检测纤维二糖酶抑制剂的方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103411928 A (43)申请公布日 2013.11.27 CN 103411928 A *CN103411928A* (21)申请号 201310302482.1 (22)申请日 2013.07.18 G01N 21/55(2006.01) C12Q 1/34(2006.01) (71)申请人 湖南大学 地址 410082 湖南省长沙市河西岳麓山湖南 大学环境科学与工程学院 (72)发明人 黄丹莲 刘亮 曾光明 赖萃 张辰 许飘 赵美花 黄超 李宁杰 李雪 (74)专利代理机构 湖南兆弘专利事务所 43008 代理人 赵洪 (54) 发明名称 检测纤维二糖酶抑。

2、制剂的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种检测纤维二糖酶抑制剂的 方法， 包括将一种纳米金探针溶液加入含待测物 质的纤维二糖酶溶液中， 检测温度控制在 30 35， 检测 pH 值控制在 4.0 4.5， 待纳米金探针 反应完全后， 检测含待测物质的溶液体系中纳米 金探针吸收峰在 620nm 处的吸光度与 520nm 处的 吸光度比值 A620/A520， 设为 A2； 同等条件下， 检 测不含待测物质的溶液体系中纳米金探针的吸光 度比值 A620/A520， 设为 A1； 比较 A2和 A1的大小， 即可判断待测物质是否为纤维二糖酶抑制剂， 并 计算出抑制率。本发明的方法快速、 灵敏、 成。

3、本低 廉、 且对环境无害。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 10 页 附图 6 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书10页 附图6页 (10)申请公布号 CN 103411928 A CN 103411928 A *CN103411928A* 1/1 页 2 1. 一种检测纤维二糖酶抑制剂的方法， 该方法包括以下步骤 ： 将一种用于检测纤维二 糖酶活性的纳米金探针溶液加入含待测物质的纤维二糖酶溶液中， 所述纳米金探针溶液与 所述纤维二糖酶溶液的体积比为201， 其中每20体积的纳米金探针溶液中含有24体 积的纳米金探针浓缩液。

4、， 将检测温度控制在3035， 检测pH值控制在4.04.5， 待纳 米金探针反应完全后， 检测含待测物质的溶液体系中纳米金探针表面等离子体共振吸收峰 强度变化， 得到吸收峰在620nm处的吸光度与520nm处的吸光度比值A620/A520， 设为A2； 同 等条件下， 将所述纳米金探针溶液加入不含待测物质的纤维二糖酶溶液中， 检测不含待测 物质的溶液体系中纳米金探针表面等离子体共振吸收峰强度变化， 得到吸收峰在 620nm 处 的吸光度与 520nm 处的吸光度比值 A620/A520， 设为 A1； 比较 A2和 A1的大小， 即可判断待测 物质是否为纤维二糖酶抑制剂 ； 当 A2 A1时。

5、， 表明待测物质为纤维二糖酶抑制剂， 所述纤维二糖酶抑制剂对纤维二糖 酶活性的抑制率计算方程为 ： 其中， I 为纤维二糖酶抑制剂对纤维二糖酶活性的抑制率， C1为不含纤维二糖酶抑制剂 时纤维二糖酶的活性数值， C2为含纤维二糖酶抑制剂时纤维二糖酶的活性数值 ； 所述纳米金探针包括纳米金颗粒， 所述纳米金颗粒上修饰有纤维二糖和 6- 巯基 己 -1- 醇。 2. 根据权利要求 1 所述的检测纤维二糖酶抑制剂的方法， 其特征在于 ： 所述纳米金探 针的粒径为 40nm 60nm。 3. 根据权利要求 1 所述的检测纤维二糖酶抑制剂的方法， 其特征在于 ： 所述纳米金探 针的 Zeta 电位为 -。

6、30mV -40mV。 4.根据权利要求13中任一项所述的检测纤维二糖酶抑制剂的方法， 其特征在于， 所 述纳米金探针主要由以下方法制备得到 ： 在配好的纤维二糖溶液中加入氯金酸溶液和硼氢 化钠溶液， 充分混匀且反应完全后， 将得到的反应产物低速离心纯化以去除沉积颗粒， 再于 上清液中加入 6- 巯基己 -1- 醇进行培养， 培养完成后高速离心纯化， 将高速离心后的沉淀 重溶于超纯水中， 得到含有用于检测纤维二糖酶活性的纳米金探针的溶液。 5. 根据权利要求 4 所述的检测纤维二糖酶抑制剂的方法， 其特征在于 ： 所述氯金酸、 硼 氢化钠、 纤维二糖的摩尔用量比为 1 （16.3 18.4） 。

7、（1.2 6） 。 6. 根据权利要求 4 所述的检测纤维二糖酶抑制剂的方法， 其特征在于 ： 所述氯金酸与 6- 巯基己 -1- 醇的摩尔用量比为 1 （0.002 0.004） 。 7. 根据权利要求 4 所述的检测纤维二糖酶抑制剂的方法 ： 所述加入 6- 巯基己 -1- 醇 进行培养时的温度控制在 30 37， 培养时间为 2h 2.5h。 8. 根据权利要求 4 所述的检测纤维二糖酶抑制剂的方法， 其特征在于 ： 所述低速离心 时的转速为 1200rpm 1500rpm， 所述高速离心时的转速为 12000rpm 15000rp。 权 利 要 求 书 CN 103411928 A 2。

8、 1/10 页 3 检测纤维二糖酶抑制剂的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种生物技术领域中检测酶抑制剂的方法， 尤其涉及一种检测纤维二 糖酶抑制剂的方法。 背景技术 0002 纤维素酶是由能降解木质素的微生物分泌的一种多组分复合酶， 它包括内切型葡 聚糖酶 （EC3.2.1.4， 也称 CX 酶、 CMC 酶） 、 外切型葡聚糖酶 （EC3.2.1.91， 也称 C1酶、 微晶纤 维酶） 和纤维二糖酶 （EC3.2.1.21， 也称 - 葡萄糖苷酶） 三种主要组分。普遍认为在将天 然纤维素降解成葡萄糖的过程中， 必须依靠这三种组分的协同作用才能完成。纤维素大分 子首先在C1酶和CX酶的作。

9、用下逐步降解成纤维二糖， 而纤维二糖酶则进一步将纤维二糖水 解成葡萄糖。在利用纤维素酶制剂水解纤维素的过程中， 常常由于纤维二糖酶的活力很低 造成纤维二糖的累积， 而纤维二糖又会对纤维素酶的催化作用形成强烈的反馈抑制。因此 在纤维素酶解过程中提高纤维二糖酶的活力意味着提高纤维素水解效率和葡萄糖产量。 0003 实际应用中纤维二糖酶的活性会受到环境因素的抑制， 例如土壤中的汞、 铜等重 金属会通过富集作用进入植物体内， 而木质素降解功能微生物在处理这些含重金属的植物 残体时， 由于这些重金属存在， 会抑制木质素降解功能微生物的生物活性， 并且这些重金属 能使纤维二糖酶的必需基团或活性部位的性质和。

10、结构发生改变， 导致酶活性降解或丧失， 从而抑制纤维素的降解效率。 因此一种特异性高效检测纤维二糖酶活性抑制剂的方法能有 效提高纤维二糖酶的实际应用价值。 0004 目前， 检测纤维二糖酶活性抑制剂的方法普遍是基于纤维二糖酶活性测定方法， 其中Barush和Swiain法是以水杨苷为酶反应底物， 检测水解后产生的极微量的葡萄糖， 反 应易受干扰， 且检测灵敏度不高 ； 荧光法灵敏度高且快速， 但是由于实验过程操作复杂， 且 重现性不好， 现在应用不多 ； 比色法是以对硝基苯基 -D- 葡萄糖苷 （pNPG） 为酶底物， 检 测底物水解后释放出来的对硝基苯酚， 而对硝基苯酚是一种很难被生物降解的。

11、、 危害环境 的高毒性有机物。因此， 研究一种简便高效且对环境无害的纤维二糖酶抑制剂检测方法是 亟待解决的问题。 发明内容 0005 本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足， 提供一种更加快速、 灵敏、 且对 环境无害、 成本低廉的检测纤维二糖酶抑制剂的方法。 0006 为解决上述技术问题， 本发明采用的技术方案为一种检测纤维二糖酶抑制剂的 方法， 该方法包括以下步骤 ： 将一种可用于检测纤维二糖酶抑制剂的纳米金探针溶液加入 含待测物质的纤维二糖酶溶液中， 所述纳米金探针溶液与所述纤维二糖酶溶液的体积比 为 20 1， 其中每 20 体积的纳米金探针溶液中含有 2 4 体积的纳米金探针浓缩。

12、液 （所 述浓缩液为纳米金探针制备时高速离心后的含纳米金探针沉淀的浓缩液） ， 将检测温度控 制在 30 35， 检测 pH 值控制在 4.0 4.5， 待纳米金探针反应完全后 （一般至少反应 说 明 书 CN 103411928 A 3 2/10 页 4 10min） ， 检测含待测物质的溶液体系中纳米金探针表面等离子体共振吸收峰强度变化， 得 到吸收峰在620nm处的吸光度与520nm处的吸光度比值A620/A520， 设为A2； 同等条件下， 即 纳米金探针溶液与纤维二糖酶溶液的体积比、 检测温度、 检测 pH 值、 反应时间等条件均相 同的情况下， 将所述纳米金探针溶液加入不含待测物质。

13、的纤维二糖酶溶液中， 检测不含待 测物质的溶液体系中纳米金探针表面等离子体共振吸收峰强度变化， 得到吸收峰在 620nm 处的吸光度与520nm处的吸光度比值A620/A520， 设为A1 ； 比较含待测物质的溶液体系中纳 米金探针表面等离子体共振吸收峰强度变化 （以 A2为代表） 和不含待测物质的溶液体系中 纳米金探针表面等离子体共振吸收峰强度变化 （以 A1为代表） 的大小， 即可判断待测物质是 否为纤维二糖酶抑制剂 （定性检测） ； 0007 当 A2 A1时， 表明待测物质为纤维二糖酶抑制剂， 所述纤维二糖酶抑制剂对纤维 二糖酶活性的抑制率计算方程为 ： 0008 0009 其中， I。

14、 为纤维二糖酶抑制剂对纤维二糖酶活性的抑制率， C1为不含纤维二糖酶抑 制剂时纤维二糖酶的活性数值， C2为含纤维二糖酶抑制剂时纤维二糖酶的活性数值 ； 0010 所述纳米金探针包括纳米金颗粒， 所述纳米金颗粒上修饰有纤维二糖和 6- 巯基 己 -1- 醇。 0011 上述的抑制效率计算方程主要基于以下原理得到 ： 纤维二糖酶溶液中不含抑制 剂时， 纤维二糖酶的活性与纳米金探针表面等离子体共振吸收峰强度呈线性关系， 线性回 归方程为 A=0.3642n+0.6273， 其中 A 优选为紫外可见吸收光谱图中 620nm 处的吸光度与 520nm 处的吸光度比值 （A620/A520） ， 根据检。

15、测得到的吸光度比值即可得到酶活相关值 n， 再根据表达式 C=1.510n即可定量测得溶液中纤维二糖酶的酶活 C， C 的量纲为 U/mL（定 量检测） 。在定量检测中， 所述纤维二糖酶酶活 C 的检测范围优选为 0.15U/mL 150U/mL。 通过上述回归方程和酶活表达式， 得出本发明方法中纤维二糖酶溶液里抑制剂存在时， 该 抑制剂对纤维二糖酶的抑制率。 0012 上述的检测方法中， 所述纳米金探针的粒径优选为 40nm 60nm。 0013 上述的检测方法中， 所述纳米金探针的 Zeta 电位优选为 -30mV -40mV。 0014 上述本发明的纳米金探针主要是基于纳米金颗粒能够在不。

16、破坏生命物质结构和 功能的前提下提供光电检测信号， 纳米金颗粒的粒径大小以及颗粒间的相对距离会影响其 稳定性以及光学性质， 从而提供可供检测的光学信号。本发明的纳米金探针表面修饰的纤 维二糖使纳米金颗粒之间增加了排斥力， 从而使得纳米金颗粒之间的距离稳定而不聚集沉 降， 具有稳定剂的作用 ； 而纳米金探针表面修饰的 6- 巯基己 -1- 醇 （MCH） 则一端通过硫醇 基与纳米金颗粒连接， 另一端的羟基暴露在外。当本发明的纳米金探针检测的纤维二糖酶 溶液中不含抑制剂时， 纤维二糖作为纤维二糖酶的底物被分解， 这时 MCH 暴露在外的羟基 之间的吸引力会促使纳米金颗粒之间距离变近、 聚集沉降， 。

17、从而使得纳米金探针提供相应 的可供检测的光学信号。而当本发明的纳米金探针检测的纤维二糖酶溶液中含有抑制剂 时， 抑制剂会抑制纤维二糖酶的活性， 干扰其与纳米金探针表面的纤维二糖的酶促反应， 这 种情况下纳米金探针表面修饰的纤维二糖能保持体系的稳定， 从而出现与抑制剂不存在时 不同的光学信号， 达到检测目的。 说 明 书 CN 103411928 A 4 3/10 页 5 0015 上述的检测方法中， 优选的， 所述纳米金探针主要由以下方法制备得到 ： 在配好的 纤维二糖溶液中加入氯金酸溶液和硼氢化钠溶液， 充分混匀且反应完全后， 将得到的反应 产物低速离心纯化以去除沉积颗粒， 再于上清液中加入。

18、 6- 巯基己 -1- 醇进行培养， 培养完 成后高速离心纯化， 将高速离心后的沉淀 （含少量水， 即上述的纳米金探针浓缩液） 重溶于 超纯水中， 得到含有可用于检测纤维二糖酶抑制剂的纳米金探针的溶液。 0016 上述的检测方法中， 所述氯金酸、 硼氢化钠、 纤维二糖的摩尔用量比优选为 1 （16.3 18.4） （1.2 6） 。 0017 上述的检测方法中， 所述氯金酸与 6- 巯基己 -1- 醇的摩尔用量比优选为 1 （0.002 0.004） 。 0018 上述原料摩尔用量的确定是通过以下各组反复的优化实验进行确定的。 0019 1. 纤维二糖用量的优化 ： 于 20mL 不同质量浓度。

19、的纤维二糖溶液中加入 0.2mL、 质 量浓度为 1% 的氯金酸溶液， 振荡混匀后再加入 0.2mL、 质量浓度为 1.5% 的硼氢化钠溶液充 分反应 0.5h ； 低速离心纯化去除沉积颗粒后使用激光粒度分析仪检测不同纤维二糖用量 对所制纳米金 - 纤维二糖复合物粒径分布以及 Zeta 电位的影响， 检测结果如下表 1 所示。 0020 表 1 ： 纤维二糖用量对纳米金 - 纤维二糖复合物的影响 0021 编号纤维二糖质量浓度平均粒径 （nm）PDI 指数Zeta 电位 （mV） 10%31.30.512-35.2 20.005%42.80.581-33.5 30.01%33.80.081-3。

20、6.4 40.05%33.60.138-33.3 50.1%40.60.497-31.5 60.2%64.50.488-30.6 70.5%81.40.289-32.2 81%38.60.276-34.1 0022 0023 根据我们反复的实验观察和分析比对， 当反应体系中纤维二糖用量过小时， 纤维 二糖与氯金酸结合位点较少， 在纳米金形成过程中， 起稳定剂作用的纤维二糖过少则容易 造成较大粒径的纳米金 - 纤维二糖复合物形成 ； 而当反应体系中纤维二糖用量过大时， 过 多的纤维二糖吸附于纳米金颗粒上， 阻止了纳米金颗粒形成过程中的进一步增长， 反而形 成了较小粒径的纳米金 - 纤维二糖复合物。

21、。可见， 过多或过少的纤维二糖吸附于纳米金颗 粒表面都可能会对后续制备的纳米金探针的灵敏度造成影响， 所以我们优选粒径适中、 分 散均匀、 体系稳定的纳米金 - 纤维二糖复合物 ； 具体而言， 我们优选选择平均粒径为 30 说 明 书 CN 103411928 A 5 4/10 页 6 40nm、 PDI 数值小于 0.4、 Zeta 电位数值绝对值大于 30mV 的纳米金 - 纤维二糖复合物 ； 并且 通过在下一步的纳米金探针应用实验中得到验证， 采用前述优化标准的纤维二糖量制备的 纳米金探针检测灵敏， 且纤维二糖酶活性的检测幅度及检测下限都达到了预期效果。 据此， 由上表 1 可见， 当纤。

22、维二糖溶液的浓度优选为 0.01% 0.05% 时， 制得的纳米金 - 纤维二糖 复合物的平均粒径适中， 粒径分布指数 PDI、 Zeta 电位数值显示所制复合物颗粒分布均匀， 体系稳定。在此优选的纤维二糖溶液浓度下， 所述氯金酸与纤维二糖的摩尔用量比优选为 1 （1.2 6） 。 0024 2. 硼氢化钠用量的优化 ： 于 20mL、 质量浓度 0.05% 的纤维二糖溶液中加入 0.2mL、 质量浓度 1% 的氯金酸溶液， 振荡混匀后向上述反应体系中加入不同体积的质量浓度为 1.5% 硼氢化钠溶液充分反应 0.5h ； 低速离心纯化去除沉积颗粒后使用激光粒度分析仪检 测不同硼氢化钠添加量对所。

23、制纳米金-纤维二糖复合物粒径分布以及Zeta电位的影响， 检 测结果如下表 2 所示。 0025 表 2 ： 硼氢化钠用量对纳米金 - 纤维二糖复合物的影响 0026 编号硼氢化钠添加量 （mL）平均粒径 (nm)PDI 指数Zeta 电位 （mV） 10.17587.20.771-32.8 20.231.70.123-35.5 30.22530.40.352-36.5 40.2534.20.435-33.2 0027 根据我们反复的实验观察和分析比对， 硼氢化钠作为还原剂， 其添加量决定着制 备的纳米金的质量， 我们优选粒径适中、 分散均匀、 体系稳定的纳米金 - 纤维二糖复合物 ； 即以上。

24、提到的粒径为 30 40nm、 PDI 数值小于 0.4、 Zeta 电位数值绝对值大于 30mV 的纳 米金 - 纤维二糖复合物作为筛选标准 ； 并且通过在后续的纳米金探针应用实验中进行验 证， 采用前述筛选标准下的硼氢化钠量制备的纳米金探针检测灵敏， 纤维二糖酶活性的检 测幅度及检测下限都达到了预期效果。据此， 由上表 2 可见， 质量浓度为 1.5% 的硼氢化钠 溶液优选的添加量为 0.2mL 0.225mL 时， 制备的纳米金 - 纤维二糖复合物的粒径分布指 数 PDI 数值表明体系中颗粒分布均匀， Zeta 电位数值也显示所制体系较稳定， 平均颗粒粒 径适中。在此优选的硼氢化钠溶液添。

25、加量下， 所述氯金酸与硼氢化钠的摩尔用量比优选为 1 （16.3 18.4） 。 0028 3.MCH 添加量的确定 ： 取 10mL 制得的纳米金 - 纤维二糖复合物加入不同体积的 1mmol/L 的 MCH， 于 37下静置反应 2h 后于 12000rpm 离心 5min， 去除上清液并将沉淀重溶 于 5mL 超纯水中 （体积减小为离心前的 1/2） ； 使用激光粒度分析仪检测不同 MCH 添加量对 所制纳米金探针粒径分布以及 Zeta 电位的影响， 检测结果如下表 3 所示。 0029 表 3 ： MCH 用量对纳米金探针的影响 0030 说 明 书 CN 103411928 A 6 。

26、5/10 页 7 编号MCH 添加量 （mL）平均粒径 （nm）PDI 指数Zeta 电位 （mV） 10.0137.10.561-33.4 20.0257.40.289-36.5 30.031730.195-35.2 40.041960.257-33.2 50.053400.257-30.9 0031 根据我们反复的实验观察和分析比对， 6- 巯基己 -1- 醇 （MCH） 在本发明的技术思 路中是起着增加纳米金探针灵敏度的作用， 而过量的 6- 巯基己 -1- 醇 （MCH） 的加入会影响 体系的稳定性， 所以在不影响体系稳定性的前提下， 选取最大程度的 MCH 添加量。与前述相 对应， 。

27、我们优选粒径适中、 分散均匀、 体系稳定的纳米金探针 ； 即粒径小于 100nm、 PDI 数值 小于 0.6、 Zeta 电位数值绝对值大于 30mV 的纳米金探针作为筛选标准 ； 通过在后续纳米金 探针应用实验中进行验证， 采用优选比例的6-巯基己-1-醇添加量制备的纳米金探针检测 灵敏， 纤维二糖酶活性的检测幅度及检测下限都达到了预期效果。据此， 由上表 3 可见， 当 MCH 用量高于 0.02mL 时制备的纳米金探针平均粒径显著上升， 表示 6- 巯基己 -1- 醇 （MCH） 用量过高导致颗粒间聚集， 而 MCH 用量小于 0.02mL 时纳米金探针的平均粒径适中、 且粒径 分布指。

28、数 PDI 数值、 Zeta 电位显示该 6- 巯基己 -1- 醇添加量下制备的纳米金探针较为稳 定、 颗粒分布均匀， 适用于检测体系的要求。在此优选的 6- 巯基己 -1- 醇添加量下， 所述氯 金酸与 6- 巯基己 -1- 醇摩尔用量比优选为 1 （0.002 0.004） 。 0032 上述的制备方法中， 所述加入 6- 巯基己 -1- 醇进行培养时的温度优选控制在 30 37， 培养时间优选为 2h 2.5h。 0033 上述的制备方法中， 所述低速离心时的转速优选为 1200rpm 1500rpm， 所述高速 离心时的转速优选为 12000rpm 15000rpm。 0034 与现有。

29、技术相比， 本发明的优点在于 ： 0035 1. 本发明检测方法中选用的检测纤维二糖酶抑制剂的纳米金探针具有较高的检 测灵敏度， 拓宽了纤维二糖酶抑制剂检测方法的选择范围 ； 0036 2. 本发明检测方法中选用的纳米金探针的制备工艺简单， 不需要使用昂贵复杂的 仪器设备， 制备成本低廉， 且具有对环境无害的特点， 易于推广 ； 0037 3. 本发明的检测方法更加快捷、 灵敏、 精确， 操作方便， 可有效应用于纤维二糖酶 抑制剂的定性和抑制率定量检测， 利于指导菌种产纤维二糖酶条件优化， 以及拓宽该酶在 木质纤维素降解领域的应用范围。 附图说明 0038 图 1 为本发明实施例 1 中纳米金。

30、探针用于检测含 Hg2+的纤维二糖酶溶液和不含 Hg2+的纤维二糖酶溶液的紫外可见吸收光谱比较示意图。 0039 图 2 为本发明实施例 1 中制得的纳米金探针在 Hg2+存在时， 与纤维二糖酶反应后 说 明 书 CN 103411928 A 7 6/10 页 8 的透射电镜图。 0040 图 3 为本发明实施例 2 中纳米金探针用于检测含 Cu2+的纤维二糖酶溶液和不含 Cu2+的纤维二糖酶溶液的紫外可见吸收光谱比较示意图。 0041 图4为本发明实施例1中不同浓度的纤维二糖酶溶液加入纳米金探针溶液后反应 体系的紫外可见吸收光谱图。 0042 图5为本发明实施例1中纤维二糖酶的活性与纳米金探。

31、针表面等离子体共振吸收 峰强度变化的线性关系图。 0043 图 6 为本发明实施例 1 中制备纳米金探针的对比例 1 中未经修饰的纳米金颗粒直 接用于检测纤维二糖酶的紫外可见吸收光谱图。 0044 图 7 为本发明实施例 1 中制备纳米金探针的对比例 2 中只修饰 MCH 的纳米金颗粒 用于检测纤维二糖酶的紫外可见吸收光谱图。 0045 图 8 为本发明实施例 1 中纳米金、 纳米金 - 纤维二糖复合物、 纳米金探针、 以及纳 米金探针 - 纤维二糖酶的紫外可见吸收光谱比较示意图。 0046 图 9 为本发明实施例 1 中的纳米金探针用于检测漆酶的紫外可见吸收光谱图。 0047 图 10 为本。

32、发明实施例 1 中制备纳米金探针的对比例 1 中未经任何修饰的纳米金 颗粒的透射电镜图。 0048 图 11 为本发明实施例 1 中制得的纳米金探针的透射电镜图。 0049 图12为本发明实施例1中制得的纳米金探针与纤维二糖酶反应后的透射电镜图。 具体实施方式 0050 以下结合说明书附图和具体实施例对本发明作进一步描述， 但并不因此而限制本 发明的保护范围。 0051 实施例 1 ： 0052 一种本发明的检测纤维二糖酶抑制剂的方法， 包括以下步骤 ： 0053 取 0.1mL 含 2.5U/mL 纤维二糖酶的磷酸盐缓冲溶液， 添加到 2.0mL 纳米金探针溶 液 （含 0.2mL 纳米金探。

33、针浓缩液） 中混合均匀， 将检测温度控制在 35， 检测 pH 值控制在 4.5， 此检测条件下待纳米金探针反应 10min 后， 用紫外可见分光光度计对反应后的产物体 系进行光谱扫描， 根据检测后溶液体系中纳米金探针表面等离子体共振吸收峰强度变化， 计算得出 620nm 处的吸光度与 520nm 处的吸光度比值 A1为 0.7038 ； 同样， 取 0.1mL 上述含 纤维二糖酶的溶液， 向溶液中加入 HgCl2（模拟纤维二糖酶降解含 Hg2+的木质纤维素） ， 使溶 液中 Hg2+的浓度达到 1mM， 将所得溶液添加到 2.0mL 纳米金探针溶液 （含 0.2mL 纳米金探针 浓缩液） 中。

34、混合均匀， 在温度为 35、 pH 值为 4.5 时反应 10min， 用紫外可见分光光度计对 反应产物进行光谱扫描， 根据检测后纳米金探针表面等离子体共振吸收峰强度变化， 计算 得出 620nm 处的吸光度与 520nm 处的吸光度比值 A2为 0.3914， A2 小于 A1， 即可判断待测溶 液中含有纤维二糖酶抑制剂。 0054 上述 1mM 的 Hg2+对纤维二糖酶产生的抑制效果可通过抑制率来反映， 抑制率是通 过以下方法计算得到 ： 首先， 建立纳米金探针对纤维二糖酶进行定量检测的线性回归方程， Sigma-Aldrich 生产的从黑曲霉提取的纤维二糖酶的酶活为 300U/mL， 用。

35、 20mM 的磷酸盐 缓冲溶液稀释纤维二糖酶， 使其浓度分别为 0.1U/mL、 0.15U/mL、 1.5U/mL、 15U/mL、 30U/mL、 说 明 书 CN 103411928 A 8 7/10 页 9 60U/mL、 150U/mL， 分别将 0.1mL 上述不同浓度的纤维二糖酶溶液加入到 2.0mL 纳米金探针 溶液 （含 0.2mL 纳米金探针浓缩液） 中， 利用紫外可见分光光度计测定出加入不同浓度纤维 二糖酶溶液的各反应体系中纳米金探针表面等离子体共振吸收峰的强度， 如图 4 所示， 纳 米金探针表面等离子体共振吸收峰强度由于加入不同浓度的纤维二糖酶溶液， 发生了不同 程度。

36、的变化。如图 5 所示， 通过测定一系列不同浓度的纤维二糖酶活性， 得出加入纳米金探 针的纤维二糖酶活性与纳米金探针表面等离子体共振吸收峰强度之间呈线性关系的范围 为0.15U/mL150U/mL， 回归方程为y=0.3642x+0.6273， 即A=0.3642n+0.6273 ： A为紫外可 见吸收光谱图中 620nm 处的吸光度与 520nm 处的吸光度比值 （A620/A520） ， 纤维二糖酶活 C=1.510n（U/mL） ， n 即为 x， 相关系数为 0.9688。 0055 将不含Hg2+的纤维二糖酶溶液及加入1mM的Hg2+的纤维二糖酶溶液后计算得到的 A1及 A2值代入上。

37、述得到的回归方程， 则 1mM 的 Hg2+对纤维二糖酶的抑制率 I 为 ： 0056 0057 采用常规方法作为对比来测定 1mM 的 Hg2+对纤维二糖酶抑制效果， 以验证本发明 检测方法的检测效果。取上述 0.1mL， 浓度为 2.5U/mL 的含纤维二糖酶溶液， 用 Barush 法、 比色法以及本发明的纳米金探针法测定两种状态下 （不加及加入 1mM 的 Hg2+） 的纤维二糖酶 活性， 测定结果见下表 4。 0058 表 4 ： 1mM 的 Hg2+对纤维二糖酶抑制的检测结果 0059 0060 上述本实施例中， 当抑制剂存在时， 纤维二糖酶与纳米金探针反应后的紫外可见 吸收光谱图。

38、如图 1 所示， 抑制剂的存在会抑制纤维二糖酶的活性， 干扰纤维二糖酶与纳米 金探针表面纤维二糖的酶促反应， 这种情况下纳米金探针表面修饰的纤维二糖能保持纳米 金探针体系的稳定， 从而出现与抑制剂不存在时不同的光学信号， 达到检测目的， 并可通过 所得不同的紫外可见吸收光谱图计算抑制剂存在时， 对纤维二糖酶的抑制率。 0061 图2是本实施例中纳米金探针在Hg2+存在时， 与纤维二糖酶反应后的透射电镜图。 由于 Hg2+的存在干扰了纤维二糖酶与纳米金探针表面纤维二糖的酶促反应， 这种情况下纳 米金探针表面修饰的纤维二糖能保持其稳定， 从图 2 可以看到颗粒之间的聚集程度远远小 于未加入抑制剂时。

39、， 这也证明了本发明的检测纤维二糖酶抑制剂的方法可以达到预期检测 效果。 0062 本实施例中纳米金探针的制备方法包括以下步骤 ： 0063 1. 纳米金 - 纤维二糖复合物的制备 0064 于 20mL、 质量浓度 0.05% 的纤维二糖溶液中加入 0.2mL、 质量浓度 1% 的氯金酸 说 明 书 CN 103411928 A 9 8/10 页 10 溶液， 将所得溶液于 200rpm、 4下振荡混匀， 保持振荡条件并向前述混匀后的溶液中加入 0.2mL、 质量浓度 1.5% 的硼氢化钠溶液充分反应 0.5h， 溶液立刻由无色变为酒红色， 相同条 件下继续振荡反应 0.5h 后于 1200。

40、rpm 下离心纯化得到的溶液 20min， 去除未结合的沉积颗 粒， 即得到含纳米金 - 纤维二糖复合物的溶液。 0065 2纳米金探针的制备 0066 于每10mL上述含纳米金-纤维二糖复合物的溶液中加入0.02mL、 1mmol/L的MCH， 并于 37静置反应 2h 后于 15000rpm、 4下离心 5min， 去上清液并将离心纯化后的沉淀重 溶于 5mL 超纯水中， 即制备得到可检测纤维二糖酶活性的纳米金探针。 0067 本实施例中氯金酸、 硼氢化钠、 纤维二糖、 MCH 的摩尔比为 1 16.3 6 0.004。 0068 使用激光粒度分析仪检测所制得的纳米金探针粒径为 62.8n。

41、m， 粒径分布指数 PDI 为 0.256， Zeta 电位为 -35.1mV， 这充分证明所制纳米金探针颗粒分布均匀， 且纳米金探针 体系稳定。 0069 对比例 1 ： 使用紫外可见光分光光度计分析检测上述纳米金探针的制备方法中未 经任何修饰的纳米金颗粒 （即直接用本实施例中的氯金酸溶液和硼氢化钠溶液反应得到的 纳米金颗粒） ， 检测结果如图 6 所示， 未经任何修饰的纳米金颗粒溶液加入纤维二糖酶溶液 后， 整体的紫外可见光吸收峰型与纯纳米金颗粒溶液的吸收峰型相比， 没有显著变化 ； 吸光 度整体有所降低， 这是由于纤维二糖酶溶液的加入减小了溶液中纳米金颗粒的浓度所致， 由图 6 可看出，。

42、 未经任何修饰的纳米金颗粒溶液对纤维二糖酶几乎没有响应。 0070 对比例 2 ： 使用紫外可见光分光光度计分析检测只修饰 MCH 的纳米金 （MCH 的添加 量为上述实施例中制备纳米金探针时 MCH 添加量的 1/10， 即采用 0.02mL、 0.1mmol/L 的 MCH 加入 10mL 纳米金颗粒溶液中， 检测结果如图 7 所示， 由图 7 可见， MCH 修饰纳米金颗粒会轻 微地影响纳米金颗粒的稳定性， 因此在600nm左右的波长处， 修饰MCH后的纳米金颗粒的吸 光度比修饰前有所增加 ； 但只修饰 MCH 的纳米金颗粒用于检测纤维二糖酶时， 吸光度只因 为纳米金颗粒浓度的减小而稍微。

43、降低， 这表明 MCH 修饰纳米金颗粒对纤维二糖酶同样几乎 没有响应。 0071 图 8 为纳米金颗粒、 纳米金 - 纤维二糖复合物、 纳米金探针、 以及纳米金探针 - 纤 维二糖酶 （即纳米金探针与纤维二糖酶反应后的体系） 的紫外可见吸收光谱图对比示意图。 由图8可见， 所制纳米金-纤维二糖复合物与未经任何修饰的纳米金颗粒相比， 峰型没有显 著变化， 只在520nm处吸光度有轻微的增加 ； 修饰MCH后的纳米金探针在600nm处的吸光度 有所增加， 这是因为 MCH 的修饰会使得纳米金探针的稳定性有轻微的下降 ； 将本实施例所 制的纳米金探针加入纤维二糖酶后， 620nm 波长处的吸光度显著。

44、上升， 峰型整体红移， 且在 520nm 处纳米金颗粒的特征吸收峰值显著降低， 这充分说明纤维二糖酶的加入引起了纳米 金探针的特异性反应， 产生了聚集沉降， 这充分证明了纳米金探针可对纤维二糖酶响应。 根 据我们理论分析的结果， 在纳米金探针的制备过程中纤维二糖连接在纳米金颗粒上使颗粒 之间增加了空间斥力， 而制备纳米金探针所加入的 MCH 量是经过优化实验得到的， 在该 MCH 添加量下， MCH 的加入所致颗粒间增加的引力、 纳米金颗粒间自身的分子引力与纤维二糖加 入所致颗粒间增加的斥力、 纳米金颗粒间自身的分子斥力形成平衡。当纤维二糖被溶液中 的纤维二糖酶消耗后， 体系颗粒间的平衡被打破。

45、， MCH 暴露于纳米金颗粒外的羟基之间产生 的引力促使纳米金探针进一步聚集沉降产生可被检测的光学信号， 而将该添加量下的 MCH 说 明 书 CN 103411928 A 10 9/10 页 11 直接加于未经任何修饰的纳米金颗粒体系中可能会直接造成纳米金颗粒的沉降， 但并不会 对纤维二糖酶产生任何响应。 0072 图 9 为将检测温度控制在 35， 检测 pH 值控制在 4.5， 此检测条件下待纳米金探 针与漆酶反应10min后的紫外可见吸收光谱图， 由图9可见， 1mg/ml的漆酶溶液加入纳米金 探针体系后只是使得探针的浓度减小， 从而整体降低了纳米金探针的吸光度， 几乎没有任 何响应。。

46、 由此证明了本发明的纳米金探针对木质素降解过程中可能存在的其它木质素降解 酶类不具备响应反应， 本发明纳米金探针对纤维二糖酶有特异性反应。 0073 图 10 和图 11 分别为对比例中未经任何修饰的纳米金颗粒、 本实施例中的纳米金 探针的透射电镜图谱。 由图10、 图11可见， 纳米金探针周围的一圈阴影为连接的纤维二糖， 而 MCH 的修饰对纳米金探针的稳定性造成了轻微的影响， 颗粒分散均匀度稍差于未经任何 修饰的纳米金颗粒。图 12 为纳米金探针与纤维二糖酶反应后的透射电镜图谱， 由图 12 可 知， 与纤维二糖酶反应后的纳米金探针明显可见聚集， 在外观上则由酒红色变为紫蓝色， 这 也进一。

47、步印证了本发明的纳米金探针可对纤维二糖酶发生响应。 0074 实施例 2 ： 0075 一种本发明的检测纤维二糖酶抑制剂的方法， 包括以下步骤 ： 0076 取 0.1mL 含 25U/mL 纤维二糖酶的磷酸盐缓冲溶液， 添加到 2.0mL 纳米金探针溶液 （含 0.2mL 纳米金探针浓缩液， 制备方法同实施例 1） 中混合均匀， 将检测温度控制在 35， 检测 pH 值控制在 4.5， 此检测条件下待纳米金探针反应 10min 后， 再用紫外可见分光光度 计对反应后的产物体系进行光谱扫描， 根据检测后溶液体系中纳米金探针表面等离子体共 振吸收峰强度变化， 计算得出 620nm 处的吸光度与 。

48、520nm 处的吸光度比值 A1为 1.0699 ； 同 样， 取0.1mL上述含纤维二糖酶的溶液， 向溶液中加入CuSO4（模拟纤维二糖酶降解含Cu2+的 木质纤维素） ， 使溶液中 Cu2+的浓度达到 1mM， 将所得溶液添加到 2.0mL 纳米金探针溶液 （含 0.2mL 纳米金探针浓缩液） 中混合均匀， 在温度为 35、 pH 值为 4.5 时反应 10min 后， 用紫 外可见分光光度计对反应产物进行光谱扫描， 根据检测后纳米金探针表面等离子体共振吸 收峰强度变化， 计算得出 620nm 处的吸光度与 520nm 处的吸光度比值 A2为 0.825， A2小于 A1， 即可判断待测溶。

49、液中含有纤维二糖酶抑制剂。 0077 将未加入Cu2+的纤维二糖酶溶液及加入1mM Cu2+的纤维二糖酶溶液后计算得到的 A1及 A2值代入回归方程， 得出 1mM 的 Cu2+对纤维二糖酶的抑制效果， 即抑制率 I。采用常规 方法作为对比来测定 1mM 的 Cu2+对纤维二糖酶抑制效果， 以验证本发明检测方法的检测效 果。 取上述0.1mL， 浓度为10U/mL的含纤维二糖酶溶液， 用Barush法、 比色法以及本发明的 纳米金探针法测定两种状态下 （不加及加入 1mM 的 Cu2+） 的纤维二糖酶活性， 测定结果见下 表 5。 0078 表 5 ： 1mM 的 Cu2+对纤维二糖酶抑制的检测结果 0079 说 明 书 CN 1034119。