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一种复合酶及其提取中草药中有效成分的方法.pdf

  • 上传人:li****8
  • 文档编号:5444435
  • 上传时间:2019-01-18
  • 格式:PDF
  • 页数:10
  • 大小:756.40KB
  • 摘要
    申请专利号:

    CN201410130287.X

    申请日:

    2014.04.02

    公开号:

    CN103865913A

    公开日:

    2014.06.18

    当前法律状态:

    授权

    有效性:

    有权

    法律详情:

    专利权人的姓名或者名称、地址的变更IPC(主分类):C12N 9/88变更事项:专利权人变更前:济南诺能生物工程有限公司变更后:济南百斯杰生物工程有限公司变更事项:地址变更前:251600 山东省济南市商河县经济开发区汇源街28号变更后:251601 山东省济南市商河县经济开发区|||专利权人的姓名或者名称、地址的变更IPC(主分类):C12N 9/88变更事项:专利权人变更前:济南诺能生物工程有限公司变更后:济南诺能生物工程有限公司变更事项:地址变更前:250022 山东省济南市市中区阳光新路69号泉景鸿园商务大厦623室变更后:251600 山东省济南市商河县经济开发区汇源街28号|||授权|||实质审查的生效IPC(主分类):C12N 9/88申请日:20140402|||公开

    IPC分类号:

    C12N9/88; C12N9/42; C12N9/26; C12N9/18; C12P19/14; C12P19/02; C07H17/07; C07H1/08; C07C69/732; C07C67/48; C07D207/16

    主分类号:

    C12N9/88

    申请人:

    济南诺能生物工程有限公司

    发明人:

    吴秀玉; 宋迪; 郭殿梁

    地址:

    250022 山东省济南市市中区阳光新路69号泉景鸿园商务大厦623室

    优先权:

    专利代理机构:

    济南舜源专利事务所有限公司 37205

    代理人:

    宋玉霞

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    内容摘要

    本发明公开了一种复合酶及其提取中草药中有效成分的方法,该复合酶由纤维素酶、酸性淀粉酶和果胶酶组成;1g复合酶中含纤维素酶500-700U、酸性淀粉酶60-75U、果胶酶6000-7000U。该复合酶能同时提取中草药中两种有效成分,效果显著,可用于提取益母草、炙淫羊藿和金银花中有效成分。

    权利要求书

    权利要求书
    1.  一种复合酶,其特征在于,由纤维素酶、酸性淀粉酶和果胶酶组成;1g复合酶中含纤维素酶500-700U、酸性淀粉酶60-75U、果胶酶6000-7000U。

    2.   根据权利要求1所述的一种复合酶,其特征在于,1g复合酶中含纤维素酶667U、酸性淀粉酶66.7U、果胶酶6667U。

    3.   根据权利要求1所述的一种复合酶,其特征在于,该复合酶用于提取益母草中的还原糖和盐酸水苏碱;或者提取炙淫羊藿中的还原糖和淫羊藿苷;或者提取金银花中的还原糖和绿原酸。

    4.   如权利要求3所述的一种复合酶提取中草药中有效成分的方法,其特征在于, 包括以下步骤:
    (1)将中草药粉碎成粉状; 
    (2) 将中草药粉加入去离子水混合均匀,PH调至4.5,得料液;
    (3)将复合酶用甘油水溶液稀释得复合酶稀释液;
    (4)将步骤(2)的料液预热,加入复合酶稀释液,酶解后过滤,取滤液即可。

    5.   根据权利要求4所述的一种复合酶提取中草药中有效成分的方法,其特征在于,步骤(1)中,中草药粉碎至40-200目。

    6.   根据权利要求4所述的一种复合酶提取中草药中有效成分的方法,其特征在于,步骤(3)中,甘油水溶液浓度为20wt%,将复合酶用甘油水溶液稀释至0.0020g-0.5g/ml,得复合酶稀释液。

    7.   根据权利要求6所述的一种复合酶提取中草药中有效成分的方法,其特征在于,当中草药为益母草时,复合酶稀释液浓度为0.025-0.30g/ml;
    当中草药为炙淫羊藿时,复合酶稀释液的浓度为0.025-0.28g/ml;
    当中草药为金银花时,复合酶稀释液的浓度为0.025-0.3g/ml。

    8.   根据权利要求7所述的一种复合酶提取中草药中有效成分的方法,其特征在于,复合酶稀释液的浓度为0.25g/ml。

    9.   根据权利要求4所述的一种复合酶提取中草药中有效成分的方法,其特征在于,步骤(4)中,将料液于水浴锅中预热2min,边搅拌边加入酶液,酶解温度为40-55℃,时间4-7h。

    10.   根据权利要求4所述的一种复合酶提取中草药中有效成分的方法,其特征在于,步骤(4)中,酶解温度为50℃,时间5h。

    说明书

    说明书一种复合酶及其提取中草药中有效成分的方法
    技术领域
    本发明涉及技术领域,特别是涉及一种复合酶及其提取中草药中有效成分的方法。 
    背景技术
    从中草药中提取有效成分的方法有多种,其中酶提取法是较新的方法。其中,常用的酶有纤维素酶、果胶酶、蛋白酶和淀粉酶。通常来说,由多种酶组成的复合酶的酶解效果要优于单独使用一种酶的酶解效果。但是,由于中药材的品种不同,其生物体细胞结构和有效成分有很大的差异;而酶又具有单一性,复合酶的组成、配比决定了其功效。所以,也就是说,复合酶的酶解效果并不一定优于单一酶的酶解效果,因所要酶解的中药材而异。例如,由纤维素酶和果胶酶组成的复合酶在提取金银花中绿原酸中的酶解效果与单一的纤维素酶在提取金银花中绿原酸中的酶解效果相比,并没有明显差异。另一方面,目前对酶法提取中药成分的研究主要还停留在针对某些单个具体提取对象。也就是说,目前只能针对一种中药材进行研究,获得仅适用于该中药材提取特定成分的复合酶。 
    发明内容
    本发明的目的就是针对上述存在的缺陷而提供一种复合酶及其提取中草药中有效成分的方法。该复合酶能同时提取中草药中两种有效成分,效果显著,可用于提取益母草、炙淫羊藿和金银花中有效成分。
    本发明的一种复合酶及其提取中草药中有效成分的方法技术方案为,该复合酶由纤维素酶、酸性淀粉酶和果胶酶组成;1g复合酶中含纤维素酶500-700U、酸性淀粉酶60-75U、果胶酶6000-7000U。
    1g复合酶中含纤维素酶667U、酸性淀粉酶66.7U、果胶酶6667U。
    该复合酶用于提取益母草中的还原糖和盐酸水苏碱;或者提取炙淫羊藿中的还原糖和淫羊藿苷;或者提取金银花中的还原糖和绿原酸。
    该复合酶提取中草药中有效成分的方法,包括以下步骤:
    (1)将中草药粉碎成粉状; 
    (2) 将中草药粉加入去离子水混合均匀,PH调至4.5,得料液;
    (3)将复合酶用甘油水溶液稀释得复合酶稀释液;
    (4)将步骤(2)的料液预热,加入复合酶稀释液,酶解后过滤,取滤液即可。
    步骤(1)中,中草药粉碎至40-200目。
    步骤(3)中,甘油水溶液浓度为20wt%,将复合酶用甘油水溶液稀释至0.0020g-0.5g/ml,得复合酶稀释液。
    当中草药为益母草时,复合酶稀释液浓度为0.025-0.30g/ml;
    当中草药为炙淫羊藿时,复合酶稀释液的浓度为0.025-0.28g/ml;
    当中草药为金银花时,复合酶稀释液的浓度为0.025-0.3g/ml。
    优选的,复合酶稀释液的优选浓度为0.25g/ml。
    步骤(4)中,将料液于水浴锅中预热2min,边搅拌边加入酶液,酶解温度为40-55℃,时间4-7h。
    优选的,步骤(4)中,酶解温度为50℃,时间5h。
    每克益母草提取35.7-181mg还原糖和5.6-10.8mg盐酸水苏碱;每克炙淫羊藿提取38.85-97mg还原糖和8.4-10.8g淫羊藿苷;每克金银花提取80.13-420.57mg还原糖和13.6-16.8mg绿原酸。
    优选的,具体步骤如下:称取中草药5.000g(粉状)置于200ml烧杯中,加入200mL的去离子水摇匀;然后加入0.5mL 1mol/L的硫酸溶液将pH值调至4.5,得料液。取复合酶(每克复合酶中含有纤维素酶667u、酸性淀粉酶66.7u和果胶酶6667u)用20wt%甘油溶解稀释稀释至1ml,得酶液。
    将料液于50°C水浴锅中预热2min,边搅拌边迅速加入酶液,静置保温5h;然后过滤,取滤液。
    其中,1g中草药需要复合酶稀释液1ml。
    本发明的有益效果为:本发明的复合酶破坏中草药的细胞壁,降低粘度,提高中草药浸提收得率,能够同时用于提取益母草、炙淫羊藿和金银花中有效成分;从而克服了一种特定组成的复合酶只能用于一种中草药的技术难题。另外,采用本发明的复合酶,能够同时提取上述每种中药材中两种有效成分。具体来说,能够提取益母草中的还原糖和盐酸水苏碱;能够提取炙淫羊藿中的还原糖和淫羊藿苷;能够提取金银花中的还原糖和绿原酸;且提取率高。
    本发明的方法,简单易操作,能同时提取两种有效成分,提取率显著提高。
    经检测,采用本发明方法,每克益母草可以提取35.7-181mg还原糖和5.6-10.8mg盐酸水苏碱;每克炙淫羊藿可以提取35.04-97mg还原糖和8.4-10.8g淫羊藿苷;每克金银花为可以提取80.13-420.57mg还原糖和13.6-16.8mg绿原酸。与未采用酶水解或采用纤维素酶和果胶酶组成的复合酶水解相比,每种原料中的两种有效成分的提取率均大幅度提高,提取率提高了16.4-495%。
    由于复合酶的浓度会对酶的活性产生影响,从而影响整个提取过程;而不同原料其生物体细胞结构和有效成分有很大的差异;所需要的最优复合酶浓度不同。因此,所以上述方法中,当原料为益母草时,复合酶稀释液的优选浓度为0.025-0.30g/ml;此时,还原糖提取率为57.3-181mg/g,盐酸水苏碱的提取率为8.4-10.8mg/g。最优选的,复合酶稀释液的优选浓度为0.25g/ml;此时,还原糖提取率为181mg/g,盐酸水苏碱的提取率为10.8mg/g。
    当原料为炙淫羊藿时,复合酶稀释液的优选浓度为0.025-0.28g/ml;此时,还原糖提取率为38.85-97mg/g,淫羊藿苷的提取率为9.6-10.8mg/g。最优选的,复合酶稀释液的优选浓度为0.25g/ml;此时,还原糖提取率为97mg/g,淫羊藿苷的提取率为10.8mg/g。
    当原料为金银花时,复合酶稀释液的优选浓度为0.025-0.3g/ml;此时,还原糖提取率为168.3-420.57mg/g,绿原酸的提取率为14.8-16.8mg/g。最优选的,复合酶稀释液的优选浓度为0.25g/ml;此时,还原糖提取率为420.57mg/g,绿原酸的提取率为16.8mg/g。
    具体实施方式:
    为了更好地理解本发明,下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案。
    本发明中的果胶酶、纤维素酶、酸性淀粉酶为:
    果胶酶QB1502-92:1g酶粉在50℃、pH3.5的条件下,1h分解果胶产生1mg半乳糖醛酸为一个酶活力单位。
    纤维素酶NY/T912-2004:在37℃、pH为5.50的条件下,每分钟从浓度为4mg/mL的羧甲基纤维素钠溶液中降解释放1μmol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位(U)。
    酸性淀粉酶:1g酶,于40℃、pH3.0条件,1min液化1mg可溶性淀粉,即为1个酶活力单位,以u/ g表示。
    本发明的一种复合酶及其提取中草药中有效成分的方法,该复合酶由纤维素酶、酸性淀粉酶和果胶酶组成;1g复合酶中含纤维素酶500-700U、酸性淀粉酶60-75U、果胶酶6000-7000U。
    该复合酶用于提取益母草中的还原糖和盐酸水苏碱;或者提取炙淫羊藿中的还原糖和淫羊藿苷;或者提取金银花中的还原糖和绿原酸。
    该复合酶提取中草药中有效成分的方法,包括以下步骤:
    (1)将中草药粉碎成粉状; 
    (2) 将中草药粉加入去离子水混合均匀,PH调至4.5,得料液;
    (3)将复合酶用甘油水溶液稀释得复合酶稀释液;
    (4)将步骤(2)的料液预热,加入复合酶稀释液,酶解后过滤,取滤液即可。
    步骤(1)中,中草药粉碎至40-200目。
    步骤(3)中,甘油水溶液浓度为20wt%,将复合酶用甘油水溶液稀释至0.0020g-0.5g/ml,得复合酶稀释液。
    当中草药为益母草时,复合酶稀释液浓度为0.025-0.30g/ml;
    当中草药为炙淫羊藿时,复合酶稀释液的浓度为0.025-0.28g/ml;
    当中草药为金银花时,复合酶稀释液的浓度为0.025-0.3g/ml。
    步骤(4)中,将料液于水浴锅中预热2min,边搅拌边加入酶液,酶解温度为40-55℃,时间4-7h。
    实施例中提及还原糖的测定,具体方法为:
    葡萄糖溶液:称取无水葡萄糖1.000g,加蒸馏水溶解,定容至100ml
    DNS试剂:称取3,5-二硝基水杨酸3.15g(化学纯),加水500ml,搅拌5s,水浴至45℃。然后逐步加入100ml氢氧化钠溶液,同时不断搅拌,直到溶液清澈透明(注意:在加入氢氧化钠过程中,溶液温度不要超过48℃。)。再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0g、苯酚2.50g和无水亚硫酸钠2.50g。继续45℃水浴加热,同时补加水300ml,不断搅拌,直到加入的物质完全溶解。停止加热,冷却至室温后,用水定容至1000ml。储存在棕色瓶中,避光保存。室温下存放7天后可以使用,有效期为6个月。
    吸取蒸馏水4.0ml,加入DNS试剂5.0ml,沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温,用水定容至25.0ml,制成标准空白样。
    取2ml上清液加入2ml蒸馏水、5mlDNS试剂混匀后沸水浴5min,用自来水冷却至室温,加水定容至25ml后混匀。以标准空白样为空白对照,在540nm处测定吸光度。
    标准曲线的绘制
    分别吸取葡萄糖溶液1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00和7.00ml,分别用蒸馏水定容至100ml,配制成浓度为0.10—0.70mg/ml葡萄糖标准溶液。
    分别吸取上述浓度系列的葡萄糖标准溶液各2.00ml(做二个平行),分别加入到刻度试管中,再分别加入2ml水和5mlDNS试剂。电磁振荡3s,沸水浴加热5min。然后用自来水冷却到室温,再用水定容至25ml。以标准空白样为对照调零,在540nm处测定吸光度OD值A。
    以葡萄糖浓度为Y轴、吸光度OD值为X轴,绘制标准曲线。每次新配制DNS试剂均需要重新绘制标准曲线。
    还原糖的计算:
    XD = A×K + CO
    XD — 试样稀释液中的还原糖浓度,mg/ml;
    A —反应液的吸光度;
    K — 标准曲线的斜率;
    CO — 标准曲线的截距。
    实施例1
    称取益母草5.000g粉碎至100目置于200ml烧杯中,加入200mL的去离子水摇匀;然后加入0.5mL 1mol/L的硫酸溶液将pH值调至4.5,得益母草液。取复合酶(每克复合酶中含有纤维素酶667u、酸性淀粉酶66.7u和果胶酶6667u)用20wt%甘油溶解稀释稀释至1ml,得酶液。
    将益母草液于50°C水浴锅中预热2min,边搅拌边迅速加入酶液,静置保温5h;然后过滤,取滤液。
    上述操作共重复进行5次,每次复合酶的用量均不同,依次为0g、0.0025g、0.025g、0.25g和0.3g。
    分别检测将5次操作所获取的滤液中的原糖含量和盐酸水苏碱含量。
    检测结果如表1。
    表1

    实施例2
    称取益母草5.000g粉碎至180目置于200ml烧杯中,加入200mL的去离子水摇匀;然后加入0.5mL 1mol/L的硫酸溶液将pH值调至4.5,得益母草液。取复合酶用20wt%甘油溶解稀释稀释至1ml,得酶液。
    将益母草液于50°C水浴锅中预热2min,边搅拌边迅速加入酶液,静置保温5h;然后过滤,取滤液。
    上述操作共重复进行3次,每次复合酶用量0.25g,复合酶中的各种酶含量均不同:
    ①每克复合酶中含有纤维素酶300u、酸性淀粉酶100u和果胶酶200u;
    ②每克复合酶中含有纤维素酶500u、酸性淀粉酶70u和果胶酶6500u;
    ③每克复合酶中含有纤维素酶700u、酸性淀粉酶60u和果胶酶6000u。
    分别检测原糖含量和盐酸水苏碱含量。
    检测结果如表2。
    表2

    实施例3
    称取炙淫羊藿5.000g粉碎至200目置于200ml烧杯中,加入200mL的去离子水摇匀,然后加入0.25mL 1mol/L的硫酸溶液将pH值调至4.5,得炙淫羊藿液;取复合酶(每克复合酶中含有纤维素酶667u、酸性淀粉酶66.7u和果胶酶6667u)用20wt%甘油溶解稀释稀释至1ml,得酶液;将炙淫羊藿液于50°C水浴锅中预热2min,边搅拌边迅速加入酶液,静置保温5h;然后过滤,滤液。
    上述操作共重复进行5次,每次复合酶的用量均不同,依次为0g、0.0025g、0.025g、0.25g和0.3g。
    分别检测原糖含量和淫羊藿苷含量。
    检测结果如表3。
    表3

    实施例4
    称取炙淫羊藿5.000g粉碎至200目置于200ml烧杯中,加入200mL的去离子水摇匀,然后加入0.25mL 1mol/L的硫酸溶液将pH值调至4.5,得炙淫羊藿液;取复合酶用20wt%甘油溶解稀释稀释至1ml,得酶液;将炙淫羊藿液于50°C水浴锅中预热2min,边搅拌边迅速加入酶液,静置保温5h;然后过滤,滤液。
    上述操作共重复进行3次,每次复合酶用量0.25g,复合酶中的各种酶含量均不同:
    ①每克复合酶中含有纤维素酶300u、酸性淀粉酶100u和果胶酶200u;
    ②每克复合酶中含有纤维素酶500u、酸性淀粉酶70u和果胶酶6500u;
    ③每克复合酶中含有纤维素酶700u、酸性淀粉酶60u和果胶酶6000u。
    分别检测原糖含量和淫羊藿苷含量。
    检测结果如表4所示:
    表4

    实施例5
    称取金银花5.000g粉碎至40目置于200ml烧杯中,加入200mL的去离子水摇匀,然后加入0.2mL 1mol/L的硫酸溶液将金银花液的pH值调至4.5,得金银花液;取复合酶(每克复合酶中含有纤维素酶667u、酸性淀粉酶66.7u和果胶酶6667u)用20wt%甘油溶解稀释稀释至1ml,得酶液;将金银花液于50°C水浴锅中预热2min,边搅拌边迅速加入酶液,静置保温5h;然后过滤,滤液。
    上述操作共重复进行5次,每次复合酶的用量均不同,依次为0g、0.0025g、0.025g、0.25g和0.3g。
    分别检测将5次操作所获取的滤液中的还原糖、绿原酸,结果如表5。
    表5

    实施例6
    称取金银花5.000g粉碎至40目置于200ml烧杯中,加入200mL的去离子水摇匀,然后加入0.2mL 1mol/L的硫酸溶液将金银花液的pH值调至4.5,得金银花液;取复合酶(每克复合酶中含有纤维素酶667u、酸性淀粉酶66.7u和果胶酶6667u)用20wt%甘油溶解稀释稀释至1ml,得酶液;将金银花液于50°C水浴锅中预热2min,边搅拌边迅速加入酶液,静置保温5h;然后过滤,滤液。
    上述操作共重复进行3次,每次复合酶用量0.25g,复合酶中的各种酶含量均不同:
    ①每克复合酶中含有纤维素酶300u、酸性淀粉酶100u和果胶酶200u;
    ②每克复合酶中含有纤维素酶500u、酸性淀粉酶70u和果胶酶6500u;
    ③每克复合酶中含有纤维素酶700u、酸性淀粉酶60u和果胶酶6000u。
    分别检测原糖含量和绿原酸含量。
    检测结果如表6所示:
    表6

    由此可见,采用本发明方法,每克益母草可以提取35.7-181mg还原糖和5.6-10.8mg盐酸水苏碱;每克炙淫羊藿可以提取35.04-97mg还原糖和8.4-10.8g淫羊藿苷;每克金银花为可以提取80.13-420.57mg还原糖和13.6-16.8mg绿原酸。与未采用酶水解或采用纤维素酶和果胶酶组成的复合酶水解相比,每种原料中的两种有效成分的提取率均大幅度提高,提取率提高了16.4-495%。
    由于复合酶的浓度会对酶的活性产生影响,从而影响整个提取过程;而不同原料其生物体细胞结构和有效成分有很大的差异;所需要的最优复合酶浓度不同。因此,所以上述方法中,当原料为益母草时,复合酶稀释液的优选浓度为0.025-0.30g/ml;此时,还原糖提取率为57.3-181mg/g,盐酸水苏碱的提取率为8.4-10.8mg/g。最优选的,复合酶稀释液的优选浓度为0.25g/ml;此时,还原糖提取率为181mg/g,盐酸水苏碱的提取率为10.8mg/g。
    当原料为炙淫羊藿时,复合酶稀释液的优选浓度为0.025-0.28g/ml;此时,还原糖提取率为38.85-97mg/g,淫羊藿苷的提取率为9.6-10.8mg/g。最优选的,复合酶稀释液的优选浓度为0.25g/ml;此时,还原糖提取率为97mg/g,淫羊藿苷的提取率为10.8mg/g。
    当原料为金银花时,复合酶稀释液的优选浓度为0.025-0.3g/ml;此时,还原糖提取率为168.3-420.57mg/g,绿原酸的提取率为14.8-16.8mg/g。最优选的,复合酶稀释液的优选浓度为0.25g/ml;此时,还原糖提取率为420.57mg/g,绿原酸的提取率为16.8mg/g。

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    一种 复合 及其 提取 中草药 有效成分 方法
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