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以可编码蛋白质的外源DNA序列或能够改变可编码蛋白质之内生基因表达的外源DNA序列及可编码谷氨酰胺合成酶的外源DNA序列转染谷氨酰胺营养缺陷型人类细胞，其中这些外源DNA序列位于一个或多个DNA构建物上，该转染的细胞能够产生该蛋白质及能够生长在无谷氨酰胺的培养基中。

1.  一种在谷氨酰胺营养缺陷型细胞中用GS作为可选择标记，提高被编码谷氨酰胺合成酶的外源DNA序列转染的细胞中糖基化蛋白的唾液酸化和/或N-多醣电荷的方法。

2.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述被转染的细胞能产生所述蛋白质，从所述被转染的细胞中回收所述糖基化蛋白。

3.  一种在谷氨酰胺营养缺陷型细胞中用GS作为可选择标记，通过提高定义为Z数字的N-多醣电荷以增强糖基化蛋白产物的质量的方法，所述Z数字与活体内给予的治疗上糖蛋白质的清除速率相关。

能够产生蛋白质及能够在无谷氨酰胺的培养基上生长的 谷氨酰胺营养缺陷型人类细胞
本申请是2003.01.17提交的申请号为03802413.6(PCT/EP03/00454)，名为能够“产生蛋白质及能够在无谷氨酰胺的培养基上生长的谷氨酰胺营养缺陷型人类细胞”的发明专利申请的分案申请。
本发明是关于新颖的能够产生蛋白质和能够生长在无谷氨酰胺的培养基中的谷氨酰胺营养缺陷型人类细胞。此外，其是关于新颖的产生蛋白质的方法和关于在谷氨酰胺营养缺陷型人类细胞中把谷氨酰胺合成酶(GS)当作可选择标记的用途。
由哺乳动物细胞培养所产生的蛋白质是用来提供治疗和诊断应用的蛋白质。现今，哺乳动物细胞培养是用于人类和动物医药之许多重要蛋白质的较佳来源，尤其那些相当大的、复杂的和糖基化的(N.B.Finter等，在大规模哺乳动物细胞培养技术，1990，A.S.Lubiniecki编，Marcel Dekker，Inc.，纽约)。
例如，藉细胞培养产生人类蛋白质红血球生成素(EPO)已在WO 93/09222中描述。使用以可编码人类EPO外源基因转染的人类纤维组织母细胞，人类EPO已获得可观的比生成速率。在进一步产生人类EPO的方法(WO 94/12650)，是使用以能够活化内生编码的EPO之DNA序列转染的人类纤维肉瘤细胞系HT1080。类似的方法已于WO99/09268中描述。永生的(Immortalised)人类细胞如Namalwa、Hela S3及HT 1080细胞用能够活化内生编码的EPO之DNA序列转染。
描述于WO 93/09222、WO 94/12650及WO 99/09268用来产生人类EPO的细胞系都在含有谷氨酰胺的培养基中培养。这是不利的，因为当谷氨酰胺被培养的细胞当作能量基质时，会产生氨这种代谢产物，其具有细胞毒性及会抑制细胞生长。再者，由于它在细胞高尔基体内对pH的影响，而会抑制蛋白质糖基化。
产生大量组织血浆素原活化剂(一种糖基化蛋白质)已在WO 87/04462中描述。GS在其中已被用来作为放大是统，在谷氨酰胺原养型中国仓鼠卵巢(CHO)细胞用于共放大可编码组织血浆素原活化剂(tPA)的基因，其通过以可编码GS的基因转染细胞。然而，如同在EP-A 148 605发现的，用CHO细胞来产生糖基化的人类蛋白质是不利的。由CHO细胞合成的蛋白质其平均碳水化合物成分会与自然生成的糖基化人类蛋白质有所不同，这是因为人类细胞含有α2.3唾液酸转移酶及α2.6唾液酸转移酶。CHO细胞只具有α2.3唾液酸转移酶，所以不能产生α2.6端唾液酸与寡糖部分的键结，CHO细胞缺乏硫化碳水化合物结构的酵素，CHO细胞虽然有α1-6岩藻糖基转移酶(附着中心的岩藻糖残基)，亦缺乏α1-3岩藻糖基转移酶(附着末端的岩藻糖残基)。人类细胞则具有两者岩藻糖基转移酶(Cumming D.A.，1991，Glycobiology卷1，No.2，115-130，Jenkins N.及Curling E.M.A.，1994，enzyme and Micorbial Technology，卷16，354-364；Lee等，1989，Journal of Biological Chemistry，卷264，13848-13855)。所以，由CHO细胞合成之糖基化的蛋白质不会有希望得到的特征，例如如于人类细胞产生的活体内生物活性。
在WO 89/10404中，报告了制造骨髓瘤细胞例如鼠融合瘤、鼠浆细胞瘤细胞及大鼠融合瘤细胞谷氨酰胺独立的方法，其藉由以GS转化他们。其进一步证明GS可以用来共放大可编码免疫球蛋白分子轻及重链的基因及用来共放大在骨髓瘤细胞系中可编码纤维蛋白分解酵素的基因。然而，啮齿类细胞系具有缺点，即以N-乙醇酰基神经氨酸残基的附着代替N-乙酰神经氨酸、无法进行硫化及α1.3半乳糖转移酶的存在。在啮齿类细胞中合成之糖蛋白的寡糖结构因此可以在人类产生免疫性。
本发明之目的是提供一种改进的方法，其不具有用于产生蛋白质时的上述缺点(尤其当产生糖蛋白时)，及可获得高蛋白质效价。
利用权利要求1所述的新颖的谷氨酰胺营养缺陷型人类细胞和权利要求7所述的新颖的方法，可以达成此目的。
根据本发明，可得到谷氨酰胺营养缺陷型人类细胞，所述细胞用(第一)可编码蛋白质之外源DNA序列或能够改变可编码蛋白质之内生基因表达的外源DNA序列转染，及进一步以(第二)可编码谷氨酰胺合成酶(GS)(较佳的为哺乳动物GS)之外源DNA序列转染，其中这些外源DNA序列位于一或一个以上DNA构建物，该转染的细胞能够产生该蛋白质及能够生长在无谷氨酰胺的培养基中。
图1显示细胞系R223悬浮培养于无血清培养基之适应作用的细胞浓度图，经由重复连续的次培养。
图2显示HT1080细胞悬浮培养于无血清培养基之适应作用概要。
图3显示细胞系HT1080悬浮培养于无血清培养基之适应作用的细胞浓度图，经由重复连续的次培养。
图4显示从GS转染子3E10及从无转染的R223细胞系中免疫纯化的EPO之IEF分析，其是生长在产业高密度生长培养基。泳道2：收集的(收集)3E10；泳道3：3E10峰；泳道4：无转染的R223细胞系峰；泳道5：收集的无转染的R223细胞系。
图5显示R223细胞系之GS-R223转染子3E10及从无转染的R223细胞系免疫纯化的EPO之IEF分析，生长在传统的Iscove培养基。泳道4：自添加谷氨酰胺的Iscove培养基收集的无转染的R223细胞系；泳道5：自无谷氨酰胺的Iscove培养基收集的GS-223细胞系3E10。
图6显示了图5所示凝胶泳道4从顶部到底部光密度扫描的色谱图。
图7显示了图5所示凝胶泳道5从顶部到底部光密度扫描的色谱图。
″可编码蛋白质的外源DNA序列″或″能够改变可编码蛋白质之内生基因表达的外源DNA序列″及″可编码GS的外源DNA序列″通常位于DNA构建物上，例如表达载体或感染性载体。质体可以用来作为表达载体。作为感染性载体则可以使用如反转录病毒、泡疹病毒、腺病毒、腺病毒伴随病毒、流行性腮腺炎病毒及脊髓灰质炎病毒载体。较佳的为表达载体，尤其使用质体。
″可编码蛋白质的外源DNA序列″可以包括额外序列，例如调控序列如启动子及/或增强子、多聚腺苷酸化位点及剪接接头，通常用于表达外源基因或可以包括额外一或多个分开的靶向性序列及视需要的可编码可选择标记之DNA(如WO 93/09222中所描述)。
″能够改变可编码蛋白质之内生基因表达的外源DNA序列″可以包括外源DNA序列，其不编码蛋白质的基因产物，但可编码部分该基因产物(如外显子)，及可以包括额外序列，例如调控序列及剪接接头，通常用于表达外源DNA序列。他们可以进一步包括靶向性序列及视需要的可编码可选择标记之DNA(如WO 93/09222中所描述)。
通常，″能够改变可编码蛋白质之内生基因表达的外源DNA序列″是在转染进细胞后插入细胞的染色体DNA。同源重组或靶向性是在此用来取代或使与含有调控序列之内生基因相关的调控区域失去作用。作为调控序列可以使用如启动子及/或增强子，其造成基因表达量高于相对应之无转染的细胞(如WO 93/09222所描述)，合适的启动子可以是可调控的或持续表达的启动子。合适的启动子可以是强启动子，其是取决于所使用的细胞系，如人类巨细胞病毒主要立即早期启动子(hCMV-MIE)、SV 40早期及晚期启动子、其他腺病毒启动子、任何多瘤病毒或乳多泡病毒早期及晚期启动子、干扰素α1启动子、鼠金属硫蛋白启动子、Rous肉瘤病毒长端重复启动子、β-珠蛋白启动子、伴白蛋白启动子、卵白蛋白启动子、鼠β-珠蛋白启动子及人类β-珠蛋白启动子。
根据本发明的″可编码GS之外源DNA序列″可以受强启动子及弱启动子的控制，如果外源DNA序列是单单需要表达可编码GS的基因，则使用强启动子，当外源DNA序列是作为可选择标记，以及若GS是用于放大作用时，则使用弱启动子。合适的启动子可以是可调控的或持续表达的启动子。启动子可以选择，例如，GS是在足够使转染的细胞生长的浓度中表达，但细胞培养时并不产生高量谷氨酰胺代谢产物氨，通常不大于4mM，较佳的不大于2mM，更佳的少于2mM氨。
″可选择标记″提供了可选择的表现型，使鉴别及分离受体细胞成为可能。GS可以在本发明用来当作可选择标记，以筛选出成功转染的谷氨酰胺营养缺陷型人类细胞，其并入和表达可编码GS的外源DNA序列。
根据所用的细胞系，强启动子可以是如hCMV-MIE、SV 40早期及晚期启动子、其他腺病毒启动子、任何多瘤病毒或乳多泡病毒早期及晚期启动子、干扰素α1启动子、鼠金属硫蛋白启动子、Rous肉瘤病毒长端重复启动子、β-珠蛋白启动子、伴白蛋白启动子、卵白蛋白启动子、鼠β-珠蛋白启动子及人类β-珠蛋白启动子。
根据所用的细胞系，弱启动子可以是如鼠白血病病毒长端重复、单纯疹病毒胸苷激酶及鼠乳房肿瘤病毒长端重复，较佳的，可编码GS的基因是在强启动子控制下，更佳的是在hCMV-MIE启动子控制下。一项可能的具体实例，一种来自仓鼠之可放大的哺乳动物GS序列及其在哺乳动物细胞中作为可选择标记的用途已为该项技术所熟知，且如WO 87/04462、WO 91/06657及WO 89/01036所描述；本发明实施例使用此仓鼠GS表达单元及个别的筛选方法如参考文献所提及。
″可编码蛋白质之外源DNA序列″或″能够改变可编码蛋白质之内生基因表达的外源DNA序列″及″可编码GS之外源DNA序列″位于一个或多个DNA构建物上，较佳的，这些外源DNA序列位于多于一个，更佳的位于两个DNA构建物上。若这些外源DNA序列位于一个DNA构建物上，他们可能功能上相组合，例如他们的表达会受同一个调控序列，如启动子及/或增强子(如WO 89/10404所描述)驱策。
谷氨酰胺营养缺陷型人类细胞系指所有不表达GS或表达GS很差的人类细胞，所以能够生长在含有谷氨酰胺的培养基，但在无谷氨酰胺的培养基不能生长或生长很差。用于本发明之谷氨酰胺营养缺陷型人类细胞系必死的谷氨酰胺营养缺陷型人类细胞或永生的谷氨酰胺营养缺陷型人类细胞。必死的谷氨酰胺营养缺陷型人类细胞系在培养基中具有有限寿命的谷氨酰胺营养缺陷型人类细胞，永生的(又称永久的或建立的)谷氨酰胺营养缺陷型人类细胞系在培养基中如习于该项技术者所熟知以适当地继代培养和次培养，具有明显无限寿命之谷氨酰胺营养缺陷细胞。
必死的谷氨酰胺营养缺陷型人类细胞的例子可以是人类纤维组织母细胞及人类胎肺组织细胞，永生的谷氨酰胺营养缺陷型人类细胞的例子可以是人类纤维肉瘤细胞，如HT1080细胞系(如DSMZ No.ACC-315或ATCC No.CCL 121)及B-淋巴母细胞人类细胞如HL60(DSMZ No.Acc-3)或Namalwa(DSMZ Acc-24)细胞系。用于本发明较佳的是永生的谷氨酰胺营养缺陷型人类细胞，更佳的，此永生的谷氨酰胺营养缺陷型人类细胞系用B-淋巴母细胞或纤维肉瘤细胞，更佳的是用人类纤维肉瘤细胞，最佳的是用HT1080细胞系(如ATCC No.CCL 121)。
谷氨酰胺营养缺陷型人类细胞可藉由已知的基因工程技术以外源DNA序列转染。
以外源DNA序列转染取决于序列是否位于一个或多个DNA构建物上，若序列位于多于一个DNA构建物上，转染可随各序列分别发生或共转染。当转染随各序列分别发生时，序列转染顺序通常是随意的，随各序列分别发生的转染较佳先以″可编码该蛋白质的外源DNA序列″或″能够改变可编码该蛋白质之内生基因表达的外源DNA序列″转染，然后再以″可编码GS的外源DNA序列″转染，转染的谷氨酰胺营养缺陷细胞可以在各别转染之后培养并评估蛋白质生成。
为了成功筛选转染的细胞，所述细胞嫩生长在无谷氨酰胺的培养基中。细胞可以直接生长在无谷氨酰胺的培养基或先在含有谷氨酰胺的培养基，然后逐步稀释成无谷氨酰胺的培养基，如先以谷氨酰胺浓度10mM，然后以2mM至0mM逐步稀释。合适的筛选方法可以根据所用的细胞系来选择。如前述显知，本发明能够产生蛋白质及能够生长在无谷氨酰胺的培养基中的谷氨酰胺营养缺陷型人类细胞系得自以可编码该蛋白质的外源DNA序列或能够改变可编码蛋白质之内生基因表达的外源DNA序列及可编码谷氨酰胺合成酶之外源DNA序列转染该细胞，其中这些外源DNA序列位于一个或多个DNA构建物上。
可编码蛋白质的外源DNA序列或能够改变可编码蛋白质之内生基因表达的外源DNA序列可以在转染后根据如WO 94/12650所描述之基因放大已知方法来放大。可放大的基因可编码酵素，如DHFR(二氢叶酸还原酶)、GS、腺苷脱氨酶、天冬酰胺合成酶、天冬氨酸氨甲酰基转移酶、金属硫蛋白-1、鸟氨酸脱羧酶、P-糖蛋白质、核苷酸还原酶、胸苷激酶或黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶可以用于此目的。含有这些基因的放大复制的细胞系例如能够在没有酵素代谢产物的培养基或在含有相关的选择剂之培养基中存活，相关的选择剂是例如在DHFR情况下为甲氨喋呤(MTX)及在GS情况下为甲硫氨酸磺酰胺(methionine sulphoximine)(MSX)。
由本发明转染的谷氨酰胺营养缺陷型人类细胞所产生之蛋白质是无糖基化和糖基化蛋白质，糖基化蛋白质是指具有至少一个寡糖链的蛋白质。
无糖基化蛋白质的例子如无糖基化荷尔蒙，像黄体生成素释放激素、甲状腺素释放激素、胰岛素、生长抑素、催乳素、促肾上腺皮质激素、黑素细胞促黑激素、升压素、以及其衍生物如去氨加压素、催产素、降钙素、副甲状腺素(PTH)或其片段(如PTH(I-43))、促胃液素、胰泌素、肠促胰酶素、激胆囊素、血管紧张素、人类胎盘促黄体激素、人类纤毛膜促性腺激素(HCG)、雨蛙肽及胃动素；无糖基化的止痛剂物质如脑啡肽及其衍生物(参见US-A 4 277 394及EP-A 031567)、内啡肽、daynorphin及kyotorphin；无糖基化酵素如无糖基化神经传导物质例如蛙皮素、神经紧张素、缓激肽和物质P；神经生长因子(NGF)家族、上皮生长因子(EGF)及纤维组织母细胞生长因子(FGF)家族之无糖基化生长因子及无糖基化荷尔蒙及生长因子受体。
糖基化蛋白质的例子是荷尔蒙及荷尔蒙释放因子，如生长荷尔蒙，包括人类生长荷尔蒙、牛生长荷尔蒙、生长荷尔蒙释放因子、副甲状腺素、甲状腺刺激素、EPO、脂蛋白质、α-1-抗胰蛋白酶、卵泡刺激素、降钙素、黄体生成素、胰增血糖素、凝血因子如因子VIIIC、因子IX、组织因子及von Willebrand因子、抗凝血因子例如蛋白质C、心房利钠因子、肺表面活性物质、血浆素原活化剂例如尿激酶或人类尿或组织型血浆素原活化剂(t-PA)、凝血酶、造血生长因子、脑啡肽、RANTES(调控活化自然的T-细胞表达及分泌)、人类巨噬细胞发炎蛋白质(MIP-1-α)、血清蛋白素例如人类血清蛋白素、米勒抑制物、松弛素A链、松弛素B链、前松弛素、鼠促性腺激素相关肽、微生物蛋白质例如β-lactanase、DNase、抑制素、激活素、肾素、血管内皮生长因子(VEGF)、荷尔蒙或生长因子受体、整合素、蛋白质A或D、类风湿性因子、神经营养因子例如源自骨神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)、或神经生长因子例如NGF-β、源自血小板生长因子(PDGF)、纤维组织母细胞生长因子例如FGF及bFGF、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子(TGF)例如TGF-α及TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5、类胰岛素生长因子-I及-II(IGF-I及IGF-II)、des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)、类胰岛素生长因子结合蛋白、CD蛋白(一群分化蛋白质)例如CD-3、CD-4、CD-8及CD-19、骨诱导因子、免疫毒素、骨形态发生蛋白质(BMP)、细胞活素及其受体，还有嵌合蛋白，包含其受体的细胞活素，包括例如肿瘤坏死因子α及β、他们的受体(TNFR-1，EP 417 563及TNFR-2，EP 417 014)及其衍生物，一种干扰素例如干扰素-α、-β、及-γ，细胞族群刺激因子(CSFs)，如M-CSF、GM-CSF及G-CSF，白介素(ILs)如IL-1到IL-10，超氧化物歧化酶，T-细胞受体、表面膜蛋白、降解加速因子、病毒抗原例如AIDS夹膜的一部份、运输蛋白、归巢受体、地址素、调控蛋白、抗体、嵌合蛋白如免疫粘附素，及任何上述所列片段之糖基化蛋白质。较佳的，本发明产生糖基化蛋白质，更佳的本发明产生N-糖基化蛋白质，最佳的糖基化荷尔蒙像EPO为N-糖基化及其生物活性是依赖其上，或尤其产生EPO。
任何于该项技术已知之合适的培养程序及培养设备均可用来生长本发明转染的人类细胞。添加约0.1至20％(较佳0.5至15％)血清之常见无谷氨酰胺的基础培养基以及无血清无谷氨酰胺的常见基础培养基都可作为培养基用，此外，也可用不含动物来源蛋白质的常见无谷氨酰胺的基础培养基，较佳的使用无血清无谷氨酰胺的常见基础培养基。
可以用的血清如胎牛血清或成牛血清，较佳是使用胎牛血清。常见之可用的无谷氨酰胺的基础培养基为，例如无谷氨酰胺的Eagle极限基础培养基(MEM)、无谷氨酰胺的Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)、无谷氨酰胺的Iscove氏DMEM培养基(N.Iscove及F.Melchers，Journal of Experimental Methods，1978，147，923)、无谷氨酰胺的Ham氏F12培养基(R.G.Ham，Proceedings of National Academy ofScience，1965，53，288)、无谷氨酰胺的L-15培养基(A.Leibovitz，American Journalof Hygiene，1963，78，173)、无谷氨酰胺的RPMI 1640培养基(G.E.Morre等，TheJournal of the American Medical Association，1967，199，519)、无谷氨酰胺的专用培养基和其合适比例之混合物。用于高密度细胞培养的强化常见细胞培养生长培养基已在该项技术所熟知，且已描述于如GB 2251249，其也非常适合作为本发明之无谷氨酰胺的培养基。
常见的添加物可以加到常见的无谷氨酰胺的基础培养基。常加入的添加物包括血清中的蛋白质以及视需要可以对细胞生长及/或细胞生存有正面影响之进一步成分。血清中的蛋白质如牛血清白蛋白(BSA)、运铁蛋白及/或胰岛素；可以对细胞生长及/或细胞生存有正面影响之进一步成分如大豆脂、硒及乙醇胺。取代谷氨酰胺及/或核苷的胺基酸可以依所用的细胞系加到培养基中，胺基酸的例子如异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、丙氨酸。视需要，谷氨酰胺可以低浓度加到常见的无谷氨酰胺的基础培养基中，通常少于1mg/l，较佳的少于0.5mg/l，以支持其生物合成作用(如转胺反应)。
若可编码蛋白质的外源DNA序列或能够改变可编码蛋白质之内生基因表达的外源DNA序列在转染后以可放大的(amplifiable)基因放大，相关的选择剂可以加到常见的无谷氨酰胺的基础培养基中，选择剂施用的浓度范围依所用的细胞系而定，通常用10μM及更高的浓度。
谷氨酰胺营养缺陷型人类细胞可以是固着依赖或固着独立，其可以作为起始材料来获得根据本发明的转染的谷氨酰胺营养缺陷型人类细胞，根据本发明，该转染的细胞能够产生蛋白质及能够生长在无谷氨酰胺的培养基中。若使用固着依赖人类细胞，如HT1080细胞系(ATCC No.CCL 121)，其可以适应成为固着独立HT1080细胞系，能够悬浮生长于无血清培养基，尚未于文献中描述。
适应作用可以发生在以可编码蛋白质的外源DNA序列或能够改变可编码蛋白质之内生基因表达的外源DNA序列及可编码GS的外源DNA序列转染之前或之后。较佳的，细胞先以可编码蛋白质的外源DNA序列或能够改变可编码蛋白质之内生基因表达的外源DNA序列转染，再使其适应悬浮生长于无血清培养基，然后进一步以可编码GS之外源DNA序列转染。若需要，转染的细胞可以再使其适应悬浮生长于无血清无谷氨酰胺的培养基。
本发明之转染的谷氨酰胺营养缺陷型人类细胞可以是固着依赖或固着独立，并能够悬浮生长于无血清无谷氨酰胺的培养基。较佳的转染的谷氨酰胺营养缺陷型人类细胞系固着独立，且能够悬浮生长在无血清无谷氨酰胺的培养基。
适应作用使其成为能够悬浮生长于无血清培养基之固着独立细胞，可以藉由在第一步用含有血清的培养基适应细胞而达成。这可以经由如胰蛋白酶处理细胞，然后接着摇动或藉摇动释放细胞来达成。细胞然后在第二步藉接着减少血清含量来适应无血清培养基，在适应时，若使用选择剂，可以减少其用量，以避免抑制细胞生长。然而，细胞也可以在第一步藉由接着减少血清含量适应生长于无血清培养基，第二步适应成为能够悬浮生长的固着独立细胞，藉由如胰蛋白酶处理细胞然后接着摇动或藉摇动释放细胞来达成，两个步骤也可以同时施行。
较佳的，细胞系在第一步含血清培养基适应成为固着独立细胞用，藉由摇动释放细胞然后第二步经由接着减少血清含量来适应于无血清培养基。
如上所描述的培养基可以做为含血清培养基的基本。在此所定义之选择剂可以加到培养基中，选择剂施用的浓度范围取决于所用的细胞系，通常使用10μM及更高浓度。含有血清的培养基通常添加约0.1到20％，较佳的0.2到10％，最佳的0.5到5％血清，可以使用的血清如上所提及。接着减少血清含量可以藉由逐步减少血清含量，例如从10％到1％到0％来达成。
本发明转染的谷氨酰胺营养缺陷型人类细胞系用在产生蛋白质的方法中，藉由在适合用来表达该蛋白质及回收此蛋白质的条件下之培养基培养该细胞，产生的蛋白质是描述如上。如上所描述之常见的无谷氨酰胺基础培养基及常见的添加物可以作为培养基，合适的培养条件是如WO 96/39488所描述之习知的用于哺乳动物细胞体外培养者。
蛋白质可以从细胞培养物中以习知的分离技术分离，例如免疫亲和或离子交换管柱分划、沉淀、逆相HPLC、色层分析、色层焦集法、SDS-PAGE、胶体过滤。习于该项技术者应了解，适合用于有兴趣的多肽之纯化方法，可能需要根据多肽在重组细胞培养中表达的特性来做修饰。
实施例
实施例1.准备人类纤维肉瘤细胞系HT1080-R223
含有多人类EPO基因拷贝的固着依赖人类HT1080-R223细胞系是产业上用来生产EPO的细胞，一开始是由Transkaryotic Therapies公司所创造(剑桥，MA 02139(US))，其是源自固着依赖人类纤维肉瘤HT 1080细胞系。亲本HT1080细胞系(ATTC No.CCL121)具有产生EPO的能力，其通过类似于DNA构建物pREPO18(描述于WO 95/31 560)的DNA构建物pREPO22转染，除了DHFR基因是在相反方向以及pREPO22含有比pREPO18少约600碱基对同源序列。以后将此细胞系称为R223细胞系。
实施例2.R223细胞系的适应作用以能够悬浮生长于无血清培养基中
藉由胰蛋白酶处理释放在静置瓶中以附着培养生长的细胞，悬浮于专用的含有谷氨酰胺之无血清培养基(进一步以“HM9”提及)，添加10％透析的胎牛血清(dFBS)及500nM MTX，然后以和震荡瓶培养。生长在六天后开始，细胞次培养到同样的培养基中(图1)。一旦可信的生长模式建立了，就减少培养基的血清含量至1％，再一次，可信的生长可在添加的血清完全用尽之前被再建立。
使添加血清和无血清的培养物过度生长以评估产量，结果显示于表1，并附有附着培养的数据。足够的适应作用之后，悬浮培养的比生长速率(即使没有血清)与添加血清之附着培养一样。
在添加血清的培养基中从附着培养到悬浮培养时的适应作用，EPO合成比速率下降50％，从24到12EU/10⁶细胞/小时，然而，此速率在适应无血清生长之后，大体上会恢复至18EU/10⁶细胞/小时。
表1
在适应无血清培养基之前或之后，R223细胞在附着培养及悬浮培养的生长及产量。