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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201380020454.9 (22)申请日 2013.03.08 NCIMB 41946 2012.03.08 NCIMB 41947 2012.03.08 12158714.1 2012.03.09 EP A01H 5/00(2006.01) A01H 5/08(2006.01) A01H 1/00(2006.01) (71)申请人 瑞克斯旺种苗集团公司 地址 荷兰德利尔 (72)发明人 C哈林 (74)专利代理机构 中国国际贸易促进委员会专 利商标事务所 11038 代理人 李程达 (54) 发明名称 具有增加的果实数目的黄瓜 (5。
2、7) 摘要 本发明涉及能够产生增加的果实数目的黄瓜 植物， 其中增加的果实数目由至少两种基因的组 合导致， 所述基因单独地在纯合状态下导致单个 叶表面相较于不具有任一种所述基因的同基因黄 瓜植物减小， 其中所述组合的所述基因的每一种 处于杂合状态， 并且其中所述增加的果实数目是 相较于仅具有一种或不具有所述基因的同基因黄 瓜植物而言的。本发明还涉及这样的黄瓜植物的 种子、 果实和后代以及适合用于产生这样的黄瓜 植物的繁殖材料。还包括在本发明中的是用于增 加受体黄瓜植物的果实数目的产品。 此外， 本发明 涉及这样的黄瓜植物、 种子和繁殖材料在育种程 序中的用途。 (30)优先权数据 (85)PC。
3、T国际申请进入国家阶段日 2014.10.17 (86)PCT国际申请的申请数据 PCT/EP2013/054787 2013.03.08 (87)PCT国际申请的公布数据 WO2013/132084 EN 2013.09.12 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书13页 PCT/RO/134表2页 附图1页 (10)申请公布号 CN 104394685 A (43)申请公布日 2015.03.04 CN 104394685 A 1/1 页 2 1. 能够产生增加的果实数目的黄瓜植物， 其中增加的果实数。
4、目由至少两种基因的组合 导致， 所述基因单独地在纯合状态下导致单个叶表面相较于不具有任一种所述基因的同基 因黄瓜植物减小， 其中所述组合的所述基因的每一种处于杂合状态， 并且其中所述增加的 果实数目是相较于仅具有一种所述基因或不具有所述基因的同基因黄瓜植物而言的。 2. 权利要求 1 的黄瓜植物， 其中至少两种基因在杂合状态下的组合不导致由至少一种 所述基因在纯合状态下的存在所导致的单个叶表面的显著减小。 3. 权利要求 1 或 2 的黄瓜植物， 其中基因的组合是如存在于包含所述基因的黄瓜植物 中的， 所述植物的代表性种子以保藏号 NCIMB41946 保藏于 NCIMB， 其包含纯合状态的两。
5、种 基因 ； 以及以保藏号 NCIMB 41947 保藏于 NCIMB， 其包含杂合状态的两种基因。 4. 权利要求 1 至 3 的任一项的黄瓜植物， 其中至少两种基因在杂合状态下的组合导致 果实数目比包含至少两种在杂合状态下的基因的任一种的植物的果实数目的分别增加的 总和增加得更多。 5. 用于增加受体黄瓜植物的果实数目的产品， 其中所述产品包含至少两种在杂合状态 下的遗传决定子， 所述遗传决定子当分别地以纯合状态存在于黄瓜植物的基因组中时， 导 致单个叶表面相较于不具有任一种所述遗传决定子的同基因黄瓜植物减小， 并且其中所述 产品中包含的遗传决定子的任一个选自 ： 基因、 等位基因、 基因。
6、构建体、 QTL、 启动子、 分离的 基因、 转基因、 DNA 序列。 6. 权利要求 5 的产品， 其中遗传决定子的组合是如存在于包含所述基因决定子的黄瓜 植物中的， 所述植物的代表性种子以保藏号 NCIMB 41946 保藏于 NCIMB， 其包含纯合状态的 两种基因 ； 以及以保藏号 NCIMB 41947 保藏于 NCIMB， 其包含杂合状态的两种基因。 7. 权利要求 1 至 4 的任一项的黄瓜植物的种子， 其中所述植物可从包含权利要求 1 至 4 的任一项中定义的基因的组合的种子生长而来。 8. 权利要求 1 至 4 的任一项的黄瓜植物的后代或权利要求 7 的黄瓜种子的后代， 其包。
7、 含权利要求 1 至 4 的任一项中定义的基因的组合。 9.适合用于产生权利要求1-4或8的任一项的植物或适合用于产生权利要求7的种子 的繁殖材料， 其中所述繁殖材料适合用于有性繁殖， 并且特别地选自小孢子、 花粉、 子房、 胚 珠、 胚囊和卵细胞， 或者适合用于营养繁殖， 并且特别地选自插枝、 根、 茎、 细胞、 原生质体， 或适合用于可再生细胞的组织培养物， 并且特别地选自叶、 花粉、 胚、 子叶、 下胚轴、 分生细 胞、 根、 根尖、 花药、 花、 种子和茎， 其中从所述繁殖材料产生的植物包含权利要求1至4的任 一项中定义的基因的组合。 10.权利要求1-4或8的任一项的植物的黄瓜果实，。
8、 所述果实在其基因组中包含权利要 求 1 至 4 的任一项中定义的基因的组合。 11. 任选地为加工形式的包含权利要求 10 的黄瓜果实的食物产品或其部分， 所述食物 产品在其基因组中包含权利要求 1 至 4 的任一项中定义的基因的组合。 12. 权利要求 1-4 或 8 的任一项的植物或从权利要求 7 的种子产生的植物或从权利要 求 9 的繁殖材料产生的植物在育种程序中作为种质用于产生具有每植物增加的果实数目 的黄瓜植物的用途。 权 利 要 求 书 CN 104394685 A 2 1/13 页 3 具有增加的果实数目的黄瓜 0001 本发明涉及包含导致果实数目增加的遗传信息的黄瓜植物 (C。
9、ucumis sativus)。 本发明还涉及这样的植物的种子和后代并涉及用于获得这样的植物的繁殖材料。此外， 本 发明还涉及包含所述遗传信息的植物、 种子和繁殖材料作为种质用于育种程序的用途。 0002 培育新蔬菜品种是基于开发新性状或改善现有性状的能力的假定。 任何作物的传 统重要的性状为疾病抗性、 贮存期限、 果实品质、 植物活力和产率。 0003 产率增加属于待获得的最复杂的数量性状。在遗传上和环境上存在许多过程 和与植物和果实发育的其它方面的相互作用。例如在黄瓜中， 已进行了几个研究来分析 多种可能或会促进产率的组分。黄瓜中另外的复杂因素被观察为 ： 目前种植的黄瓜的 遗传基础相当狭。
10、窄并且为重组和改良提供有限的空间 (Meglic 等人 ,Genet.Res.Crop Evol.46:533-546,1996)。对于长黄瓜 (long cucumber) 尤其如此。可随意地将它们与其 较短的亲缘物例如slicer、 Beit类型或pickling组合， 但是可从那些亲缘物引入的基因 通常对植物活力或对长黄瓜大小和因此对其高产率具有负面效应。 0004 在温室生长的长黄瓜中可获得非常高的产率， 2008 年在荷兰约为 80kg/m2的平均 值。 由于不同的生长类型和较短的生长期， 也由于作物的遗传潜力， 较短的黄瓜的产率要显 著更低。 在美国， 2008年的黄瓜(主要是sl。
11、icer以及腌食用小黄瓜)平均产率约为1.6kg/ m2。这表明在不同的生长实践和属于同一黄瓜物种的各种类型之间存在潜力的巨大缺口。 0005 尽管产率受环境因素的强烈影响， 但是研究已显示例如雌性节点的数目和 至开花的天数与每个植物的产率负相关 (Lpez-Ses and Staub,J.Amer.Soc.Hort. Sci.127(6):931-937,2002)， 而例如更大的叶片大小和主茎长度则与每个植物的产率 ( 果 实质量 ) 正相关 (Serquen et al,J.Amer.Soc.Hort.Sci.122(4):522-528,1997)。 0006 可在黄瓜生长中用于增加每。
12、平方米产率的一个方法是以更高的密度种植。 然而增 加植物密度将需要每面积更多的植物数目， 这意味着每面积更高的成本。如果植物本身不 产生更高的产率， 那么必须存在补偿那些成本的另一种方式。 此外， 更密集的种植可导致光 强度的减少， 这产生较差的植物和果实发育。每面积更多的植物数目通常还由于微小气候 的变化而导致更高的发病率。已知适合用于更密集种植的植物 ( 例如具有较小叶的植物 ) 具有消极的副作用例如缓慢生长、 较差的果实品质或较低的产率 / 植物。此外， 这还意味着 种植材料的每面积更高的成本。 0007 本发明的目的是提供黄瓜植物 (Cucumis sativus)， 其包含导致每植物。
13、果实数目 增加的基因组合。 0008 在导致本发明的研究过程中， 发现了导致黄瓜植物的果实数目增加的基因组合。 与主流的假设相反， 出人意料地观察到至少两种单独地在纯合状态时导致叶大小减小的基 因的组合， 当在杂合状态下组合时产生更高的每植物果实数目。 0009 本发明从而提供了能够产生增加的果实数目的黄瓜植物， 其中增加的果实数目由 至少两种单独地在纯合状态时导致单个叶表面减小 ( 相较于不具有任一种所述基因的同 基因黄瓜植物 ) 的基因的组合而引起， 其中所述组合的每一种所述基因以杂合状态存在， 并且其中增加的果实数目是相较于仅具有一种或不具有所述基因的同基因黄瓜植物而言 说 明 书 CN。
14、 104394685 A 3 2/13 页 4 的。 0010 至少两种基因在杂合状态下的组合优选不导致如所述基因的至少一种以纯合状 态存在时所引起的单个叶表面的显著减小。 0011 在本发明的一个实施方案中， 导致果实数目增加的基因组合是如存在于包含这样 的基因组合的黄瓜植物中的基因组合 ： 所述植物的代表性种子在保藏号 NCIMB 41946( 包 含在纯合状态下的两种基因的组合 ) 和 NCIMB 41947( 包含在杂合状态下的两种基因的组 合 ) 下保藏于 NCIMB。本发明的基因组合可通过从包含所述基因的黄瓜植物的基因渗入来 获得， 所述植物的代表性种子在保藏号 NCIMB 419。
15、46( 包含在纯合状态下的两种基因的组 合 ) 和 NCIMB 41947( 包含在杂合状态下的两种基因的组合 ) 下保藏于 NCIMB。后者的组合 是本发明的组合。第一保藏的种子的植物是适合用于产生本发明的植物的亲本植物。 0012 已知在黄瓜和其它作物中， 在较大的叶大小和每植物果实产率之间存在正相关。 然而， 在导致本发明的研究过程中， 遵循了不寻常的方法来达到通过较高的果实数目获得 较高的产率的目的。 0013 已知多种基因导致小的黄瓜叶。 通常小叶类型发现于短黄瓜类型例如腌食用小黄 瓜中。另一种具有小叶的黄瓜是野生亚种 hardwickii。小叶是由单隐性基因决定的。这表 明在杂合状。
16、态下隐性等位基因对叶大小没有作用。 0014 当小叶基因被纯合地引入长黄瓜类型时， 叶大小的减小是显著的。 然而， 已知具有 纯合地导致小叶的基因的植物具有较差的果实品质， 通常表现为减小的大小、 不良的种腔 和较差的果实颜色。特别地对于其中高水平的内部和外部果实品质极为重要的长黄瓜， 这 些减小是不可接受的。国内研究也已得出结论 ： 已知的导致小叶的基因的纯合引入导致长 黄瓜类型的产率的显著减小。 0015 然而， 本发明人使用了不同的方法， 其中在杂合状态下组合两种不同的各自已知 在纯合状态下导致小叶的基因。当在长黄瓜背景下引入一种杂合的基因时， 如对于隐性基 因所预期的， 叶大小的减小不。
17、存在或非常低并且不显著。 0016 在长黄瓜背景下， 两种所述基因的纯合地组合相较于当仅一种小叶基因纯合地存 在时导致甚至更小的叶大小。 然而， 仍然如所预期的， 杂合地两种基因不产生有限的叶大小 或不引起叶大小的减小。 0017 然而令人惊讶地， 已发现导致小叶的基因的杂合引入的确具有效应， 尽管对叶大 小具有可忽略不计的作用。 已发现具有杂合的小叶基因的植物的果实数目相对于缺乏该基 因的同基因植物的果实数目显著增加。此外， 存在产率 / 植物或产率 (kg)/m2的平均增加 ( 表 1 和 2)。 0018 进行了继续的研究， 其中将两种而非仅一种导致小叶的基因杂合地组合至黄瓜植 物中。当。
18、组合两种导致相同性状的基因时， 可能的情况是性状被表达为当仅有那些基因的 一种存在时其会被表达的那样， 例如由于它们都在相同的步骤影响相同的途径， 或者因为 已达到了性状的最优值。 另一个选项是基因干扰以至于最终的表达相较于当仅一种基因存 在时的表达减小。叠加效应的获得必然不是理所当然的事。 0019 值得注意的是， 已确定两种杂合小叶基因的组合导致相较于仅包含一种杂合小叶 基因的植物更高的每植物果实数目。 0020 在优选实施方案中， 至少两种基因在杂合状态下的组合导致果实数目比包含杂合 说 明 书 CN 104394685 A 4 3/13 页 5 状态下的所述至少两种基因的任一种的植物的。
19、果实数目的单独增加的总和增加得更多。 因 此两种小叶基因的组合具有协同效应。 0021 在随后的研究过程中， 进一步研究了两种基因的组合的作用。结果显示在某些情 况下， 双杂合植物的更高的果实数目不仅等于两个单独增加的总和， 这本身就是意外的， 而 且可获得杂种优势效应， 从而导致比单独增加更高的增加 ( 表 1 和 2)。对于产率 / 植物或 产率 /m2发现了相同的效应。 0022 表 1 0023 杂合地具有 0、 1 或 2 种小叶基因的黄瓜品种的产率比较 0024 0025 说 明 书 CN 104394685 A 5 4/13 页 6 0026 A ： F1 植物， 无小叶基因 (。
20、AABB) 0027 B ： A 的同基因植物， 1 种杂合的小叶基因 (AaBB) 说 明 书 CN 104394685 A 6 5/13 页 7 0028 C ： F1 植物， 无小叶基因 (AABB) 0029 D ： C 的同基因植物， 1 种杂合的小叶基因 (AABb) 0030 E ： 标准 F1 植物， 无小叶基因 (AABB) 0031 F ： 具有 1 种杂合的小叶基因 (AaBB) 的 F1 植物 0032 G 和 G2 ： 具有 2 种杂合的小叶基因 (AaBb) 的 F1 植物 0033 B 的增加是相较于 A 的， D 的增加是相较于 C 的， F 的增加是相较于 E。
21、 的， G 的增加 是相较于 E 的， G2 的增加是相较于 F 的。对于增加的比较是在相同的试验内进行的。 0034 表 2 ： 每杂合基因的平均增加 0035 0036 除非另有指出， 否则增加是相对于 AABB 的。 0037 在一个实施方案中， 本发明涉及用于增加黄瓜植物的果实数目的方法， 包括组合 至少两种单独地在纯合状态时导致单个叶表面相较于不具有任一种所述基因的同基因黄 瓜植物减小的基因， 其中本发明的所述组合的每一种所述基因以杂合状态存在。当以纯合 状态存在时导致单个叶表面相较于不具有所述基因的同基因黄瓜植物减小的基因在本文 中被称为 “小叶基因 (little leaf ge。
22、ne)” 。 0038 在其它实施方案中， 本发明涉及用于增加果实数目的所述方法， 其中至少两种小 叶基因在杂合状态下的组合导致果实数目的增加比至少两种小叶基因的单独增加的总和 更高。 0039 已知几个基因当其以纯合状态存在时导致叶大小的显著减小， 即这些小叶基因是 隐性的。 为了获得本发明的因那些基因的两种在杂合状态下的组合而具有增加的果实数目 的植物， 组合哪些所述小叶基因是无关的。 根据导致本发明的研究， 任意两种或更多种的纯 合地 ( 单独地或组合地 ) 导致小叶的基因当杂合地组合时将导致果实数目的增加。当杂合 地组合时， 植物将不具有如当一种或多种基因纯合地存在时所发现的小叶。 0。
23、040 在一个实施方案中， 本发明涉及用于增加受体黄瓜植物的果实数目的产品， 其中 所述产品包含至少两种在杂合状态下的遗传决定子， 所述遗传决定子当单独地以纯合状态 存在于黄瓜植物的基因组中时， 导致单个叶表面相较于不具有任一种所述遗传决定子的同 基因黄瓜植物减小。 0041 产品以其最基本形式为包含两种小叶基因的 DNA 序列或两种各自包含一种小叶 基因的DNA序列的组合。 DNA序列可以是基因座、 基因、 等位基因， 也可以是包含两种小叶基 因的载体或甚至可以是包含两种小叶基因的植物。DNA 序列和载体当以分离的形式存在时 说 明 书 CN 104394685 A 7 6/13 页 8 可。
24、用于异源转基因地或同源转基因地增加由受体植物产生的果实数目。当产品是植物时， 这可以通过基因渗入来进行。 在优选实施方案中， 产品包含两种在纯合状态下的小叶基因。 这样的植物的实例是从代表性样品在保藏登录号 NCIMB 41946 下保藏的种子生长而来的 植物。 0042 当纯合地导致小叶的基因被鉴定时， 通过本领域技术人员已知的常规研究来开发 分子标记以跟随该基因在后代中的存在是可能的， 甚至当表型不表达杂合状态时也是可能 的。当组合那些基因的两种或更多种时， 分子标记的使用可鉴定包含至少两种在杂合状态 下的基因的本发明的植物。 0043 两种当以纯合状态存在时导致小叶的基因纯合地存在于保藏。
25、 NCIMB 41946 中。保 藏号 NCIMB 41947 包含两种在杂合状态下的所述基因。在杂合状态下的那些基因的组合的 存在导致每植物果实数目的增加。 在杂合状态下的那些基因的组合的存在优选不导致如由 至少一种所述基因在纯合状态下的存在所引起的小叶。为了基因渗入所述基因， 适当的在 纯合地具有所述基因的植物 ( 其代表性种子被保藏为 NCIMB 41946) 与另一种不具有所述 基因的植物之间进行杂交。所产生的 F1 是包含两种在杂合状态下的小叶基因的本发明的 植物， 所述植物相较于纯合地具有两种基因的亲本和不具有所述基因的亲本， 产生增加的 果实数目。果实数目的增加适当地导致产率即 。
26、kg/m2的增加。 0044 或者， 可在具有两种在杂合状态下的基因的植物 ( 其代表性种子被保藏为 NCIMB 41947)与另一种不具有小叶基因的植物之间进行杂交。 在所产生的F1中， 可适当地通过使 用与所述基因连锁的分子标记来鉴定杂合地具有两种基因的植物。 0045 或者， 可使用来自其它来源的导致小叶的其它基因。导致本发明的组合的可 能的基因可以例如是 “小叶” (ll) 基因 (Goode 等人 ,Ark.Farm Res.29:4,1980)、“致密 (compact)” 基因 (cp)(Kauffman and Lower,J.Amer.Soc.Hort.Sci.101:150。
27、-151,1976)、 “致密 2” 基因 (cp-2)(Kubicki 等人 ,Genetica Polonica 27:289-298,1986)、 野生黄瓜 亲缘物黄瓜变种hardwickii(Cucumis sativus var.hardwickii)的导致小叶的基因、 黄瓜 的膳食用小黄瓜类型的导致小叶的基因或任何其它已知的或仍待鉴定的导致黄瓜的小叶 的非显性基因。 0046 如本文中所用，“小叶” 或 “小的叶” 是具有因一种所述基因的纯合存在而导致的单 个叶表面减小的叶， 所述减小为 ： 以增加的优选的次序， 至少 10、 至少 20、 至少 30、 至 少 40、 至少 50。
28、、 至少 60、 至少 70、 至少 80的减小。 0047 如本文中所用，“基因渗入” 意指通过杂交和在其中性状变得可见的第一代中进行 选择来将基因引入不具有所述基因的植物。优选地， 通过与基因连锁的分子标记的辅助来 进行选择。 可以在包含具有任意数目的期望基因的植物的任何代或群体中进行标记辅助的 选择。 0048 显然提供一种或多种导致本发明的植物的基因的亲本不一定是直接地从保藏的 种子生长而来的植物。 亲本还可以是来自种子的后代植物或来自通过其他方式鉴定为具有 本发明的基因的种子的后代植物。 0049 在一个实施方案中， 可将两种各自具有一种导致小叶的基因的来源进行杂交， 在 所产生的 。
29、F1 或随后的代中可优选地通过使用与所述基因相关的分子标记来鉴定杂合地包 含两种基因的植物。 说 明 书 CN 104394685 A 8 7/13 页 9 0050 根据本发明， 用于增加受体黄瓜植物的果实数目的产品包含至少两种在杂合状态 下的遗传决定子， 所述遗传决定子当单独地以纯合状态存在时导致小叶， 其中任意一种包 含在产品中的遗传决定子选自包含下列的组 ： 基因、 等位基因、 基因构建体、 QTL、 启动子、 分 离的基因、 转基因、 DNA 序列。 0051 本发明还涉及所要求保护的黄瓜植物的细胞。 这样的细胞可以是分离的形式的或 可以是完整黄瓜植物或其部分的部分并且从而仍然构成本。
30、发明的细胞， 因为这样的细胞在 其遗传组成中具有导致定义本发明的黄瓜植物的性状的遗传信息。 本发明的黄瓜植物的每 一个细胞具有导致所述性状的表型表达的遗传信息。 这样的本发明的细胞还可以是可用于 再生新的本发明的黄瓜植物的可再生的细胞。 本发明的细胞具有至少两种在杂合状态下的 小叶基因。 0052 本发明还涉及所要求保护的植物的组织。 组织可以是未分化的组织或已分化的组 织。未分化的组织例如是茎尖、 花药、 花瓣、 花粉并且可用于微体繁殖以获得生长为新的本 发明的植物的新的小植株。组织还可从本发明的细胞生长而来。本发明的组织的细胞具有 至少两种在杂合状态下的小叶基因。 0053 根据其他方面，。
31、 本发明涉及所要求保护的植物的种子。尽管种子不显示本发明的 黄瓜植物的遗传性状， 但是它们具有当植物从所述种子生长时使得该植物称为本发明的植 物的遗传信息。本发明的种子在其基因组中具有至少两种在杂合状态下的小叶基因。 0054 本发明还涉及本发明的植物、 细胞、 组织和种子的后代。 这样的后代其本身可以是 植物、 细胞、 组织或种子。本发明的后代植物具有至少两种在杂合状态下的小叶基因， 并因 此相较于不具有至少两种在杂合状态下的小叶基因的植物具有增加的果实数目。 0055 如本文中所用， 单词 “后代” 意指来自使用本发明的包含导致每植物果实数目增加 的至少两种基因的组合的植物的杂交的第一代和。
32、所有其它代的后代。 本发明的后代是使用 具有至少两种小叶基因的组合的本发明的植物的任何杂交的后代， 所述组合在当所述基因 杂合地存在时导致果实数目的增加。 0056 “后代” 还包括具有导致果实数目增加的小叶基因组合的植物， 其中基因通过营养 繁殖或增殖获自本发明的其它的植物或植物的后代。 0057 因此本发明还涉及所要求保护的植物的种子和涉及适合用于有性繁殖的植物的 部分。这样的部分例如选自小孢子、 花粉、 子房、 胚珠、 胚囊和卵细胞。此外， 本发明涉及适 合用于营养繁殖的植物的部分， 特别是插枝、 根、 茎、 细胞和原生质体。 0058 根据本发明的其它方面， 本发明提供了所要求保护的植。
33、物的组织培养物。组织培 养物包含可再生的细胞。 这样的组织培养物可来源于叶、 花粉、 胚、 子叶、 下胚轴、 分生细胞、 根、 根尖、 花药、 花、 种子和茎。可将组织培养物再生为具有本发明的基因组合的植物。适当 地， 再生的植物表达相较于不具有基因的杂合地组合的同基因植物果实数目增加的表型。 0059 本发明还涉及杂种种子和涉及产生杂种种子的方法， 所述方法包括将第一亲本植 物与第二亲本植物杂交和收获所产生的杂种种子， 其中所述第一亲本植物具有至少一种在 纯合状态下的小叶基因并且第二亲本植物具有一种或多种在纯合状态下的其它小叶基因， 或者第一亲本植物或第二亲本植物具有至少两种小叶基因的纯合地。
34、组合， 而其它亲本植物 不具有那些相同基因。所产生的杂种植物从而是所要求保护的植物。 0060 在一个实施方案中， 本发明涉及具有导致果实数目增加的本发明的基因组合和已 说 明 书 CN 104394685 A 9 8/13 页 10 通过从适当的来源引入 ( 通过常规育种或遗传修饰， 特别地通过同源转基因或异源转基 因 ) 负责性状的遗传信息来获得所述基因的本发明的黄瓜植物。同源转基因是利用来自作 物植物本身或来自两性相容的供体植物的天然基因 ( 编码 ( 农业 ) 性状 ) 的植物的遗传修 饰。异源转基因是利用来自不可杂交的物种的基因或合成基因的植物的遗传修饰。 0061 在一个实施方案中。
35、， 通过从代表性样品在登录号 NCIMB 41946 下保藏的种子， 或 从代表性样品在登录号NCIMB 41947下保藏的种子， 或从保藏的种子NCIMB 41946或NCIMB 41947， 或从其有性或营养后代， 或从包含一种或多种小叶基因 ( 特别地如在保藏物中存在 的基因 ) 的另一种来源， 或从这些来源的组合生长而来的植物形成从其获得本发明的基因 组合的来源。 0062 在优选实施方案中， 本发明涉及非转基因黄瓜植物。用于获取本发明的组合的一 种或多种基因以获得本发明的具有增加的果实数目的植物的来源适当地是具有如包含在 NCIMB 41946 或 NCIMB 41947 中的基因的。
36、黄瓜植物， 或可选择地是具有一种或多种所述基 因并且可与黄瓜杂交的黄瓜属 (Cucumis) 种类的植物。任选地在与相关的种类杂交后， 可 进行技术例如胚胎拯救、 回交或其它本领域技术人员已知的技术来获得种间杂交的种子， 所述种子可用作来源用于进一步地产生非转基因黄瓜植物， 所述黄瓜植物因至少两种单独 地和组合地在纯合状态下导致减小的叶大小的基因的杂合组合而显示增加的果实数目。 0063 本发明还涉及本发明的植物的种质。 种质由生物体的所有遗传性状构成并且根据 本发明包含至少本发明的性状。 种质可用于产生具有增加的果实数目的黄瓜植物的育种程 序。本发明的种质包含至少两种小叶基因。本发明的种质可。
37、包含在杂合状态下的小叶基因 和从而构成能够表达增加的果实数目的性状的种质。可选择地， 种质包含至少两种在纯合 状态下的小叶基因和从而构成可用于本发明的植物的育种或产生具有增加的果实产率的 杂种黄瓜植物的育种的种质。 0064 本发明还涉及由本发明的植物产生的黄瓜果实。本发明还涉及食物产品， 包括所 要求保护的黄瓜植物的果实或其部分。本发明还涉及加工形式的食物产品。本发明的果实 或食物产品包含至少两种当纯合地存在时导致小叶的基因的本发明的新型杂合组合。 0065 在一个方面， 本发明涉及用于产生包含在杂合状态下导致果实数目增加的至少两 种基因的组合的黄瓜植物的方法， 其包括 ： 0066 a) 。
38、将包含导致果实数目增加的两种基因的组合的植物 ( 其代表性种子被保藏为 NCIMB 41946) 与不包含所述基因的植物杂交以获得 F1 群体 ； 0067 b) 任选地进行一轮或多轮自交和 / 或杂交来自 F1 的植物以获得其它代的群体 ； 0068 c) 适当地通过使用与小叶基因连锁的分子标记来选择包含导致果实数目增加的 两种小叶基因的杂合组合的植物。 0069 本发明另外地提供将期望的性状引入黄瓜植物的方法， 所述黄瓜植物因在其基因 组中至少两种小叶基因的组合而能够产生增加的果实数目， 所述方法包括 ： 0070 a) 将包含导致果实数目增加的至少两种小叶基因的组合的黄瓜植物 ( 其代表。
39、性 种子在保藏号 NCIMB 41946 下保藏于 NCIMB) 与包含期望性状的第二黄瓜植物杂交以产生 F1 后代 ； 0071 b) 选择产生增加的果实数目并且具有期望的性状的 F1 后代 ； 0072 c) 将选择的 F1 后代与任一亲本杂交， 以产生回交后代 ； 说 明 书 CN 104394685 A 10 9/13 页 11 0073 d) 选择包含期望的性状和产生增加的果实数目的回交后代 ； 和 0074 e) 任选地接连地重复步骤 c) 和 d) 一次或多次， 以产生经选择的包含期望的性状 和至少两种小叶基因的杂合组合的第四或更高代回交后代， 所述组合导致每植物增加的果 实数目。
40、。本发明包括由该方法产生的黄瓜植物和从其获得的黄瓜果实。 0075 可选择地可在方法的任何杂交或自交步骤之后进行包含本发明的小叶基因组合 的植物的选择。 0076 在一个实施方案中纯合地或杂合地包含小叶基因组合的植物是自交系、 杂种、 双 单倍体的植物或分离群体的植物。 0077 本发明还提供用于产生能够产生增加的果实数目的黄瓜植物的方法， 所述方法通 过使用双单倍体产生技术以产生纯合地包含导致果实数目增加的所述小叶基因组合的双 单倍体系， 所述双单倍体系可与缺乏所述基因的品系杂交以产生杂合地包含小叶基因组合 的本发明的植物。 0078 本发明还涉及杂种种子和涉及用于产生杂种种子的方法， 所述。
41、方法包括将第一亲 本植物与第二亲本植物杂交和收获所产生的杂种种子， 其中所述第一亲本植物和 / 或所述 第二亲本植物是纯合地包含导致本发明的植物的一种或多种小叶基因的植物， 并且所产生 的杂种是所要求保护的植物。 0079 本发明还涉及用于产生能够产生增加的果实数目的黄瓜植物的方法， 所述植物杂 合地包含至少两种基因的组合， 所述基因在纯合状态下导致减小的叶大小， 所述方法使用 在其基因组中包含导致果实数目增加的基因组合的种子来生长所述黄瓜植物。 种子适当地 是其代表性样品在保藏号 NCIMB 41946 和 NCIMB 41947 下保藏于 NCIMB 的种子。 0080 本发明还涉及用于种。
42、子产生的方法， 包括生长杂合地包含至少两种小叶基因的组 合的黄瓜植物， 所述组合导致果实数目的增加， 使所述植物产生种子和收获那些种子。 种子 的产生适当地通过杂交或自交来进行。 0081 在一个实施方案中， 本发明涉及用于通过使用组织培养来产生因至少两种小叶基 因的杂合存在而包含增加的果实数目的黄瓜植物的方法。 本发明还涉及用于通过使用营养 繁殖来产生因至少两种当纯合时导致减小的叶大小的基因的杂合组合而包含增加的果实 数目的黄瓜植物的方法。 0082 在一个实施方案中， 本发明涉及用于通过使用用于遗传修饰以将本发明的基因的 组合(所述组合导致果实数目的增加)引入黄瓜植物的方法来产生包含增加的。
43、果实数目的 黄瓜植物的方法。遗传修饰包含异源转基因修饰或异源转基因 ( 利用来自不可杂交的物种 的基因或合成基因)和同源转基因修饰或同源转基因(利用来自作物植物本身或来自两性 相容的供体植物的编码 ( 农业 ) 性状的天然基因 )。 0083 本发明还涉及用于产生包含至少两种各自当纯合地存在时导致叶大小减小的基 因的杂合组合的黄瓜植物的育种方法， 其中使用包含导致叶大小减小的基因的种质。优选 地， 使用具有至少两种小叶基因的组合的种质。所述包含两种在纯合状态下的小叶基因的 组合的植物的代表性种子在保藏号 NCIMB 41946 下保藏于 NCIMB。 0084 在其他实施方案中， 本发明涉及用。
44、于产生包含至少两种各自当在纯合状态时导致 叶大小减小的基因的杂和组合的黄瓜植物的方法， 其中包含当杂合地存在时赋予果实数目 增加的至少两种小叶基因的组合的植物的后代或繁殖材料被用作来源以将至少两种小叶 说 明 书 CN 104394685 A 11 10/13 页 12 基因基因渗入至另一种黄瓜植物。 所述包含在纯合状态下的所述基因的组合的植物的代表 性种子在保藏号 NCIMB 41946 下保藏于 NCIMB。包含在杂合状态下的所述基因的组合的植 物的代表性种子被保藏为 NCIMB41947。 0085 本发明优选提供因至少两种当以纯合状态存在时导致叶大小减小的基因的杂合 组合而显示果实数目。
45、增加的黄瓜植物， 所述植物可通过本文中描述的任何方法获得。 0086 本发明还涉及用于产生黄瓜果实的方法， 包括生长具有至少两种小叶基因的组合 的黄瓜植物， 所述组合导致如本文中描述的果实数目的增加， 和使其产生黄瓜果实和任选 地收获果实。 0087 可通过使用分子标记来鉴定基因。可选择地可通过在遗传图谱上的位置或通过 在连锁群或染色体上的位置的指征来鉴定基因。当基因不再与特定分子标记连锁， 但其如 在遗传图谱上确定的在染色体上的位置未改变时， 该基因仍然与当其与分子标记连锁时一 样。因此其赋予的遗传性状仍然是相同的。 0088 “遗传性状” 是由基因赋予的性状或特征。在本发明中性状是果实数目。
46、和 / 或果实 产率的增加， 以及基因是至少两种在杂合状态下的小叶基因的组合。可在表型上例如通过 进行生物测定来鉴定遗传性状。然而， 对其无法进行表型测定的植物阶段同样地具有导致 遗传性状的遗传信息。可将 “性状” 或 “表型特征” 替代 “遗传性状” 使用。此外， 在杂合性 状的情况下， 纯合植物也具有当以杂合形式存在时导致果实数目增加的遗传信息。这样的 植物是基因或等位基因的来源并且其本身也是本发明的部分。 0089 在分子标记不存在的情况下或在基因与标记之间已发生重组而标记不再具有预 测性的事件中， 仍可通过等位性试验来确定基因的等同性。 为了进行等位性试验， 将对于已 知的本发明的基因。
47、为纯合的测交植物与对于其基因也是纯合的待测试材料进行杂交。 当待 被观察的性状的分离不存在于杂交的 F2 中时， 则已证明基因是等同或相同的。 0090 当多于一种基因负责某一性状时， 进行等位性试验来确定等同性， 进行试验的本 领域技术人员必须确保所有的相关基因是纯合地存在的以使得试验正确地起作用。 0091 保藏 0092 包含本发明的导致果实数目增加的基因组合的黄瓜 EX 5005 和 10697156 的 种子在保藏登录号 NCIMB 41946 和 NCIMB 41947 下于 2012 年 3 月 8 日保藏于 NCIMB Ltd,Ferguson Building,Craibst。
48、one Estate,Bucksburn,Aberdeen AB219YA,UK。 0093 还将在下文的实施例中进一步举例说明本发明。 0094 附图 0095 图 1 ： 不具有小叶基因的植物、 各自杂合地包含两种不同的小叶基因的一种的同 基因植物和杂合地包含所述小叶基因两者的本发明的同基因植物的比较。 实施例 0096 实施例 1 0097 本发明的黄瓜植物的产生 0098 在黄瓜的两种不同内部育种品系 (KK 5.763 和 KK 5.735) 的植物之间进行杂交。 每一种品系包含不同的在纯合状态下的基因， 在此状态下的所述基因导致叶大小的显著减 小。 因此这些品系的每一种为具有小叶但。
49、具有不同的决定小叶的基因的品系。 KK 5.763可 说 明 书 CN 104394685 A 12 11/13 页 13 由 aaBB 表示， KK 5.735 可由 AAbb 表示。隐性基因的存在导致小叶表型。因此两种亲本都 具有小叶或小型叶。 0099 在 KK 5.763KK 5.735 的 F1 后代 10697156 中， 其中 KK 5.763KK 5.735 可 由 aaBBAAbb 表示， F110697156 可由 AaBb 表示， 获得了具有意外的新性状的植物。将 F110697156 的植物与来自不具有导致小叶的基因的黄瓜品系的对照植物进行比较， 显示在 F1 中获得了 16的果实 /m2的大幅增加。即使本发明的植物的果实稍微地小于不具有小 叶基因的植物的果实， 果实数目的增加仍然导致约 8的产率 (kg/m2) 增加。。