO47H2O1g/L， VBl0.02g/L,pH6.5。发酵培养基按 50ml 每瓶分装至 6 个 500ml 的三 角瓶中， 8 层。

24、纱布封口， 115灭菌 20 分钟。将种子液发酵培养得到的三孢布拉氏霉菌 （+） （-） 菌种培养液以 1:3 的比例混合得到混合种子液。6 个含发酵培养基的三角瓶每瓶分别 转接 8ml 的混合种子液， 其中 3 个含发酵培养基的三角瓶中按 1.5g/L 的量加入一水甜菜碱 0.075g， 作为实验组。 另外3个三角瓶不加甜菜碱， 作为空白组。 分别于26-28， 200-250r/ min 的条件下发酵培养 120h 结束。发酵 42h 时加入 0.046g 咪唑作为阻断剂 , 同时实验组 的 3 个三角瓶中按 1.5g/L 的量第二次加入一水甜菜碱 0.087g。 说 明 书 CN 103。

25、525871 A 5 4/6 页 6 0030 含量测定 0031 番茄红素含量测定 （HPLC 法） 0032 （含量测定参考文献 ： 王航等。发酵法生产番茄红素培养方法的改进及优化。北京 工业大学学报， 2006,33（5） ： 38-40） 0033 发酵 120h 结束后， 用纱布过滤发酵液收集湿菌体， 经真空冷冻干燥后得到含番茄 红素的干菌体。用研磨法粉碎干菌体， 准确称取 0.1g 干菌粉， 加入 50ml 石油醚静置萃取直 至菌体无色为止， 取 5ml 经过滤的萃取液用高效液相色谱法测定番茄红素的含量。其中， 实 验组番茄红素的平均含量为 1.13g/L， 空白组为 0.654g。

26、/L， 即添加甜菜碱的实验组的番茄 红素含量比对照组提高 72.8%。 0034 对比例 1 ： 0035 种子培养 （同实施例 1） 0036 发酵培养 0037 同实施例 1。不同之处在于， 第二次添加甜菜碱的时间不同。实施例 1 在发酵 42h 加阻断剂的同时， 第二次添加甜菜碱。而对比例 1 在 42h 时只加入阻断剂 , 在第 60h 时第 二次添加甜菜碱， 即发酵 60h 时， 实验组的 3 个三角瓶中按 1.5g/L 的量第二次加入一水甜 菜碱 0.087g。 0038 含量测定 0039 测定方法同实施例 1。结果 ： 实验组番茄红素的平均含量为 1.03g/L， 空白组为 0。

27、.653g/L， 即添加甜菜碱的实验组的番茄红素含量比对照组提高 57.7%。 0040 对比例 2 ： 0041 种子培养 （同实施例 1） 0042 发酵培养 0043 同实施例 1。不同之处在于， 第二次添加甜菜碱的时间不同。实施例 1 在发酵 42h 加阻断剂的同时， 第二次添加甜菜碱。而对比例 1 在 42h 时只加入阻断剂 , 本实施例在第 72h时第二次添加甜菜碱， 即发酵72h时， 实验组的3个三角瓶中按1.5g/L的量第二次加入 一水甜菜碱 0.087g。 0044 含量测定 0045 测定方法同实施例 1。结果 ： 实验组番茄红素的平均含量为 1.01g/L， 空白组为 0。

28、.653g/L， 即添加甜菜碱的实验组的番茄红素含量比对照组提高 54.7%。 0046 通过对比例1和2说明 ： 本发明方法选择在第42h时第二次添加甜菜碱， 番茄红素 含量可提高 72.8% ； 优于其他时间的第二次添加甜菜碱。 0047 实施例 2 ： 0048 种子培养 （同实施例 1） 0049 发酵培养 0050 发酵培养基组成为 ： 玉米粉 18g/L, 黄豆粉 42.5g/L, 棉籽油 85ml/L,KH2P045.5g/ L,MgSO47H2O1g/L， VBl0.02g/L,pH6.5。发酵培养基按 50ml 每瓶分装至 6 个 500ml 的三 角瓶中， 8 层纱布封口，。

29、 115灭菌 20 分钟。将种子液发酵培养得到的三孢布拉氏霉菌 （+） 和三孢布拉氏霉菌 （-） 菌种培养液以 1:3 的比例混合得到混合种子液。6 个含发酵培养基 的三角瓶每瓶分别转接 8ml 的混合种子液， 其中 3 个含发酵培养基的三角瓶中按 3g/L 的 说 明 书 CN 103525871 A 6 5/6 页 7 量加入一水甜菜碱 0.15g， 作为实验组。另外 3 个三角瓶不加甜菜碱， 作为空白组。分别于 26-28， 200-250r/min 的条件下发酵培养 120h 结束。发酵 42h 时加入 0.046g 咪唑作为阻 断剂 , 同时实验组的 3 个三角瓶不添加甜菜碱。 00。

30、51 含量测定 0052 发酵结束后， 用纱布过滤发酵液收集湿菌体， 经真空冷冻干燥后得到含番茄红素 的干菌体。用研磨法粉碎干菌体， 准确称取 0.1g 干菌粉， 加入 50ml 石油醚静置萃取直至菌 体无色为止， 取 5ml 经过滤的萃取液用高效液相色谱法测定番茄红素的含量。其中， 实验组 番茄红素的平均含量为 0.997g/L， 空白组为 0.657g/L， 即添加甜菜碱的实验组的番茄红素 含量比对照组提高 51.2%。 0053 实施例 3 ： 0054 种子培养 （同实施例 1） 0055 发酵培养 0056 发酵培养基组成为 ： 玉米粉 18g/L, 黄豆粉 42.5g/L, 棉籽油。

31、 85ml/L,KH2P045.5g/ L,MgSO47H2O1g/L， VBl0.02g/L,pH6.5。发酵培养基按 50ml 每瓶分装至 6 个 500ml 的三角 瓶中， 8 层纱布封口， 115灭菌 20 分钟。将种子液发酵培养得到的三孢布拉氏霉菌 （+） 和 三孢布拉氏霉菌 （-） 菌种培养液以 1:3 的比例混合得到混合种子液。6 个含发酵培养基的 三角瓶每瓶分别转接 8ml 的混合种子液， 其中 3 个含发酵培养基的三角瓶中按 3g/L 的量 加入盐酸盐甜菜碱 0.15g， 作为实验组。另外 3 个三角瓶不加甜菜碱， 作为空白组。分别于 26-28， 200-250r/min 。

32、的条件下发酵培养 120h 结束。发酵 42h 时加入 0.046g 咪唑作为阻 断剂 , 同时实验组的 3 个三角瓶中按 1.5g/L 的量第二次加入盐酸盐甜菜碱 0.087g。 0057 含量测定 0058 发酵结束后， 用纱布过滤发酵液收集湿菌体， 经真空冷冻干燥后得到含番茄红素 的干菌体。用研磨法粉碎干菌体， 准确称取 0.1g 干菌粉， 加入 50ml 石油醚静置萃取直至菌 体无色为止， 取 5ml 经过滤的萃取液用高效液相色谱法测定番茄红素的含量。其中， 实验组 番茄红素的平均含量为 1.36g/L， 空白组为 0.657g/L， 即添加甜菜碱的实验组的番茄红素 含量比对照组提高 。

33、1.07 倍。 0059 实施例 4 ： 0060 种子培养 （同实施例 1） 0061 发酵培养 0062 发酵培养基组成为 ： 玉米粉 18g/L, 黄豆粉 42.5g/L, 棉籽油 85ml/L,KH2P045.5g/ L,MgSO47H2O1g/L， VBl0.02g/L,pH6.5。发酵培养基按 50ml 每瓶分装至 6 个 500ml 的三角 瓶中， 8 层纱布封口， 115灭菌 20 分钟。将种子液发酵培养得到的三孢布拉氏霉菌 （+） 和 三孢布拉氏霉菌 （-） 菌种培养液以 1:3 的比例混合得到混合种子液。6 个含发酵培养基的 三角瓶每瓶分别转接 8ml 的混合种子液， 其中。

34、 3 个含发酵培养基的三角瓶中按 3g/L 的量 加入盐酸盐甜菜碱 0.15g， 作为实验组。另外 3 个三角瓶不加甜菜碱， 作为空白组。分别于 26-28， 200-250r/min 的条件下发酵培养 120h 结束。发酵 42h 时加入 0.046g 咪唑作为阻 断剂 , 同时实验组的 3 个三角瓶中按 3g/L 的量第二次加入盐酸盐甜菜碱 0.174g。 0063 含量测定 0064 发酵结束后， 用纱布过滤发酵液收集湿菌体， 经真空冷冻干燥后得到含番茄红素 说 明 书 CN 103525871 A 7 6/6 页 8 的干菌体。用研磨法粉碎干菌体， 准确称取 0.1g 干菌粉， 加入 。

35、50ml 石油醚静置萃取直至菌 体无色为止， 取 5ml 经过滤的萃取液用高效液相色谱法测定番茄红素的含量。其中， 实验组 番茄红素的平均含量为 1.20g/L， 空白组为 0.659g/L， 即添加甜菜碱的实验组的番茄红素 含量比对照组提高 82.1%。 0065 实施例 5 ： 0066 种子培养 （同实施例 1） 0067 发酵培养 0068 发酵培养基组成为 ： 玉米粉 18g/L, 黄豆粉 42.5g/L, 棉籽油 85ml/L,KH2P045.5g/ L,MgSO47H2O1g/L， VBl0.02g/L,pH6.5。发酵培养基按 50ml 每瓶分装至 6 个 500ml 的三角 。

36、瓶中， 8 层纱布封口， 115灭菌 20 分钟。将种子液发酵培养得到的三孢布拉氏霉菌 （+） 和 三孢布拉氏霉菌 （-） 菌种培养液以 1:3 的比例混合得到混合种子液。6 个含发酵培养基的 三角瓶每瓶分别转接 8ml 的混合种子液， 其中 3 个含发酵培养基的三角瓶中按 4.5g/L 的量 加入无水甜菜碱 0.225g， 作为实验组。另外 3 个三角瓶不加甜菜碱， 作为空白组。 。分别于 26-28， 200-250r/min 的条件下发酵培养 120h 结束。发酵 42h 时加入 0.046g 咪唑作为阻 断剂 , 同时实验组的 3 个三角瓶中按 1.5g/L 的量第二次加入无水甜菜碱 0.087g。 0069 含量测定 0070 发酵结束后， 用纱布过滤发酵液收集湿菌体， 经真空冷冻干燥后得到干菌体。 用研 磨法粉碎干菌体， 准确称取 0.1g 干菌粉， 加入 50ml 石油醚静置萃取直至菌体无色为止， 取 5ml经过滤的萃取液用高效液相色谱法测定番茄红素的含量。 其中， 实验组番茄红素的平均 含量为 1.29g/L， 空白组为 0.661g/L， 即添加甜菜碱的实验组的番茄红素含量比对照组提 高 95.2%。 说 明 书 CN 103525871 A 8 。