一种具有生物活性的软骨修复材料及其制备方法技术领域
本发明属于生物医学工程技术领域，特别是软骨修复材料制备技术领域，具体涉
及一种具有生物活性的软骨修复材料及其制备方法。
背景技术
软骨是覆盖在关节之间的结蹄组织，由于其缺少血管、干细胞和生长因子，因此其
一旦受损就难以复原。治疗软骨缺损主要治疗方法是通过手术治疗或组织工程技术。手术
治疗最常见的包括关节镜清创术、骨髓刺激治疗和软骨及软骨细胞移植，但均存在缺陷，如
关节镜清创手虽对早期关节炎效果显著，但缺乏长期的疗效；骨髓刺激治疗只能缓解软受
损带来的痛苦但不能治愈损伤；自体移植则受到供体来源所限，难以实现大面积的软骨缺
损修复，异体软骨移植则会出现免疫排异等不良反应。
组织工程软骨要求将细胞培养、生物支架材料和生长因子三者结合，但目前在细
胞选择、支架制作、生长因子的负载和释放等各方面均需深入研究。其中一个难点就是外源
性生长因子在体内半衰期短，不利于细胞增殖和分化。目前，有多种控释方式被用于软骨组
织工程中，如水凝胶包埋，微球负载等，但这些方法均存在着不足之处。首先，常规方法制备
的水凝胶或者微球其孔隙率，结构尺寸和微孔结构的连通性均只能控制在一定范围而不能
精确在某一特定数值。而在生长因子负载到支架材料时，由于人为操作的影响，生长因子的
负载率有一定随机性。在整个制备的的过程中，需要先制成支架材料，再进行生长因子负
载，整个过程所需时间较长。虽然上述的传统的组织工程软骨修复材料的制备方法简单，但
是在组织结构、生物学性能与软骨组织存在差距。
三维打印技术（3D-printing）在生物组织工程中的研究国内外已有大量的研究报
道，其中生物三维打印已在个性化医疗模型、仿生支架、药物缓释模式等方面应用，这为软
骨修复材料的发展带来了新方向。生物三维打印其所打印的材料主要是以细胞、生物材料
或是生长因子，利用计算机辅助软件建模后，控制打印机沉积细胞或者生物材料的速度和
位置，来实现仿生活性支架或是仿生材料的制造。在组织工程的应用上，生物三维打印能一
步到位地根据实际所需精准地构建修复材料的内外结构，而且能使生长因子均匀分布，所
构建的组织修复材料与正常人体组织高度相似。而且采用生物三维打印来制备组织工程软
骨，可以克服支架制备耗时长，精度不高等问题。
骨形态发生蛋白是目前发现唯一能够单独诱导成骨生长的生长因子，其中BMP-2
的成骨能力最为突出。而基因重组后所得的rhBMP-2在诱导成骨时间、成骨的量、血管和骨
髓样组织形成等方面明显优于天然BMP-2。BMP-2参与BMP-2/Smads/Msx2/Osterix信号通路
和BMP-2/Smads/Runx2/Osterix信号通路，通过激活Smads信号，转导和调节成骨基因转录
而发挥其成骨作用；能诱导间充质细胞向软骨细胞分化，使新生软骨内的蛋白多糖和胶原
纤维的含量更加趋近正常软骨细胞合成的Ⅱ型胶原和蛋白多糖含量，长期维持体外培养的
软骨细胞表型。
发明内容
本发明的目的在于针对现有的组织工程软骨修复材料制备精度不高，生物活性成
分分布不均，材料制备需时过长等缺陷，提供一种具有生物活性的软骨修复材料及其制备
方法，该软骨修复材料免疫原性低，材料来源丰富，具有良好的生物相容性，骨诱导能力和
血管化能力。本发明通过三维打印技术制备得到的具有生物活性的软骨修复材料，可根据
受损部位实际情况进行建模，能真正地达到个性化治疗。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：一种具有生物活性的软骨修复材料为多
层矩形结构，由海藻酸钠和重组人骨形态发生蛋白（rhBMP-2）构成。
进一步的，所述的软骨修复材料按重量份数计由海藻酸钠10份和重组人骨形态发
生蛋白（rhBMP-2）0.01~0.1份组成。
优选的，所述的海藻酸钠的分子量为2~3×105g/mol，购自美国Sigma公司，重组人
骨形态发生蛋白（rhBMP-2）购自美国PeproTech公司。
为实现上述目的，本发明的另一技术方案为：一种具有生物活性的软骨修复材料
的制备方法，所述的制备方法通过以下步骤实现：凝固收集平台的准备；生物活性打印材料
的制备；通过3D打印机技术将生物活性打印材料打印在凝固收集平台上，层层累加后，形成
多层矩形结构的具有生物活性的软骨修复材料。
进一步的，所述凝固收集平台的制备具体步骤为：在一次性细胞培养皿中，加入质
量浓度为0.5%的聚乙烯亚胺溶液至刚好浸没培养皿的底部，将盛有聚乙烯亚胺溶液的培养
皿置于37℃的细胞培养箱中放置24小时，使培养皿内壁覆盖上聚乙烯亚胺层，将培养皿中
多余的聚乙烯亚胺溶液弃去，用去离子水冲洗培养皿2~3次；再加入质量浓度为2%的氯化钙
溶液，加入氯化钙溶液的体积为培养皿容积的二分之一，将盛有氯化钙溶液的培养皿置于
3D打印机的工作平台上，形成凝固收集平台。
更进一步的，所述生物活性打印材料的制备具体如下：
（1）按配方量将海藻酸钠溶于去离子水中，配成质量浓度为2%的海藻酸钠溶液；
（2）按配方量将干态的重组人骨形态发生蛋白（rhBMP-2）加入去离子水中，配成质量浓
度为2% 的rhBMP-2生长因子溶液；
（3）将步骤（2）配成的rhBMP-2生长因子溶液与步骤（1）配成的海藻酸钠溶液等体积混
合，得到生物活性打印材料。
优选的，所述的3D打印机技术采用气体动力喷射打印，温度控制在35~37℃，通过
CAD或Solidwords 电脑辐照软件建立打印模型。
优选的，所述的聚乙烯亚胺的分子量为25kD。
本发明的有益效果为：
（1）本发明公开的具有生物活性的软骨修复材料具有免疫原性低，原材料丰富，价格低
廉，制备方法简单的优点。
（2）本发明以海藻酸钠作为软骨修复材料的基质，与重组人骨形态发生蛋白
（rhBMP-2）复合后，利用三维打印技术进行仿生打印，这不仅克服了传统软骨修复材料因为
没有生物活性而不能达到真正地修复治疗效果，同时通过三维打印技术所制得的软骨修复
材料，可以根据患者受损部位实际情况建模，能真正达到个性化治疗。
（3）本发明制备的具有生物活性的软骨修复材料，是采用生物三维打印技术，通过
将基质材料和生长因子复合后再进行仿生打印；相比于传统的组织工程软骨材料制备方
法，本发明所公开的制备方法具有支架微结构精确成型，生长因子在支架中能均为分布，且
能达到缓释效果，能有效克服外源性生长因子在体内半衰期短的难题。
附图说明
图1为实施例1～3所制备的具有生物活性的软骨修复材料与对比例的rhBMP-2体
外释放实验结果对比图；
图2为实施例1～3所制备的具有生物活性的软骨修复材料与对比例的ALP值检测结果
对比图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。
实施例1
一种具有生物活性的软骨修复材料为多层矩形结构，由海藻酸钠和重组人骨形态发生
蛋白构成；按重量份数计由海藻酸钠10份和重组人骨形态发生蛋白0.01份组成；所述的海
藻酸钠的分子量为2~3×105g/mol，购自美国Sigma公司，重组人骨形态发生蛋白购自美国
PeproTech公司。
实施例2
一种具有生物活性的软骨修复材料为多层矩形结构，由海藻酸钠和重组人骨形态发生
蛋白构成；按重量份数计由海藻酸钠10份和重组人骨形态发生蛋白0.05份组成；所述的海
藻酸钠的分子量为2~3×105g/mol，购自美国Sigma公司，重组人骨形态发生蛋白购自美国
PeproTech公司。
实施例3
一种具有生物活性的软骨修复材料为多层矩形结构，由海藻酸钠和重组人骨形态发生
蛋白构成；按重量份数计由海藻酸钠10份和重组人骨形态发生蛋白0.1份组成；所述的海藻
酸钠的分子量为2~3×105g/mol，购自美国Sigma公司，重组人骨形态发生蛋白购自美国
PeproTech公司。
实施例4
实施例1～实施例3任一例一种具有生物活性的软骨修复材料，其制备方法的具体步骤
如下：
（1）凝固收集平台的准备：在一次性细胞培养皿中，加入质量浓度为0.5%的聚乙烯亚胺
溶液至刚好浸没培养皿的底部，将盛有聚乙烯亚胺溶液的培养皿置于37℃的细胞培养箱中
放置24小时，使培养皿内壁覆盖上聚乙烯亚胺层，将培养皿中多余的聚乙烯亚胺溶液弃去，
用去离子水冲洗培养皿2~3次；再加入质量浓度为2%的氯化钙溶液，加入氯化钙溶液的体积
为培养皿容积的二分之一，将盛有氯化钙溶液的培养皿置于3D打印机的工作平台上，形成
凝固收集平台，待用；所述的聚乙烯亚胺的分子量为25kD；
（2）生物活性打印材料的制备：按配方量将海藻酸钠溶于去离子水中，配成质量浓度为
2%的海藻酸钠溶液；按配方量将干态的重组人骨形态发生蛋白（rhBMP-2）加入去离子水中，
配成质量浓度为2% 的rhBMP-2生长因子溶液；将配成的rhBMP-2生长因子溶液与配成的海
藻酸钠溶液等体积混合，得到生物活性打印材料，备用；
（3）软骨修复材料的打印：通过CAD或Solidwords 电脑辐照软件建立打印模型，3D打印
机采用气体动力喷射打印方式，温度控制在35~37℃，将步骤（2）制备的生物活性打印材料
打印在步骤（1）制备的凝固收集平台上，层层累加后，形成多层矩形结构的具有生物活性的
软骨修复材料。
实施例5
对比例：为负载了rhBMP-2的海藻酸钠/壳聚糖复合软骨修复材料（支架材料参考申请
号为CN201310641686.8所公开的软骨组织工程支架材料及其制备方法的制备方法所制得，
再将rhBMP-2负载到海藻酸钠/壳聚糖软骨修复材料上）。
实验组1~3：为实施例1～3所得的具有生物活性的软骨修复材料，采用实施例4的
方法制备而成。
将上述实施例1～3所制备的具有生物活性的软骨修复材料与对比例进行rhBMP-2
释放实验，对比实施例1~3和对比例对创面的修复效果。实验结果如图1示。
从上图结果可知，对比例从实验开始至rhBMP-2完全释放均较同时间点的实验组1
~3的释放率高，且在5天到10天这段时间有一个明显的突释过程，到16天时已完全释放，不
能达到长效持续释放的效果。而实施例1~3虽然在5-7天、15-20天这两个时间段分别有两个
突释的过程，但之后均有一个缓释的平台期，整个释放过程属于缓释过程。由此可见，本发
明通过3D打印机技术所制备的具有生物活性的软骨修复材料，具有长效持续释放rhBMP-2
的效果，能克服rhBMP-2在体内半衰期短的不足之处。
实施例6
对比例：为负载了rhBMP-2的海藻酸钠/壳聚糖复合软骨修复材料（支架材料参考申请
号为CN201310641686.8所公开的软骨组织工程支架材料及其制备方法的制备方法所制得，
再将rhBMP-2负载到海藻酸钠/壳聚糖软骨修复材料上）。
实验组1~3：为实施例1～3所得的具有生物活性的软骨修复材料，采用实施例4的
方法制备而成。
将上述实施例1～3所制备的具有生物活性的软骨修复材料与对比例分别与MG-63
（人成骨肉瘤细胞）进行共培养7天后对其ALP值进行检测，以此评价实施例1~3和对比例的
成骨诱导能力。实验结果如图2示。
碱性磷酸酶（alkaline phosphate ALP）是分化成骨细胞的标志物，能促进骨基质
的矿化。从上图可知，与对比例相比，实施例1~3的ALP值明显较对比例要高。由此可见，本发
明通过3D打印机技术所制备的具有生物活性的软骨修复材料具有较高的骨诱导能力。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对
本发明的实施方式的限定；对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可
以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举；凡在本
发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求
的保护范围之内。