一种三结合位点试剂及其在二价铜离子检测中的应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103936657 A (43)申请公布日 2014.07.23 CN 103936657 A (21)申请号 201410194012.2 (22)申请日 2014.05.08 C07D 209/88(2006.01) C09K 11/06(2006.01) G01N 21/64(2006.01) (71)申请人 山西大学 地址 030006 山西省太原市小店区坞城路 92 号 (72)发明人 阴彩霞 霍方俊 (74)专利代理机构 山西五维专利事务所 ( 有限 公司 ) 14105 代理人 张福增 (54) 发明名称 一种三结合位点试剂及其在二价铜离子检测 中的应用。

2、 (57) 摘要 本发明提供了一种具有三结合位点检测二价 铜离子 (Cu2+) 的试剂， 它是三甲酰化间苯三酚咔 唑腙。此试剂由三甲酰化间苯三酚和咔唑在乙醇 中回流 10 小时制得， 反应只需一步进行， 且反应 条件简单， 易于生产。 本发明提供了二价铜离子的 定量检测方法， 是基于三甲酰化间苯三酚咔唑腙， 在 DMSO/HEPES(pH7.4) 的混合溶液中定量地检测 二价铜离子的含量。 该检测方法， 对二价铜离子显 示了高的灵敏性和选择性， 检测过程简便、 灵敏、 快速， 检测结果准确。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 5 页 (19)中华人民共和国国家知。

3、识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书3页 附图5页 (10)申请公布号 CN 103936657 A CN 103936657 A 1/1 页 2 1. 一种试剂， 它是三甲酰化间苯三酚咔唑腙 , 特征在于其结构式为 ： 2. 如权利要求 1 所述的一种试剂的合成方法， 其特征在于步骤为 ： 将三甲酰化间苯三 酚和咔唑在乙醇中回流 10 小时， 冷却后过滤， 再用甲醇重结晶得到黄色固体。 3. 如权利要求 1 所述的一种试剂在检测二价铜离子中的应用。 4. 一种检测二价铜离子的方法 ： 其特征在于， 步骤为 ： (1)、 配制 pH 7.4、 浓度为 10mM 的 HEPES。

4、 缓冲溶液， 配制 2mM 的三甲酰化间苯三酚咔 唑腙 DMSO 溶液 ； (2)、 按体积比 3800:200:3， 将 DMSO 溶液、 HEPES 缓冲溶液和三甲酰化间苯三酚咔 唑腙的 DMSO 溶液加到干净的荧光比色皿中， 在荧光分光光度仪上检测， 随着待测样的加 入 ,522nm 的荧光强度逐渐减弱 ； (3)、 用蒸馏水配制 2mM 的 Cu2+溶液， 把 1.9mL 的 DMSO 溶液、 0.1mL 的 HEPES 缓冲溶液、 1.5L 的三甲酰化间苯三酚咔唑腙 DMSO 溶液加到另一个荧光比色皿中， 分别在加入二价 铜离子溶液的体积为10、 20、 30、 40、 50、 60。

5、、 70、 80L时， 在荧光分光光度仪上测定522nm对 应的荧光强度 F 为 701、 621、 547、 475、 397、 320、 251、 169、 103、 23， 以 Cu2+浓度为横坐标， 以 相对荧光强度 F0 F 为纵坐标绘制图， F0 773， 得到 Cu2+浓度的工作曲线 ； 线性回归方程 为 ： F0 F -6.63+7.89c， c 的单位为 M ； (4)、 将HEPES缓冲溶液100L、 DMSO溶液1900L和三甲酰化间苯三酚咔唑腙DMSO溶 液1.5L加到干净的荧光比色皿中， 用微量进样器吸取VL待测样品溶液， 加入到此干净 的荧光比色皿中， 在荧光分光光。

6、度仪上检测， 将测得的荧光强度代入 (3) 的线性回归方程， 得到浓度 c， 待测样品 C待测样 (2000+V待测样)Lc10-6/VL, 即可求得 Cu2+的浓度。 权 利 要 求 书 CN 103936657 A 2 1/3 页 3 一种三结合位点试剂及其在二价铜离子检测中的应用 技术领域 0001 本发明涉及二价铜离子的检测技术， 具体涉及一种试剂及其合成方法， 以及这种 试剂在检测二价铜离子中的应用。 背景技术 0002 由于化学传感器在临床生物化学、 环境科学的应用潜力， 近几年研究者的焦点集 中在发展灵敏的化学传感器上。过渡金属离子在生物体中扮演着重要的角色， 且近年来过 渡金属。

7、离子引起的环境污染也很严重， 目前研究者已经开发了各种各样的金属离子探针。 多数金属离子探针具有 1 个或者 2 个结合位点， 使得和金属离子作用后的配合物缺乏稳定 性， 在本发明中， 我们合成了一个基于三甲酰化间苯三酚咔唑腙的三结合位点探针， 此探针 对二价铜离子显示了高的选择性和灵敏性。此试剂能用于荧光成像。 发明内容 0003 本发明的目的是提供一种合成简单、 操作方便、 选择性高、 具有多结合位点的、 定 量检测 Cu2+的新的试剂， 以及该试剂在 Cu2+检测中的应用。 0004 本发明提供的快速检测 Cu2+的试剂和方法， 是基于一种三甲酰化间苯三酚咔唑 腙， 在 pH 为 7.4。

8、 的 HEPES 溶液和 DMSO 混合溶液中定量地检测 Cu2+的含量。该检测方法， 对 Cu2+显示了高的灵敏性和选择性， 检测过程简便、 灵敏、 快速， 检测结果准确。 0005 该试剂的结构是 ： 0006 0007 该试剂的合成方法， 步骤为 ： 将三甲酰化间苯三酚和咔唑， 在乙醇中回流 10 小时， 冷却抽滤， 再用甲醇重结晶得到黄色固体。 0008 用该试剂检测 Cu2+的方法， 步骤为 ： 0009 (1)、 配制 pH 7.4、 浓度为 10mM 的 HEPES 缓冲溶液， 配制 2mM 的三甲酰化间苯三 说 明 书 CN 103936657 A 3 2/3 页 4 酚咔唑腙。

9、 DMSO 溶液 ； 0010 (2)、 按体积比 3800:200:3， 将 DMSO 溶液、 HEPES 缓冲溶液和三甲酰化间苯三酚 咔唑腙的 DMSO 溶液加到干净的荧光比色皿中， 在荧光分光光度仪上检测， 随着待测样的加 入 ,522nm 的荧光强度逐渐减弱 ； 0011 (3)、 用蒸馏水配制2mM的Cu2+溶液， 把1.9mL的DMSO溶液、 0.1mL的HEPES缓冲溶 液、 1.5L 的三甲酰化间苯三酚咔唑腙 DMSO 溶液加到另一个荧光比色皿中， 分别在加入二 价铜离子溶液的体积为 10、 20、 30、 40、 50、 60、 70、 80L 时， 在荧光分光光度仪上测定 。

10、522nm 对应的荧光强度 F 为 701、 621、 547、 475、 397、 320、 251、 169、 103、 23， 以 Cu2+浓度为横坐标， 以相对荧光强度 F0 F 为纵坐标绘制图， F0 723， 得到 Cu2+浓度的工作曲线 ； 线性回归方 程为 ： F0 F -6.63+7.89c， c 的单位为 M ； 0012 (4)、 将 HEPES 缓冲溶液 100L、 DMSO 溶液 1900L 和三甲酰化间苯三酚咔唑腙 DMSO溶液1.5L加到干净的荧光比色皿中， 用微量进样器吸取VL待测样品溶液， 加入到 此干净的荧光比色皿中， 在荧光分光光度仪上检测， 将测得的荧光。

11、强度代入 (3) 的线性回 归方程， 得到浓度 c， 待测样品 C待测样 (2000+V待测样)Lc10-6/VL, 即可求得 Cu2+的 浓度。 0013 本发明具有如下优点和效果 ： 1、 合成了一种多结合位点荧光探针 ； 2、 本发明的检 测方法， 对 Cu2+显示了高的灵敏性和选择性 ； 3、 检测机理通过探针和 Cu2+的配位实现 ； 4、 检 测手段简单， 只需要借助荧光分光光度仪即可实现。 附图说明 0014 图 1a 实施例 1 制备得到的试剂的核磁 1HNMR 图谱 0015 图 1b 实施例 1 制备得到的试剂的核磁 13CNMR 图谱 0016 图 1c 实施例 1 制备。

12、得到的试剂的质谱图 0017 图 2 实施例 2 试剂与 Cu2+作用的荧光发射图 0018 图 3 实施例 3 试剂与各种分析物的荧光柱状图 0019 图 4 实施例 4 测定 Cu2+的工作曲线 0020 图 5 实施例 5 细胞成像图 具体实施方式 ： 0021 实施例 1 0022 0.420g 三甲酰化间苯三酚和 1.682g 咔唑在 40mL 乙醇中回流 10 小时， 冷却并抽 滤， 用 40mL 的甲醇重结晶得黄色的固体产品。 0023 1H NMR(300MHz,25 ,DMSO):13.90(s,NH,1H),8.97(d,Ar-H,1H,J 12.4),8.45(s,CH,。

13、1H,J 11.3),8.37(d,Ar-H,1H,J 7.7),7.68(m,Ar-H,4H,J 58.8),7.32(s,Ar-H,1H,J 7.1),4.54(d,CH2,2H,J 13.6),1.41(t,CH3,3H,J 21.0) ( 图 1a).13C NMR(75MHz,25 ,DMSO):175.8,162.0,155.0,143.9,129.5,126.7,124.1 ,122.1,113.2,112.5,66.1,28.1,16.5( 图 1b) ； ESI-MS m/2z393.58( 图 1c) ； Elemental analysis(calcd. )for C51。

14、H42N6O3:C,77.84 ； H,5.38 ； N,10.68 ； Found:C,77.78 ； H,5.41,N,10.65. 说 明 书 CN 103936657 A 4 3/3 页 5 0024 实施例 2 0025 配制 pH 7.4、 浓度为 10mM 的 HEPES 缓冲溶液， 并用 DMSO 配制 2mM 的三甲酰化间 苯三酚咔唑腙溶液 ； 把 0.1mL 的 HEPES 缓冲溶液、 1.9mL 的 DMSO 溶液及 1.5L 的三甲酰化 间苯三酚咔唑腙 DMSO 溶液加到干净的荧光比色皿中， 取 Cu2+的溶液， 逐渐用微量进样器加 到此比色皿中， 边加样边在荧光分光光。

15、度仪上检测， 随着 Cu2+的加入， 522nm 处荧光强度逐 渐减弱。荧光发射图见图 2。 0026 实施例 3 0027 配制 pH 7.4、 浓度为 10mM 的 HEPES 缓冲溶液， 并用甲醇配制 2mM 的三甲酰化间 苯三酚咔唑腙溶液 ； 把 0.1mL 的 HEPES 缓冲溶液、 1.9mL 的 DMSO 溶液及 1.5L 的三甲酰化 间苯三酚咔唑腙 DMSO 溶液加到干净的荧光比色皿中， 再分别加入 67 摩尔当量的 Cu2+， 以及 500 摩尔当量的各种分析物 ： Hg2+,Zn2+,Ni2+,Bi3+,Cu+,Co2+,VO2+,Mn2+,Ru3+,Cd2+,Pb2+,A。

16、g+,La3+ ,Ce4+,Yb3+,Cr2+,Er3+,Mg2+,Sn2+,Al3+,Nd3+， Zr4+,K+,Sm3+,Fe2+,Fe3+和 Eu3+在荧光分光光度仪上 检测， 见荧光发射图， ( 见图 3)。Cu2+使得三甲酰化间苯三酚咔唑腙荧光强度由 773 变到 23， 其它的分析物基本没有引起三甲酰化间苯三酚咔唑腙荧光强度的变化。 0028 经实验证明， 其它分析物不干扰体系对 Cu2+的测定。 0029 实施例 4 0030 配制 pH 7.4、 浓度为 10mM 的 HEPES 缓冲溶液， 并用 DMSO 配制 2mM 的三甲酰化间 苯三酚咔唑腙溶液， 用蒸馏水配制 2mM 。

17、的 Cu2+溶液 ； 把 0.1mL 的 HEPES 缓冲溶液、 1.9mL 的 DMSO 溶液和 1.5L 的三甲酰化间苯三酚咔唑腙 DMSO 溶液加到荧光比色皿中， 分别在加入 Cu2+溶液的体积为 10、 20、 30、 40、 50、 60、 70、 80L 时， 在荧光分光光度仪上测定 522nm 对应 的荧光强度F为701、 621、 547、 475、 397、 320、 251、 169、 103、 23， 以Cu2+浓度为横坐标， 以相对 荧光强度 F0 F 为纵坐标绘制图， F0 773， 得到 Cu2+浓度的工作曲线 ； 线性回归方程为 ： F0 F -6.63+7.89。

18、c， c 的单位为 M ； 0031 实施例 5 0032 用甲醇配制 2mM 的三甲酰化间苯三酚咔唑腙 DMSO 溶液 ； 将三甲酰化间苯三酚咔 唑腙 DMSO 加入肝癌细胞培养液中， 使得其浓度为 1.5M， 与肝癌细胞 HepG2 在 37下， 反应 30min， 体系在荧光共聚焦成像仪下有绿色的荧光发射 ； 将三甲酰化间苯三酚咔唑腙 DMSO 溶液加入肝癌细胞培养液中， 使得其浓度为 1.5M， 与肝癌细胞 HepG2 在 37下， 反 应 30min， 再加入外源的 Cu2+(100M)， 在 37下， 再反应 30min， 体系在荧光共聚焦成像仪 下无荧光发射。图 5 为荧光共聚焦。

19、成像仪下与三甲酰化间苯三酚咔唑腙反应的细胞 a( 绿 色荧光 )、 c(a 的明场 ) 以及先三甲酰化间苯三酚咔唑腙作用再与外源的 Cu2+作用的细胞 b( 无荧光 )、 d(b 的明场 ) 成像图。 说 明 书 CN 103936657 A 5 1/5 页 6 图 1a 说 明 书 附 图 CN 103936657 A 6 2/5 页 7 图 1b 说 明 书 附 图 CN 103936657 A 7 3/5 页 8 图 1c 说 明 书 附 图 CN 103936657 A 8 4/5 页 9 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 103936657 A 9 5/5 页 10 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 103936657 A 10 。