一种疫霉多糖激发子GEP1及其在提高植物抗病性中的应用.pdf

本发明公开了一种疫霉多糖激发子Gep1及其在提高植物抗病性中的应用，Gep1多糖激发子分离纯化自烟草疫霉，经薄层层析分析，确定该多糖的单糖组成为葡萄糖，Gep1具热稳定性，可耐受酸碱，在100℃高温处理60min后和pH2-12条件下仍具有活性，将其喷洒在植物叶面，可以诱导烟草产生抗性，对烟草花叶病毒病有较好防效。每升疫霉发酵液可分离获得6g多糖激发子，产量远高于蛋白质激发子。多糖激发子施用在田间后，在植物体内、土壤和水体中易分解，无残留，对环境无污染，对人畜等非靶标生物相对安全，不易产生抗药性。因此，该产品将具有十分广阔的应用与市场前景。

1.  一种疫霉多糖激发子Gep1，通过以下步骤制备得到：
1）将烟草疫霉（P. parasitica）的发酵液先用纱布过滤，再离心后收集上清液；氯仿、胰蛋白酶和蛋白酶K除去蛋白，再加入4 × 体积的无水乙醇放置于-20 ℃沉淀过夜，离心弃上清，沉淀经真空冷冻干燥得到的粉末即为粗多糖；
2）将上述获得的粗多糖溶于少量的蒸馏水中，依次通过DEAE-52 纤维素柱层析和Sephadex G-100柱层析进一步分离纯化，硫酸-苯酚法检测糖含量绘制洗脱曲线；利用洗脱曲线各峰值的组分进行活性检测；
在活性分析后，对有活性的物质进行真空冷冻干燥进行浓缩，即得疫霉多糖激发子Gep1。

2.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
1)将发酵液先用4层纱布过滤，滤液于3000 r/min离心10 min后，收集上清液；
用冷冻干燥法将得到的上清液浓缩成约原体积的1 / 10；向浓缩液中加入1 / 5体积的氯仿振荡20 min，8000 r/min离心10 min，除去氯仿和部分蛋白，重复3次；继续向浓缩液中加入终浓度均为20 μg/mL胰蛋白酶和蛋白酶K于37 ℃温育30 min后，沸水煮沸5 min，4 ℃、8000 r/min离心取上清；向除去蛋白的浓缩液中加入4 × 体积的无水乙醇放置于-20 ℃沉淀过夜，4 ℃、8000 r/min离心5 min，弃上清，沉淀经真空冷冻干燥得到的粉末即为粗多糖；
2). 粗多糖溶于蒸馏水后，加入无水乙醇，终浓度为60%，置于-20℃冰箱过夜，4℃、8000 r/min离心20 min取上清，向上清液中加入无水乙醇，使乙醇浓度达到80%后，置于-20℃冰箱过夜，4℃、8000 r/min离心20 min取沉淀，待乙醇完全挥发后加入蒸馏水重溶，得到80%乙醇沉淀多糖；取80%乙醇沉淀多糖于3000 r/min 离心 10 min，取上清液，备上样；待DEAE-52纤维素柱子下端流出液pH值为7.0开始上样，共上样4 mL，依次用蒸馏水、0.1 mol/L NaCl、0.5 mol/L NaCl、1 mol/L NaCl溶液洗脱，自动收集，流速1 mL/min,每管6 mL；苯酚-硫酸法跟踪检测，以试管数为横坐标，吸光度为纵坐标作图，得到粗多糖的洗脱曲线，合并含糖单一峰位，蒸馏水透析2 d，检测其生物活性后，冷冻干燥；
取适量Sephadex G-100粉末，加入足够的蒸馏水室温下溶胀过夜，脱气后湿法装柱，0.01 mol/L NaCl平衡过夜；将DEAE-52纤维素柱层析分级所得的活性组分溶于最小体积的0.01 mol/L NaCl溶液中，加到已平衡好的Sephadex G-100柱，以0.01 mol/L NaCl溶液为洗脱液，流速为1 mL / 6 min，每管3 mL，用自动部分收集器收集，苯酚-硫酸法检测多糖分布，以试管数为横坐标，吸光度为纵坐标作图，绘制洗脱曲线，分别收集各主峰，蒸馏水透析2 d，检测其生物活性后，冷冻干燥，即得多糖激发子Gep1。

3.  权利要求1所述的疫霉多糖激发子Gep1在提高植物抗病性中的应用。

4.  根据权利要求3所述的应用，其特征在于：疫霉多糖激发子Gep1在提高烟草对烟草花叶病毒抗性中的应用。

5.  权利要求1所述的疫霉多糖激发子Gep1在制备烟草抗烟草花叶病毒制剂中的应用。

一种疫霉多糖激发子Gep1及其在提高植物抗病性中的应用
技术领域
本发明属于农业微生物学技术及生物化学与分子生物学技术领域，具体涉及一种疫霉多糖激发子Gep1，还涉及其在提高植物抗病性中应用。
背景技术
糖类激发子是指具有激活植物自身免疫、提高植物抗病抗逆能力的糖类物质，属于生物源激发子(Yin H et al.2010)。糖类一直被认为是一类惰性化合物，只作为生物体内的代谢能量来源或充当结构保护材料(如植物细胞壁)。Ayers等在1976年发现细胞壁的寡糖碎片可以诱导大豆产生植保素(phytoalexin)，从此人们对糖类功能开始了新的认识。目前，人们已普遍认为寡糖是能够诱导高等植物防御反应的激发子中的一类。它们实现功能的基本原理是通过激发植物产生病程相关蛋白(pathogenesis-related protein，PR蛋白)和植保素等，增强植物的抗病性。
目前已鉴定的真菌激发子大多数是低聚糖或糖蛋白，少数为蛋白质或多肽。β-1,3-β-1,6-葡寡糖是最具代表性的真菌激发子，它是从大豆致病菌大雄疫霉菌(Phytophthora megasperma)的细胞壁水解产物中得到的。当浓度为10^-3-10^-4mol/L时，即可诱导大豆叶片产生植保素(Sharp et al.1984)。Smith(1991)从茄病镰刀菌(Fusarium solani)中分离得到一种可诱导紫花苜蓿产生豌豆素的脱乙酰壳多糖。许多研究证明，壳多糖能够有效诱导多种植物产生抗病性，对病害的防治有明显效果，如可诱导番茄对根腐菌和早疫霉抗性，还可诱导大豆幼苗抗大豆镰刀菌根腐病(F.oxysporum)(Smith et al.1991)。
葡聚(寡)糖与其他糖类激发子的不同之处是其通常包括主链与侧链，具有β-1,3和β-1,6两种连接方式。β-D-葡聚糖(β-D-glucan)广泛存在于真菌、褐藻、地衣及谷物等生物体中，具有诱导植物产生抗病性，抗细菌、抗病毒、抗肿瘤和促愈合等生物活性。其降解产物β-葡寡糖能诱导大豆、甜椒、紫花苜蓿、水稻、拟南芥、烟草、小麦和葡萄等多种植物产生抗性，其作用机制可简单概括如下：首先被植物细胞壁或细胞膜上的受体识别后转入胞内，进而引起胞内钙离子(Ca²⁺)流、质膜去极化、胞外碱化等一系列早期信号反应，再经过一氧化氮(nitric oxide，NO)、活性氧(reactive oxgen species，ROS)等二级信号分子的进一步转导和放大，包括水杨酸(salicylic acid，SA)、茉莉酸(jasmonic acid，JA)、乙烯(ethylene，ET)等植物激素的积累和释放来调控防卫基因的表达，从而积累PR蛋白和次级代谢产物，来诱导植物自身免疫抗性，抵抗病原物质的侵染(武维华2003)。
研究发现β-葡寡糖激发子的结构不同对植物的诱导作用不同。大豆和蝶形花科植物可以识别具分支结构的β-1,3-β-1,6葡七糖(以β-1,6-为主链，带有β-1,3侧链)，却不能识别线性的β-1,6-葡寡糖。烟草和番茄能够识别线性β-1,3-葡寡糖，而欧芹却不能识别。线性的β-1,6-葡寡糖无法诱导水稻产生抗病性，而含一个1,6分支的线性β-1,3-葡五糖却能诱导水稻产生植保素(Yamaguchi et al.2000)。
糖化学家采用不同结构的葡寡糖，通过测定激发子的活性及其与细胞膜的结合能力来研究葡寡糖的不同结构对诱导植物抗性能力差异的影响。结果表明，移除葡寡糖非还原端的葡萄糖残基或改变支链结构会显著降低植物的抗病活性；而增加葡寡糖还原端的葡萄糖残基、或对其进行烷基及其他基团修饰，其活性基本不变。例如，去掉非还原端的3个葡萄糖残基或支链葡萄糖残基的葡七糖不能或几乎不能诱导大豆产生和积累植保素(Yi et al.2003)。此外，葡寡糖经硫酸化后可提高诱导植物抗病的效果(Menard et al.2004)。研究人员还发现，若要诱导酸性和碱性PR蛋白的表达，则硫酸化修饰的程度要大于0.4(DS>0.4)，且DS>1.5时，诱导效果更加明显。例如对于烟草，DS＝2.4的海带淀粉(β-1,3葡寡糖)(laminaran)可以诱导PR蛋白的表达，抵抗烟草花叶病毒的侵染。
烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)是最重要的植物病毒之一，可侵染36科350多种植物，其中最主要的是茄科植物，以烟草和番茄尤重(商鸿生和李振岐2005)。感染TMV的植株的典型症状是花叶，发病初期新叶上发生“脉明”现象，并逐渐从叶片的基部向顶端发展，最后扩展至整个叶片。受病毒的干扰，叶片厚薄不均，形成疱斑、皱缩，甚至扭曲。严重时叶片呈柳叶状。早期发病植株生长缓慢，不能开花结果，即使结果其种子也不能发芽或发芽率极低(Reinero and Beaehy 1986)。
寡聚糖不仅能够调控植物生长，还能够诱导植物产生抗性相关的活性物质，抑制病害的形成。目前，尚未见从疫霉真菌中分离葡聚糖激发子的报道。我们从烟草疫霉(Phytophthora parasitica)的培养滤液中分离纯化出一种葡聚糖类激发子，发现该激发子能诱导烟草对TMV的系统抗性，其对TMV的防治效果优于市售超敏蛋白。研究结果丰富了葡聚(寡)糖与病原菌互作的理论，同时也为日后开发应用新的生防农药提供了一定的理论支撑。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种疫霉多糖激发子，该多糖激发子分离纯化自烟草疫霉，经薄层层析分析，确定该多糖的单糖组成为葡萄糖，申请人将其命名为Gep1。
本发明的另一个目的在于提供了一种疫霉多糖激发子Gep1在提高植物抗病性中的应用。将其喷洒在植物叶面，它可以诱导烟草产生抗性，对烟草花叶病毒病有较好防效。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
一种疫霉多糖激发子Gep1，通过以下步骤制备得到：
1.将烟草疫霉(P.parasitica)的发酵液先用4层纱布过滤，再离心后收集上清液。氯仿、胰蛋白酶和蛋白酶K除去蛋白。再加入4×体积的无水乙醇放置于-20℃沉淀过夜，离心弃上清，沉淀经真空冷冻干燥得到的粉末即为粗多糖。
2.活性物质的分离纯化及有效成分鉴定：将上述获得的粗多糖溶于少量的蒸馏水中，依次通过DEAE-52纤维素柱层析和Sephadex G-100柱层析进一步分离纯化，硫酸-苯酚法检测糖含量绘制洗脱曲线。利用洗脱曲线各峰值的组分进行活性检测。在活性分析后，对有活性的物质进行真空冷冻干燥进行浓缩，即得疫霉多糖激发子Gep1。
市售的烟草疫霉或是已公开的烟草疫霉均能完成本发明。
以上所述的制备步骤，具体如下：
1.将发酵液先用4层纱布过滤，滤液于3000r/min离心10min后，收集上清液。用冷冻干燥法将得到的上清液浓缩成约原体积的1/10；向浓缩液中加入1/5体积的氯仿振荡20min，8000r/min离心10min，除去氯仿和部分蛋白，重复3次；继续向浓缩液中加入终浓度均为20μg/mL胰蛋白酶和蛋白酶K于37℃温育30min后，沸水煮沸5min，4℃、8000r/min离心取上清；向除去蛋白的浓缩液中加入4×体积的无水乙醇放置于-20℃沉淀过夜，4℃、8000r/min离心5min，弃上清，沉淀经真空冷冻干燥得到的粉末即为粗多糖；
2.粗多糖溶于蒸馏水后，加入无水乙醇，终浓度为60％，置于-20℃冰箱过夜，4℃、8000r/min离心20min取上清，向上清液中加入无水乙醇，使乙醇浓度达到80％后，置于-20℃冰箱过夜，4℃、8000r/min离心20min取沉淀，待乙醇完全挥发后加入蒸馏水重溶，得到80％乙醇沉淀多糖；取80％乙醇沉淀多糖于3000r/min离心10min，取上清液，备上样；待DEAE-52纤维素柱子下端流出液pH值为7.0开始上样，共上样4mL，依次用蒸馏水、0.1mol/L NaCl、0.5mol/L NaCl、1mol/L NaCl溶液洗脱，自动收集，流速1mL/min,每管6mL；苯酚-硫酸法跟踪检测，以试管数为横坐标，吸光度为纵坐标作图，得到粗多糖的洗脱曲线，合并含糖单一峰位，蒸馏水透析2d，检测其生物活性后，冷冻干燥；
取适量Sephadex G-100粉末，加入足够的蒸馏水室温下溶胀过夜，脱气后湿法装柱，0.01mol/L NaCl平衡过夜；将DEAE-52纤维素柱层析分级所得的活性组分溶于最小体积的 0.01 mol/L NaCl溶液中，加到已平衡好的Sephadex G-100柱，以0.01mol/L NaCl溶液为洗脱液，流速为1mL/6min，每管3mL，用自动部分收集器收集，苯酚-硫酸法检测多糖分布，以试管数为横坐标，吸光度为纵坐标作图，绘制洗脱曲线，分别收集各主峰，蒸馏水透析2d，检测其生物活性后，冷冻干燥，即得多糖激发子Gep1。
烟草疫霉的发酵方法如下：
将活化的烟草疫霉(P.parasitica)菌丝块接种于马铃薯蔗糖培养液中(马铃薯600g，20g葡萄糖，用水定容到1000mL，卡那霉素终浓度为50μg/mL)，26℃、200r/min黑暗培养24d，得到发酵液。
一种疫霉多糖激发子Gep1在提高植物抗病性中的应用，其应用过程是：
将Gep1溶液(2.0-5.0mg/mL)喷洒在植物叶面，可以诱导烟草产生抗性，对烟草花叶病毒病有较好防效。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1.本发明制备的疫霉多糖激发子Gep1诱导烟草抗病相关基因的表达及防卫物质的产生和积累，从而抑制病株体内TMV的增殖，使显症推迟，症状减轻，叶绿素含量显著高于未诱导病株。研究结果丰富了葡聚(寡)糖与病原菌互作的理论，同时也为日后开发应用新的生防农药提供了一定的理论支撑。
2.Gep1对TMV有较好的防治效果。室内盆栽实验，每隔七天进行采样，4次的统计调查结果为：4mg/mL Gep1处理组的防效依次为100.00％，93.00％，87.78％，67.39％。市售超敏蛋白处理组的防效依次为88.91％，84.46％，77.63％，50.86％。表明4mg/mL的Gep1对TMV的防治效果优于超敏蛋白，能有效地抑制TMV在烟草体内的增殖，降低发病率，推迟发病时间。
3.Gep1具热稳定性，可耐受酸碱，在100℃高温处理60min后和pH 2-12条件下仍具有活性。这为多糖激发子的田间应用奠定了很好的基础，可保证其效果的稳定性，且便于长期贮存。每升疫霉发酵液可分离获得6g多糖激发子，产量远高于蛋白质激发子。此外，由多糖激发子开发的生防农药的发酵原料来源丰富、生产成本低、无毒安全、无公害。多糖激发子施用在田间后，在植物体内、土壤和水体中易分解，无残留，对环境无污染，对人畜等非靶标生物相对安全，不易产生抗药性。因此，该产品将具有十分广阔的应用与市场前景，无论是生产企业，还是农作物种植者都将因此获得巨大的经济效益。
附图说明
图1为80％乙醇沉淀多糖DEAE-52纤维素柱层析洗脱曲线。
图2为峰II的Sephadex G-100柱层析洗脱曲线示意图。
图3为Gep1引起过敏反应产生坏死斑示意图。
图4为Gep1酸水解产物的薄层层析示意图。
图5为不同处理后的Gep1诱导的烟草过敏反应示意图。
图6为Gep1诱导烟草产生HR的最低浓度。
图7为Gep1处理烟草细胞不同时间的NO含量变化示意图。
*表示显著差异，P<0.05。
图8为DAB染色检测烟草体内H₂O₂的积累(200×)示意图。
图9为Gep1诱导的烟草细胞外质碱化示意图。
*表示显著差异，P<0.05；**表示极显著差异，P<0.01。
图10为苯胺蓝染色检测Gep1诱导的烟草叶片胼胝质的积累示意图。
图11为荧光检测Gep1诱导烟草叶片酚类物质的积累(200×)示意图。
图12为Gep1诱导烟草叶片防御相关酶的活性提高示意图。
图13为Gep1对TMV的体外钝化作用示意图。
图14为荧光定量PCR检测Gep1诱导烟草对TMV的抑制作用示意图。
*表示显著差异，P<0.05；**表示极显著差异，P<0.01。
图15为Gep1对感染TMV烟草叶肉细胞超微结构的影响示意图。
图16为Gep1诱导烟草过敏性反应基因的转录水平增加示意图。
图17为Gep1诱导烟草叶片多个抗性相关基因的转录水平增加示意图。
图18为多糖激发子Gep1对TMV防治的病情指数统计示意图。
图19为多糖激发子Gep1对TMV的防治效果统计示意图。
图20为Gep1的注射和采样部位示意图。
具体实施方式
本发明实施例所述技术方案，如未特别说明，均为常规技术，所用试剂如未特别说明，均来源于商业化渠道。
实施例1：
一种疫霉多糖激发子Gep1，通过以下步骤制备得到：
1.烟草疫霉(P.parasitica)发酵液的培养和粗多糖的提取：
将活化的烟草疫霉(P.parasitica)(中国农业微生物菌种保藏管理中心，菌株保藏号ACCC36285)菌丝块接种于(挑取菌落边缘处的直径为1cm的菌丝块)马铃薯蔗糖培养液250mL中(马铃薯600g，20g葡萄糖，用水定容到1000mL，卡那霉素终浓度为50μg/mL)，26℃、200r/min黑暗培养24d，，得到发酵液(菌体浓度为1x10⁷CFU/mL)。
将发酵液先用4层纱布过滤，滤液于3000r/min离心10min后，收集上清液。用冷冻干燥法将得到的上清液浓缩成约原体积的1/10。向浓缩液中加入1/5体积的氯仿振荡20min，8000r/min离心10min，除去氯仿和部分蛋白，重复3次。继续向浓缩液中加入胰蛋白酶和蛋白酶K(终浓度均为20μg/mL)于37℃温育30min后，沸水煮沸5min，4℃、8000r/min离心取上清。向除去蛋白的浓缩液中加入4×体积的无水乙醇放置于-20℃沉淀过夜，4℃、8000r/min离心5min，弃上清，沉淀经真空冷冻干燥得到的粉末即为粗多糖。
2.多糖激发子Gep1的分离纯化：
DEAE-52纤维素预处理。取50g DEAE-52加入500ml蒸馏水浸泡24h，去除悬浮细颗粒；加入0.5mol/L NaOH溶液浸泡2h，抽滤，蒸馏水洗至中性；再加入0.5mol/L HCl浸泡2h，抽滤，蒸馏水洗至中性；最后用0.5mol/L NaOH浸泡0.5h，抽滤，蒸馏水洗至中性，此时DEAE-纤维素已转化成OH-型，脱气后湿法装柱(2.0×50cm)，蒸馏水平衡。
粗多糖溶于蒸馏水后，加入无水乙醇，终浓度为60％，置于-20℃冰箱过夜，4℃、8000r/min离心20min取上清，向上清液中加入无水乙醇，使乙醇浓度达到80％后，置于-20℃冰箱过夜，4℃、8000r/min离心20min取沉淀，待乙醇完全挥发后加入蒸馏水重溶，得到80％乙醇沉淀多糖(多糖浓度为10mg/mL)。取80％乙醇沉淀多糖于3000r/min离心10min，取上清液，备上样。待柱子下端流出液pH值为7.0开始上样，共上样4mL，依次用蒸馏水、0.1mol/L NaCl、0.5mol/L NaCl、1mol/L NaCl溶液洗脱，自动收集(流速1mL/min,每管6mL)。苯酚-硫酸法跟踪检测，以试管数为横坐标，吸光度为纵坐标作图，得到粗多糖的洗脱曲线，合并含糖单一峰位，蒸馏水透析2d，检测其生物活性后，冷冻干燥。
多糖激发子生物活性检测：以具有5-7片真叶的烟草为材料，用1mL不带针头的注射器，取20μl(1mg/mL)多糖溶液从叶子背面注入叶片，以注射相同体积的蒸馏水作对照，每个处理重复3次。2d后观察是否有过敏反应的坏死斑形成，若出现了坏死斑，则说明该多糖溶液具备活性(以下同)。
结果如图1所示，图中：峰I、II、III、IV依次为蒸馏水、0.1mol/L NaCl、0.5mol/L NaCl和1mol/L NaCl溶液的洗脱峰。活性检测结果表明，峰II具有生物活性，收集该峰活性物 质，进一步采用Sephadex G-100柱层析分离纯化。
取适量Sephadex G-100粉末，加入足够的蒸馏水室温下溶胀过夜(1g Sephadex G-100加10ml蒸馏水)，脱气后湿法装柱(2.0×50cm)，0.01mol/L NaCl平衡过夜。将DEAE-52纤维素柱层析分级所得的峰II组分溶于最小体积的0.01mol/L NaCl溶液中，加到已平衡好的Sephadex G-100柱(2.0×50cm)，以0.01mol/L NaCl溶液为洗脱液，流速为1mL/6min，每管3mL，用自动部分收集器收集，苯酚-硫酸法检测多糖分布，以试管数为横坐标，吸光度为纵坐标作图，绘制洗脱曲线，分别收集各主峰，蒸馏水透析2d，检测其生物活性后，冷冻干燥，得到均一多糖。此时的均一多糖即为本发明所述的疫霉多糖激发子Gep1。该多糖激发子Gep1能够诱导烟草产生HR，形成明显的坏死斑(图3)。
以上所述的过夜时长为12-24h。
每升疫霉发酵液可分离获得6g多糖激发子。
实施例2：
多糖激发子Gep1的单糖组成分析：
称取多糖样品10mg放入安醅瓶，加入2mL 2M的三氟乙酸溶液，酒精喷灯封口，120℃水解3.5h。冷却后滤膜过滤除去不溶物，减压旋转蒸发除去三氟乙酸，再加少量甲醇洗涤，继续旋转蒸发，重复3次，除去残留的三氟乙酸，加0.5mL蒸馏水溶解。用20×20cm的硅胶板分离，展开剂为乙酸乙酯-吡啶-无水乙醇-水(体积比＝8:1:1:2)，显色剂为苯胺-二苯胺-磷酸(2％二苯胺丙酮溶液、2％苯胺丙酮溶液、85％磷酸按5:5:1的比例混合)。以溶于水的各单糖(葡萄糖、果糖、核糖、甘露糖、半乳糖、木糖、L-阿拉伯糖)标准液(10mg/mL)为参照。
结果如图4所示，其中1为Gep1的酸水解产物；2、3、4、5、6和7分别为葡萄糖、果糖、核糖、半乳糖、L-阿拉伯糖和木糖。Gep1的酸水解产物，经薄层层析分离后发现只有一个深蓝色的斑点，通过与标准单糖的Rf值比对后，确定其组成成分中只含有葡萄糖，无其他单糖成分。因此，确定Gep1为由葡萄糖组成的多糖。
实施例3：
检测多糖激发子Gep1的理化性质：
多糖激发子Gep1的热稳定性检测：取多糖激发子Gep1(1mg/mL)100μL，分别于40，60，70，80，90和100℃水浴中温育5min，然后将它们迅速置于冰上，冷却后4℃、12000 r/min离心5min，取上清。待溶液回复至室温后，按实施例2所述生物活性鉴定方法检测其生物活性。以蒸馏水作对照，每个处理重复3次。此外，取多糖激发子(1mg/mL)100μL，分别沸水浴20，30，40，50和60min，以及121℃高压湿热灭菌20min，用同上方法检测其生物活性。
结果如图5中A所示，图中a1-a6是分别经沸水浴20，30，40，50，60min，以及121℃高压湿热灭菌20min后的Gep1，a8-a13是分别经40，60，70，80，90和100℃处理后的Gep1，a7是蒸馏水对照。Gep1具有热稳定性，沸水浴处理60min后仍具有生物活性。
分析多糖激发子Gep1的耐酸碱性：取300μL多糖激发子(1mg/mL)分别加入pH 2，5，8，10，12的PBS中，室温静置1h，再用pH 7.5的Tris-HCl调pH至7.5后，按实施例2所述生物活性鉴定方法检测其活性。pH 7.5的PBS作对照，每个处理重复3次。
结果如图5中B所示，图中b2-b6是Gep1在pH 2,5,8,10,12的溶液里分别处理60min，b1是蒸馏水对照。不同pH下孵育的Gep1经生物活性检测，结果显示即使当pH＝2和pH＝12时，激发子Gep1仍具有活性。表明Gep1能耐受酸碱。
检测多糖激发子Gep1引起烟叶产生过敏反应的最低浓度：分别取0.001mg/mL，0.01mg/mL，0.1mg/mL，0.5mg/mL，1mg/mL，1.5mg/mL的多糖激发子水溶液，按照实施例2所述生物活性鉴定方法检测能够引起烟草叶片产生过敏反应的最低浓度。以蒸馏水为对照，每个处理重复3次。
结果如图6所示，图中C2-C7分别是0.001mg/mL，0.01mg/mL，0.1mg/mL，0.5mg/mL，1mg/mL和1.5mg/mL的Gep1。C1是蒸馏水对照。激发子Gep1可引起烟草过敏反应(HR)的最低浓度是0.5mg/mL。低于这一浓度则不能引起烟草产生HR；高于这一浓度则显示出随浓度增加，HR越加强烈的现象。1.5mg/mL Gep1能够引起烟草产生典型的HR。
实施例4：
Gep1诱导的烟草系统抗性反应：
(1)Gep1诱导NO的产生
取50mL烟草悬浮细胞，加入终浓度为0.4mg/mL的Gep1处理。每隔10min取样1次，每次取500μL。将取出的样品迅速放入液氮冻存，待用。样品沸水浴融化后，加入预热到95℃的1.5×CTAB 50μL，65℃温育30min，每5min上下颠倒1次。于12000r/min离心10min，取上清。用NO检测试剂盒测定NO含量，蒸馏水作对照。用细胞培养液稀释 标品NaNO₂后，制作标准曲线。
结果显示：Gep1诱导烟草悬浮细胞后，NO的生成量开始逐渐增加，且明显高于对照细胞，在激发子处理80min后，NO的生成量达到最大值，随后开始降低。对照细胞NO的量随时间缓慢升高一段时间趋于平稳后开始下降。(图7)
(2)Gep1激活过氧化氢的沉积
用0.4mg/mL的Gep1注射烟草叶片，处理24h后，将叶片置于玻璃平皿中，加入适量DAB染液，室温避光保存6h。取出叶片，放入盛有95％乙醇的烧杯中，至叶片绿色完全脱去，除去烧杯中液体。用50％甘油将叶片浸泡，用镊子小心赶出细胞间气泡，显微镜观察。蒸馏水作对照，每个处理重复3次。
结果如图8所示，其中图A是对照叶片，B是Gep1处理叶片。DAB可以与烟草叶片中产生的H₂O₂反应，形成红褐色斑点。通过观察红褐色斑点的产生，可对H₂O₂的产生位点和产生量进行观测。结果发现Gep1激发子处理后的烟草叶片产生的H₂O₂主要在叶脉组织和处理部位累积。
(3)Gep1诱导细胞外质的碱化
取新转接的烟草悬浮细胞培养3d(25℃，150r/min)后，加入终浓度为0.4mg/mL的Gep1继续在摇床上培养，并每隔10min用pH测定仪测定细胞培养基的pH值。以蒸馏水作对照，每个处理重复3次。
结果如图9所示，Gep1诱导烟草悬浮细胞后，使细胞外质的pH发生了明显变化。随着处理时间的增加，Gep1诱导胞外pH值不断升高，明显高于对照组；而对照细胞在整个检测过程中pH虽有所上升，但上升幅度较小。
(4)Gep1诱导胼胝质的产生
用20μL 0.4mg/mL的Gep1注射烟草叶片，24h后，将叶片放入缓冲液(1％戊二醛，5mmol/L柠檬酸，90mmol/L磷酸氢二钠，pH 7.4)中过夜。小心取出预处理的叶片，放入无水乙醇中沸水浴脱去叶绿素。用50％的乙醇清洗叶片2-3次后，转入漂洗缓冲液(67mmol/L磷酸氢二钾，pH 12)中，用染色缓冲液(0.1％苯胺蓝，67mmol/L磷酸氢二钾，pH 12)染色1h。取出染色的叶片用漂洗缓冲液冲洗1-2次，放入50％甘油中，用荧光显微镜进行固定观察。
结果图10所示，图10中A和a是对照；B和b为Gep1处理叶片。A，B在可见光下观察(100×)，a和b在紫外荧光显微镜下观察(100×)。胼胝质有利于加强细胞壁成分，是植物物理防御的物质之一。Gep1处理烟草叶片24h后，用苯胺蓝染色，在紫外荧光显微 镜下可观测到绿色荧光物质(如箭头所示)，而蒸馏水处理的叶片则没有出现这种荧光物质的积累。
(5)Gep1诱导酚类的产生和积累
取300μL烟草悬浮细胞，加入Gep1，使其终浓度为0.4mg/mL，于25℃，150r/min处理108h后，3000r/min离心10min，弃上清，加入适量PBS重悬细胞。取适量细胞放在载玻片上用盖玻片封住后，在紫外荧光显微镜(激发波长为395nm)下观察酚类物质的积累。
结果如图11所示，图11中A和a是对照，B和b为Gep1处理叶片。A，B在可见光下观察，a和b在紫外荧光显微镜下观察。酚类化合物具有抗氧化活性，是植物的次级代谢产物之一，它的积累有利于提高植物的抗病、抗逆性。Gep1处理烟草悬浮细胞108h后，用荧光显微镜可以明显地观察到酚类物质的产生和积累。
(6)过氧化物酶(POD)活性测定
选取长势相当的8叶期烟草，用4mg/mL的多糖激发子均匀喷雾整个植株的叶片正反面，连续喷雾3d，以蒸馏水处理为对照。处理前采样1次，喷雾后第4d开始每天采样1次，共8次。
准确称取烟草叶片0.25g放入预冷的研钵中，加入3mL 0.05M预冷的PBS缓冲液(pH7.0)和0.1g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)及少量石英砂，冰浴研磨成匀浆。4℃，12000r/min离心20min，取上清液即粗酶液，置-20℃冰箱中备用。
在比色管中，依次加入0.05M PBS(pH 7.0)1mL、1％愈创木酚1mL和粗酶液1mL，摇匀后于30℃恒温水浴5min。向管中加入0.3％H₂O₂1mL，摇匀后迅速将反应液倒入1cm光径比色杯中，于470nm下测定OD值增加速度。用加1mL蒸馏水的标准管校零，并计算POD活性。用蒸馏水校零。
POD活性(ΔOD·g^-1·min^-1)＝(ΔOD₄₇₀×V_T)/(FW×t×V₁)
式中t:反应时间(min)；V_T:样液总体积(mL)；V₁:测定时样品用量(mL)；FW:样品鲜重(g)。
结果如图12中A所示，Gep1可诱导烟草叶片一系列防御相关酶的活性提高。Gep1诱导4d后POD活性明显高于对照组(p＜0.05)，在诱导7d后POD活性达到最大值,约是对照组的3倍(p＜0.01)，与对照组极显著性差异，此后活性急剧下降，9d后趋于平衡，但仍较对照组高。
(7)多酚氧化酶(PPO)活性测定
PPO粗酶液提取与POD相同，不需稀释。测定时向比色管中加入0.05M PBS(pH 7.0)1.5mL和粗酶液0.1mL。30℃水浴2min后，加入0.02M邻苯二酚1.5mL，摇匀后迅速于420nm下测定OD值增加速度，并计算PPO活性。用蒸馏水校零。
PPO活性(ΔOD·g^-1·min^-1)＝(ΔOD₄₂₀×V_T)/(FW×t×V₁)
式中t:反应时间(min)；V_T:样液总体积(mL)；V₁:测定时样品用量(mL)；FW:样品鲜重(g)。
结果如图12中B所示，多糖激发子Gep1处理后烟草叶片PPO活性高于对照组。Gep1处理烟草后，PPO活性开始升高，7d时达到最大值，显著高于对照组(p＜0.05)，随后开始下降，其变化趋势与POD相似。
(8)苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性测定
准确称取烟草叶片0.25g放入预冷的研钵中，加入3mL 0.05M硼酸缓冲液(pH 8.4)和少量石英砂，冰浴研磨成匀浆。4℃，12000r/min离心20min，取上清夜即粗酶液，置于-20℃保存备用。
测定PAL活性时，分别向比色管中加入3.8mL 0.1M硼酸缓冲液、1mL 0.02ML-苯丙氨酸和0.2mL粗酶液。40℃水浴60min后加入1mL盐酸终止反应，测定OD₂₉₀值，并计算PAL活性。对照管用硼酸缓冲液代替粗酶液。
PAL活性(0.01ΔOD·g^-1·min^-1)＝(100×ΔOD₂₉₀×V_T)/(FW×t×V₁)
式中t:反应时间(min)；V_T:样液总体积(mL)；V₁:测定时样品用量(mL)；FW:样品鲜重(g)。
结果如图12中C所示，在Gep1处理后的全部检测时间内，PAL活性浮动较小。激发子处理6d后，PAL活性开始增加，9d时达到最大值，是对照组的1.6倍(p＜0.05)，随后随着时间的延长酶活性逐渐下降。
实施例5：
Gep1诱导烟草获得系统抗性
检测激发子Gep1诱导烟草系统获得系统抗性的浓度均采用4mg/mL。
TMV病毒汁液的制备：称取1g新鲜的已具有明显病毒症状的烟草叶片，放入研钵中，加入0.05M的PBS(pH 7.0)40mL和2g石英砂，研磨成匀浆后，2层纱布过滤，得到的病毒滤液(30个病毒粒子/ml)即可用来摩擦接种烟草，用于以下实验或实施例。
实验对象为长势健康、6-7叶期的心叶烟。选取植株上部的2片叶片，注射Gep1共15 μL。7d后，用脱脂棉蘸取病毒汁液及石英砂(0.5mL病毒滤液/叶片，0.1g石英砂/叶片)，沿着叶脉小心且均匀地涂抹在其余叶片上。以蒸馏水作对照。分别于接种病毒后48h和72h观察枯斑的形态与数量。按照下列公式计算枯斑抑制率：
枯斑面积抑制率＝[(对照组枯斑面积占叶片总面积百分比－实验组枯斑面积占叶片总面积百分比)/对照组枯斑面积占叶片总面积百分比]×100％
枯斑数量抑制率＝[(对照组枯斑数量－实验组枯斑数量)/对照组枯斑数量]×100％
结果显示：Gep1处理后的烟草对TMV的侵染有一定的抗性，表现在枯斑数量的减少和枯班面积的减小。Gep1诱导烟草叶片7d后接种TMV，分别在接种TMV 2d和3d后调查枯斑数和枯斑面积，结果显示，Gep1诱导组的枯斑数量和枯斑面积都明显低于对照组。A和a为对照组烟草在接种TMV后2d和3d时的照片；B和b为Gep1处理过的烟草在接种TMV后2d和3d时的照片。在接种TMV 2d和3d后，枯斑数量的抑制率分别达到了60.04％和60.57％；同时枯斑面积的抑制率也分别达到了76.66％和69.32％。表明Gep1处理后的烟草对TMV的侵染有一定的抗性和抑制作用。
(2)Gep1诱导烟草对TMV复制的抑制作用
选取长势相同的6-8叶期云烟87烟草苗，每组3棵。实验组用Gep1对整个植株叶片均匀喷雾，连续施用3d，每天1次，一次共喷淋150ml Gep1。分别用已市场化的超敏蛋白(Messenger,美国伊甸生物技术公司)和蒸馏水作对照。超敏蛋白按其产品说明书使用(50mg/L)。间隔7d后摩擦接种TMV(5ml病毒汁液/棵苗)。21d后采取各烟草的同一部位叶片，用荧光定量PCR检测烟草叶片的TMV含量。每组重复3次。具体操作步骤如下：
a.植物组织总RNA的提取及检测
利用Trizol试剂提取植物材料总RNA，具体方法如下：
液氮研磨烟草叶片，每1.5mL离心管分装0.1g样品；加入1mL Trizol试剂，迅速震荡混匀，室温静置10min；加200μL氯仿，剧烈震荡15s，室温静置5min；4℃，12000rpm离心15min；取水相(约400μL)，加400μL异丙醇颠倒混匀室温下静置10min，4℃，12000rpm离心15min，弃上清；加1mL 75％乙醇清洗RNA，离心弃上清；室温静置约15min，使RNA沉淀干燥；加20μL DEPC水溶解，取2μL进行甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，并用分光光度计(A260/A280)测定RNA浓度。
b.除去RNA中的DNA
用DNA I处理以除去RNA中的DNA。
反应体系为：10×reaction buffer with Mg²⁺      1μL
RNase-free DNase I                            1μL
RNase-free water                              Up to 10μL
反应条件为：37℃下孵育60min。
加入1μL的50mM的EDTA，65℃孵育10min，以除去DNA I。
c.反转录
参照Reverse Transcriptase M-ML(RNase H-)(TaKaRa)说明书进行。
首先是cDNA第一条链的合成。
合成体系为：

轻轻混匀，短暂离心后于42℃孵育60min。70℃反应10min终止反应。
d.荧光定量PCR检测烟草叶片中TMV含量
根据SYBR Premix Ex Taq^TMⅡ(Perfect Real Time)的说明书，进行Real-time PCR，反应体系为：SYBR Premix EX Taq^TMII(2×)12.5μL，ROX Reference DyeII(50×)0.5μL，qTMVF/qActinF(10μM)0.5μL，qTMVR/qActinR(10μM)0.5μL，cDNA 1μL，ddH₂O10μL，Total 25μL。
引物为：qTMVF:5′-TGCCGAAACGTTAGATGCTACTC-3′,
qTMVR:5′-AAGGAGCGCGATAAATAATTTAATAGTAGA-3′；
qActinF:5′-GGTAGCTCCACCTGAGAGGAAGT-3′,
qActinR:5′-GCCTTTGCAATCCACATCTGT-3′。
其中引物qTMVF和qTMVR扩增TMV的外壳蛋白(CP)的部分序列，qActinF和qActinR扩增烟草持家基因Actin。
反应条件：预变性阶段：95℃ 10s；PCR反应阶段：95℃ 6s，62℃ 35s，重复35个循环；熔解阶段：95℃ 15s，62℃ 60s，95℃ 15s，62℃ 15s。
求出ΔΔCT值，进行定量分析。
结果如图14所示：经Gep1处理的烟草，体内TMV CP基因的表达量是对照组的9％， 而超敏蛋白(Messenger)处理组是对照组的60％。说明Gep1诱导的烟草可显著抑制TMV在烟草体内的增殖。
(3)观察Gep1对感染TMV烟草叶肉细胞超微结构的影响
对烟草的预处理方法同步骤(1)。分别于接种TMV 7d、14d和21d采取烟草同一叶位的病毒感染部位，进行固定、脱水、包埋和切片，然后置于透射电镜下进行超微结构观察。以蒸馏水作为对照。
结果如图15所示：图15中A1，a1:对照组感染TMV 7d后；B1，b1:Gep1处理组感染TMV 7d后；A2，a2:对照组感染TMV 14d后；B2，b2:Gep1处理组感染TMV 14d后；A3，a3:对照组感染TMV 21d后；B3，b3:Gep1处理组感染TMV 21d后。Ch.叶绿体；CW.细胞壁；M.线粒体；N.细胞核；Os.嗜锇颗粒；P.TMV病毒粒子；S.淀粉粒；PC.病毒包含体。健康的烟草植株细胞中含有大量的叶绿体，且在细胞边缘紧密排列。发育完全的叶绿体呈扁椭球状，具有清晰的双层膜结构，内含大的淀粉粒和嗜锇颗粒，基粒片层致密(B1)。受TMV侵染的烟草细胞中，叶绿体内的淀粉粒和嗜锇颗粒数量减少，叶绿体严重肿胀，基粒分散，基质不均一，部分叶绿体解体(a3)；细胞质中出现晶体状内含体，先是分布在叶绿体周围(a2和a3)，之后充满整个细胞质(A3)。Gep1处理过的烟草叶肉细胞中存在极少量病毒粒子，且病毒粒子断裂，长短不一(b2)；细胞器的完整度较好；叶绿体具完整的膜结构，基粒片层排列整齐，内含少量小的淀粉粒(B3)；细胞质中出现菱形包含体，存在于叶绿体周围，放大观察可以看到纵横排列的条纹，外被膜状物(b3)。说明Gep1不仅可以抑制TMV对细胞的侵染，还可以抑制TMV在烟草细胞内的增殖。
(4)多糖激发子诱导烟草过敏性反应基因和抗性相关基因的表达
A.总RNA的提取及cDNA第一链的合成
选取长势相同的8叶期三生烟，每组3棵苗。检测激发子诱导HR基因(hypersensitive response)表达时，用4mg/mL多糖激发子注射烟草第6、7和8位叶片的A部位(图20)(共注射60μL)，采取B部位叶片，采样时间为Gep1处理后0h，3h，6h，12h，1d，3d，5d，7d，9d。对诱导抗性基因表达检测的烟草用4mg/mL多糖激发子喷雾烟草的第6、7和8位叶片(共喷雾20mL)，采取第4和5位叶，采样时间同HR基因表达检测。对植物组织总RNA进行提取和检测，除去RNA中的DNA，反转录均同上。
b.特异引物的设计
抗性基因表达分析采用半定量RT-PCR的方法，以在烟草中高度保守的基因qActin作内参。在进行反转录前需保证每个样品的RNA量相同。引物序列如表1所示。
c.HR和抗性基因的RT-PCR扩增
取上述反转录的第一链cDNA为模板，扩增抗性基因。反应体系为：

扩增条件：94℃预变性4min；94℃变性30s、50-55℃退火30s、72℃延伸40s、35个循环；最后72℃延伸8min。PCR产物结果在1.2％琼脂糖凝胶中检测。
表1 HR和抗性相关基因特异性引物


过敏性反应基因检测结果如图16所示：烟草过敏性反应标记基因hrs203J和hin1在Gep1诱导后转录量开始不同程度的增加，hrs203J的转录量高于hin1，12h时达到最大值。而hin1在整个观测时间内的转录量持续增加。
抗性相关基因检测结果如图17所示：水杨酸(SA)途径的关键调控蛋白基因NPR1和EDS1在Gep1处理后转录量开始增加，并在7d时转录量达到最大值；PR1-a在被诱导后的12h开始转录，7d时达到最大值。此外，Gep1还能够诱导烟草抗性基因PR-3的增加，PR-3在Gep1诱导后12h转录量达到最大值(图17中A)。茉莉酸(JA)途径标记基因PDF1.2、JA合成途径相关酶基因LOX(lipoxygenase)以及其受体蛋白基因NtCOI1也在激发子诱导后便开始转录，分别于1d、12h和5d转录量达到最大值后开始下降。NtCOI1是JA途径调控基因，调节PDF1.2基因的表达。乙烯(ET)的受体蛋白基因ETR1和生物合成途径关键酶基因ACS1，一直到观察时间结束，也未见这两个基因被转录，分析Gep1诱导的系统抗性并不依赖于乙烯途径。茉莉酸/乙烯(JA/ET)协同作用通路的关键调控元件ERF1从Gep1诱导后转录量便开始一直增加，直到6d后开始下降。PR1-b在Gep1处理后转录量开始增加，并在7d时转录量达到最大值。此外，Gep1还能够诱导烟草抗性基因PR-5转录量的增加PR-5在Gep1诱导后3h开始，此后转录量持续增加(图17中B)。说明Gep1既可以诱导烟草产生依赖于SA的系统获得性抗性(SAR)，又可以诱导烟草产生依赖于JA的诱导系统抗性(ISR)，ISR主要是通过JA途径。在烟草中，蛋白激酶(MAPK)基因NtMEK2在Gep1诱导后转录 量持续增加，直到第7d达到最大值，NtMEK2激活的下游2个逆境响应蛋白激酶SIPK(水杨酸感应蛋白激酶)和WIPK(烟草伤口感应蛋白激酶)的基因均在Gep1诱导3h后转录量开始持续增加，直到第7d。SIPK基因的激活伴随有活性氧爆发相关基因RBOHB和清除活性氧的酶基因APX的转录。WIPK基因的激活伴随有NO产生相关基因NTF4和NOA1的转录。从而爆发活性氧和产生NO参与防卫反应。NPK1基因在烟草的生长发育调节和抗逆等生理过程中起重要作用，在Gep1诱导6h后，NPK1转录量开始增加，1d后达到最大值(图17中C)。苯丙氨酸解氨酶基因PAL经Gep1诱导后转录量在7d内持续上升，之后下降。PR-10可降解部分入侵病毒的RNA。PR-10经Gep1诱导后转录量开始持续增加，分析PR-10可增强寄主对病毒的抗性。植物钙网织蛋白家族基因的高表达可增加Ca²⁺的储存量，触发相关基因的表达和调节代谢途径，阻止病毒在胞间联丝的移动，阻断病毒在细胞间传输。Gep1诱导CRT的转录状况与PR-10相似，转录量在观察时间内持续增加，CRT表达增强有助于阻止病毒在寄主体内的传输，从而控制病毒病(图17中D)。但是在观察时间内未见具有β-1,3葡聚糖酶活性的PR-2基因转录。通过系统抗性相关基因的转录结果，说明Gep1可以诱导烟草植株产生系统性抗性，并且依赖于SA、JA等信号途径。
实施例6：
Gep1在提高植物对病毒抗性中的应用，其步骤如下：
室内盆栽实验检测多糖激发子Gep1对TMV的防治效果
选取长势相当的8叶期云烟87烟草苗，分别用2mg/mL、3mg/mL或4mg/mL的多糖激发子均匀喷雾整个植株叶片正反面，早晚各1次(每次喷淋50ml/棵苗)，连续喷雾3d，以蒸馏水和超敏蛋白(1mg/mL)处理为对照。间隔10d后在烟苗心叶上轻轻摩擦接种实施例5制备的TMV(接种量为5ml病毒汁液/棵苗)。接种前采样一次，之后每隔7d采一次样，统计病毒病的发病情况和防治效果。当有烟草苗开始发病时进行第1次调查统计(以株为单位分级调查，在晴天中午以后调查)，之后每隔7d统计1次，共统计4次。
烟草TMV病害严重度分级标准：0级：全株无病。1级：心叶脉明或轻微花叶，病株无明显矮化。3级：1/3叶片花叶但不变形，或病株矮化为正常株高的3/4以上。5级：1/3-1/2叶片花叶，或少数叶片变形，或主脉变黑，或病株矮化为正常株高的2/3-3/4。7级：1/2-2/3叶片花叶，或变形，或主侧脉坏死，或病株矮化为正常株高的1/2-2/3。9级：全株叶片花叶，严重变形或坏死，或病株矮化为正常株高的1/2以上。
按下列公式分别计算病情指数和防治效果：
病情指数＝[Σ(各级病株×该病级值)/(调查总株数×最高级值)]×100
防治效果/％＝[(对照病情指数－处理病情指数)/对照病情指数]×100％
结果显示，室内盆栽实验数据显示，多糖激发子Gep1处理后的烟草，病毒病显症明显推迟，症状减轻(图18)，2mg/mL和3mg/mL多糖处理组对TMV的防治效果低于超敏蛋白处理组。4mg/mL多糖处理组的防效在4次统计中依次为100.00％，93.00％，87.78％和67.39％，均比超敏蛋白处理组相应的88.91％，84.46％，77.63％和50.86％要高出10个百分点左右。表明，激发子Gep1对TMV的抗性效果优于已市场化的超敏蛋白和氨基壳寡糖，是一种具有明显抗TMV作用的激发子(图19)。