说明书异噁唑β-内酰胺酶抑制剂
相关申请
本申请要求2012年3月30日提交的美国临时申请号61/618,127和2013年3月15日提交的美国临时申请号61/790,248的优先权。这些申请的整个内容以引用的方式整体并入本文。
技术领域
本公开涉及有效作为β-内酰胺酶的抑制剂，且当与β-内酰胺抗生素组合使用时，适用于治疗细菌性感染的β-内酰胺酶抑制剂(BLI)。所述化合物在与β-内酰胺抗生素组合时有效治疗由由于存在β-内酰胺酶而对β-内酰胺抗生素具有抗性的细菌引起的感染。也公开包含所述化合物的药物组合物、使用所述化合物的方法、和用于制备所述化合物的方法。
背景
细菌对β-内酰胺抗生素的抗性(尤其在革兰氏阴性细菌(Gram-negative bacteria)中)最通常是由β-内酰胺酶介导。β-内酰胺酶是催化β-内酰胺环的水解的酶，所述水解使β-内酰胺抗生素的抗细菌活性失活且使细菌变得具有抗性。用BLI抑制β-内酰胺酶会减缓或阻止β-内酰胺抗生素降解且恢复β-内酰胺酶产生性细菌对β-内酰胺抗生素的易感性。这些β-内酰胺酶中的许多不受当前在售的BLI有效抑制，从而致使β-内酰胺抗生素在处理产生这些β-内酰胺酶的细菌方面无效。急需的是抑制不受当前临床BLI(例如KPC、C类和D类β-内酰胺酶)有效抑制的β-内酰胺酶，且可与β-内酰胺抗生素组合用于治疗由β-内酰胺抗性细菌引起的感染的新型BLI。
发明概述
在一个方面，本发明提供作为BLI且适用于与β-内酰胺抗生素组合治疗细菌性感染的化学式(I)化合物或其药学上可接受的盐。
其中
R选自且
R1选自：
a.
其中R2选自
其中R3、R4和R5中的每一个独立地选自氢、(C1-C3)-烷基、氨基烷基、氨基环烷基和羟基烷基，且n选自1、2和3；
b.
其中R6选自
H和
c.
其中R7选自H、(C1-C3)-未被取代的烷基、氨基-(C2-C3)-烷基、氨基环烷基、羟基烷基、
且其中p和q中的每一个独立地选自1和2。
在另一方面，本发明提供作为BLI且适用于与β-内酰胺抗生素组合治疗细菌性感染的化学式(A-I)化合物或其药学上可接受的盐。
其中
R*选自
且
R1*选自：
a.
其中R2*选自
R3*选自氢、(C1-C3)-烷基、氨基烷基、氨基环烷基、羟基烷基，以及
R4*、R5*、R6*和R7*中的每一个独立地选自氢或(C1-C6)-烷基、氨基烷基、氨基环烷基和羟基烷基，前提是R4*、R5*、R6*和R7*的至少一个是氢，
n选自1、2、3和4，且
m选自1、2和3；
b.
其中R8选自-NH(C1-C3)-烷基和其中R4*、R5*、R6*和R7*中的每一个如先前所述；
c.
其中Z选自CR9R10和NR11，
R9和R10中的每一个独立地选自H、NH2、-NH(C1-C3)-烷基和其中R4*、R5*、R6*和R7*中的每一个如先前所述，
或者，R9和R10连同它们所连接的碳一起形成含有4-6个环成员的环烷基或杂环基环，
R11选自H和R12、R13和R14中的每一个独立地选自氢、(C1-C6)-烷基、氨基烷基、氨基环烷基和羟基烷基，前提是R12、R13和R14的至少一个是氢，
R15选自NH2和其中R4*、R5*、R6*和R7*中的每一个如先前所述，
p*和q*中的每一个独立地选自0、1、2和3，
T选自NH和O，
t选自0、1、2、3和4，且
r和y中的每一个独立地选自0和1；
d.
其中R16选自NH2、-NH(C1-C3)-烷基和其中R4*、R5*、R6*和R7*中的每一个如先前所述，
s选自0和1，且
v选自0、1、2和3；
e.
其中R18选自NH2和其中R4*、R5*、R6*和R7*中的每一个如先前所述，
R17选自氨基和羟基，且
w选自0和1；
f.
g.
其中M选自NR19、CR20R21和O，
其中R19是H和其中R12、R13和R14中的每一个如先前所述，
R20和R21中的每一个独立地选自H、NH2和其中R4*、R5*、R6*和R7*中的每一个如先前所述，且
u选自0、1和2；和
h.
在一个实施方案中，本发明提供式I化合物用于抑制β-内酰胺酶的用途。
在一个实施方案中，本发明提供式A-I化合物用于抑制β-内酰胺酶的用途。
在一个实施方案中，本发明提供对β-内酰胺酶具有高结合亲和力的式I化合物。
在一个实施方案中，本发明提供对β-内酰胺酶具有高结合亲和力的式A-I化合物。
在一个实施方案中，本发明也提供包含式I化合物和至少一种β-内酰胺抗生素的抗细菌组合物。
在一个实施方案中，本发明也提供包含式A-I化合物和至少一种β-内酰胺抗生素的抗细菌组合物。
在一个实施方案中，本发明提供包含式I化合物和至少一种β-内酰胺抗生素的药物组合物及其使用方法。
在一个实施方案中，本发明提供包含式A-I化合物和至少一种β-内酰胺抗生素的药物组合物及其使用方法。
在一个实施方案中，本发明提供使用式I化合物治疗受试者的细菌性感染的方法。
在一个实施方案中，本发明提供使用式A-I化合物治疗受试者的细菌性感染的方法。
附图简述
图1A-1D显示表I，代表性式A-II化合物
图2A-2B显示表II，针对一组表达β-内酰胺酶的同基因和临床菌株的标准BLI增强MIC测定。
图3A-3B显示表III，代表性式II-A化合物针对一组表达β-内酰胺酶的同基因和临床菌株的协同MIC。
图4显示表IV，用以确定代表性式II-A化合物对KPC-2β-内酰胺酶的抑制动力学的测定。
图5A-5B显示表V，比较化合物针对一组表达β-内酰胺酶的同基因和临床菌株的协同MIC
详述
定义：
除非另外规定，否则分子术语在用于本申请中时具有它们的通常含义。
除非另外规定，否则术语“烷基”定义为具有1至约20个碳原子的直链或分支饱和基团。优选烷基是具有1至约5个碳原子的“低级烷基”。烷基的实例不加限制地包括甲基、乙基、叔丁基、异丙基和己基。术语烷基的一子组是“(C1-C3)-未被取代的烷基”，其定义为不携带取代基的烷基。(C1-C3)-未被取代的烷基的实例包括甲基、乙基、丙基和异丙基。应了解的是如果(C1-C3)-烷基被“取代”，那么一个或多个氢原子被取代基置换。
术语氨基表示NH2基团。
术语“氨基烷基”表示其中一个或多个烷基氢原子已被氨基置换的烷基。
术语“氨基环烷基”表示其中一个环烷基氢原子已被氨基置换的环烷基。
术语“环烷基”或“环烷基环”定义为呈单一或稠合碳环系统形式的具有3至12个环成员的饱和或部分不饱和碳环。在一优选实施方案中，环烷基是具有3至7个环成员的环系统。环烷基的实例不加限制地包括环丙基、环丁基、环己基和环庚基。
术语“羟基烷基”表示其中一个或多个烷基氢原子已被羟基置换的烷基。
本领域技术人员应了解的是
表示所指示的取代基的连接点。举例来说，
表示酰胺部分的连接点是在羰基碳处。
β-内酰胺酶的功能分类以及术语“A类”、“C类”和“D类”β-内酰胺酶为本领域技术人员所了解且描述于“Updated Functinal Classification ofβ-Lactamases”,Bush,K.；Jacoby,G.A.；Antimicrob.Agents Chem other.2010,54,969-976中，所述文献以引用的方式并入本文。
本发明化合物的盐包括酸加成盐和碱加成盐。在一个实施方案中，盐是式I化合物的药学上可接受的盐。术语“药学上可接受的盐”包括通常用于形成碱金属盐以及形成游离酸或游离碱的加成盐的盐。盐的性质并不关键，前提是它是药学上可接受的。本发明化合物的适合药学上可接受的酸加成盐可自无机酸或有机酸制备。所述无机酸的实例不加限制地包括盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硝酸、碳酸、硫酸和磷酸。适当有机酸的实例可选自脂族、环脂族、芳族、芳基脂族、杂环、羧酸和磺酸类别的有机酸，其实例不加限制地包括甲酸、乙酸、丙酸、丁二酸、乙醇酸、葡萄糖酸、顺丁烯二酸、双羟萘酸(embonic)(帕莫酸(pamoic))、甲烷磺酸、乙烷磺酸、2-羟基乙烷磺酸、泛酸、苯磺酸、甲苯磺酸、磺胺酸、甲磺酸、环己基氨基磺酸、硬脂酸、藻酸、β-羟基丁酸、丙二酸、半乳糖酸和半乳糖醛酸。本发明化合物的适合药学 上可接受的碱加成盐包括但不限于由铝、钙、锂、镁、钾、钠和锌制得的金属盐或由N,N'-二苯甲基乙二胺、氯普鲁卡因(chloroprocaine)、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、N-甲基葡糖胺、赖氨酸和普鲁卡因(procaine)制得的有机盐。所有这些盐都可通过常规手段，通过用适当酸或碱处理例如本发明化合物来自相应本发明化合物制备。
本发明化合物可具有一个或多个不对称碳原子且因此能够以光学异构体形式以及以其外消旋或非外消旋混合物形式存在。本发明化合物可以单一异构体形式或以立体化学异构形式的混合物形式用于本发明中。非对映异构体(即非可重叠立体化学异构体)可通过如色谱、蒸馏、结晶或升华的常规手段加以分离。光学异构体可通过根据常规方法拆分外消旋混合物，例如通过用光学活性酸或碱处理来形成非对映异构盐加以获得。适当酸的实例不加限制地包括酒石酸、二乙酰基酒石酸、二苯甲酰基酒石酸、二甲苯酰基酒石酸和樟脑磺酸。非对映异构体的混合物可通过结晶，随后自光学活性盐释放光学活性碱来分离。用于分离光学异构体的一替代性方法包括使用被最优选择来使对映异构体的分离最大化的手性色谱柱。另一可用方法涉及通过用呈活化形式的光学纯酸或光学纯异氰酸盐处理本发明化合物来合成共价非对映异构分子。合成的非对映异构体可通过常规手段，如色谱、蒸馏、结晶或升华来分离，且接着水解以获得对映异构纯化合物。本发明的光学活性化合物可同样通过利用光学活性起始物质来获得。这些异构体可呈游离酸、游离碱、酯或盐形式。
本文所述的化合物也包括同位素标记的化合物，其中一个或多个原子被具有相同原子序数，但原子质量或质量数不同于通常在自然界中所见的原子质量或质量数的原子置换。适于包括在本文所述的化合物中的同位素的实例包括且不限于2H、3H、11C、13C、14C、36Cl、18F、123I、125I、13N、15N、15O、17O、18O、32P和35S。在一个实施方案中，同位素标记的化合物适用于药物和/或底物组织分布研究中。在另一实施方案中，用如氘的重同位素进行取代会提供更大代谢稳定性(例如体内半衰期增加或剂量需求降低)。在另一实施方案中，用正电子 发射同位素(如11C、18F、15O及13N)进行取代适用于考查底物受体占位性的正电子发射断层成像(PET)研究中。同位素标记的化合物是使用适当同位素标记的试剂替代否则采用的非标记的试剂，通过任何适合方法或通过各种方法制备。
本发明也包括分离的化合物。分离的化合物是指占混合物中存在的化合物的至少10％，如至少20％，如至少50％且进一步如至少80％的化合物。在一个实施方案中，所述化合物、其药学上可接受的盐或包含所述化合物的药物组合物在于如本文所述的测定的常规生物测定中测试时展现可检测(即统计显著)活性。
β-内酰胺酶抑制剂(BLI)
在一个方面，本发明提供式I化合物或其药学上可接受的盐：
式I的取代基R选自
在一优选实施方案中，R是
式I的基团R1选自：
a.
其中R2选自
其中R3、R4和R5中的每一个独立地选自氢、(C1-C3)-烷基、氨基烷基、氨基环烷基和羟基烷基，且n选自1、2和3；
b.
其中R6选自
H和
c.
其中R7选自H、(C1-C3)-未被取代的烷基、氨基-(C2-C3)-烷基、氨基环烷基、羟基烷基、
和
且其中p和q中的每一个独立地选自1和2。
在本发明的一个方面，n是1。在本发明的另一方面，n是2。在本发明的另一方面，n是3。
在一个方面，R1选自
-CH2NH2、-CH2CH2NH2、-CONH(CH2)2NH2、
在本发明的一个实施方案中，R1选自
在本发明的一个实施方案中，本发明化合物具有式II中公开的立体化学。
在本发明的一个实施方案中，化合物具有式II且R是–OSO3H且R1是-CH2NH2。
在本发明的一个实施方案中，化合物具有式II且R是–OSO3H且R1是CH2CH2NH2。
在本发明的一个实施方案中，化合物具有式II且R是–OSO3H且R1是CONH(CH2)2NH2。
在本发明的一个实施方案中，化合物具有式II且R是–OSO3H且 R1是
在本发明的一个实施方案中，化合物具有式II且R是–OSO3H且R1是
在本发明的一个实施方案中，化合物具有式II且R是–OSO3H且R1是
在本发明的一个实施方案中，化合物具有式II且R是–OSO3H且R1是
在本发明的一个实施方案中，化合物具有式II且R是–OSO3H且R1是
优选式I化合物是化合物：
本领域技术人员应了解的是视R1和R的性质而定，式I化合物可以盐或两性离子形式存在。
在一个方面，本发明提供式A-I化合物或其药学上可接受的盐：
式A-I的取代基R*选自
在一优选实施方案中，R*是
基团R1*选自：
a.
其中R2*选自
R3*选自氢、(C1-C3)-烷基、氨基烷基、氨基环烷基、羟基烷基，以及
R4*、R5*、R6*和R7*中的每一个独立地选自氢或(C1-C6)-烷基、氨基烷基、氨基环烷基和羟基烷基，前提是R4*、R5*、R6*和R7*的至少一个是氢，
n选自1、2、3和4，且
m选自1、2和3；
b.
其中R8选自-NH(C1-C3)-烷基和其中R4*、R5*、R6*和R7*中的每一个如先前所述；
c.
其中Z选自CR9R10和NR11，
R9和R10中的每一个独立地选自H、NH2、-NH(C1-C3)-烷基和其中R4*、R5*、R6*和R7*中的每一个如先前所述，
或者，R9和R10连同它们所连接的碳一起形成含有4-6个环成员的环烷基或杂环基环，
R11选自H和R12、R13和R14中的每一个独立地选自氢、(C1-C6)-烷基、氨基烷基、氨基环烷基和羟基烷基，前提是R12、R13和R14的至少一个是氢，
R15选自NH2和其中R4*、R5*、R6*和R7*中的每一个如先前所述，
p*和q*中的每一个独立地选自0、1、2和3，
T选自NH和O，
t选自0、1、2、3和4，且
r和y中的每一个独立地选自0和1；
d.
其中R16选自NH2、-NH(C1-C3)-烷基和其中R4*、R5*、R6*和R7*中的每一个如先前所述，
s选自0和1，且
v选自0、1、2和3；
e.
其中R18选自NH2和其中R4*、R5*、R6*和R7*中的每一个如先前所述，
R17选自氨基和羟基，且
w选自0和1；
f.
g.
其中M选自NR19、CR20R21和O，
其中R19是H和其中R12、R13和R14中的每一个如先前所述，
R20和R21中的每一个独立地选自H、NH2和其中R4*、R5*、R6*和R7*中的每一个如先前所述，且
u选自0、1和2；和
h.
在本发明的一个方面，R1*选自
在本发明的一个实施方案中，R1*选自
在本发明的一个实施方案中，本发明化合物具有式A-II中公开的立体化学。
在本发明的另一实施方案中，R*和R1*选自表I(参见图I)中所列的取代基。优选式A-I化合物是
本领域技术人员应了解的是视R1*和R*的性质而定，式I化合物可以盐或两性离子形式存在。
酶抑制和结合亲和力
本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)有效抑制β-内酰胺酶。在本发明的一个方面，表I的化合物是有效β-内酰胺酶抑制剂。在一个方面，化合物
有效抑制β-内酰胺酶。在一个方面，化合物
有效抑制β-内酰胺酶。
当与β-内酰胺抗生素组合使用时，本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)增强β-内酰胺抗生素针对由于存在一种β-内酰胺酶或多种β-内酰胺酶而通常对β-内酰胺抗生素具有抗性的微生物的活性。
在本发明的一个方面，本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)抑制选自A类、C类或D类β-内酰胺酶的β-内酰胺酶。在本发明的一个方面，式I化合物抑制选自A类、C类或D类β-内酰胺酶的β-内酰胺酶。在本发明的一个方面，式A-I化合物抑制选自A类、C类或D类β-内酰胺酶的β-内酰胺酶。在本发明的一个方面，式II化合物抑制选自A类、C类或D类β-内酰胺酶的β-内酰胺酶。在本发明的一个方面，式A-II化合物抑制选自A类、C类或D类β-内酰胺酶的β-内酰胺酶。在本发明的一个方面，表I的化合物抑制选自A类、C类或D类β-内酰胺酶的β-内酰胺酶。在本发明的一个方面，式
抑制选自A类、C类或D类β-内酰胺酶的β-内酰胺酶。在本发明的一个方面，式
抑制选自A类、C类或D类β-内酰胺酶的β-内酰胺酶。A类β-内酰胺酶例如包括但不限于TEM、SHV、CTX-M、KPC、GES、VEB、SME和GEX。在本发明的一优选方面，本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)抑制KPCβ-内酰胺酶。在本发明的一优选方面，式I化合物抑制KPCβ-内酰胺酶。在本发明的一优选方面，式A-I化合物抑制KPCβ-内酰胺酶。在本发明的一优选方面，式II化合物抑制KPCβ-内酰胺酶。在本发明的一优选方面，式A-II化合物抑制KPCβ-内酰胺酶。更优选地，本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)抑制KPC-2或KPC-3β-内酰胺酶。更优选地，式I化合物抑制KPC-2或KPC-3β-内酰胺酶。更优选地，式A-I化合物抑制KPC-2或KPC-3β-内酰胺酶。更优选地，式II化合物抑制KPC-2或KPC-3β-内酰胺酶。更优选地，式A-II化合物抑制KPC-2或KPC-3β-内酰胺酶。在本发明的一个方面，本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)抑制临床菌株(图2表II)中的KPC-2或KPC-3β-内酰胺酶。在本发明的一个方面，式I化合物抑制临床菌株(图2表II)中的KPC-2或KPC-3β-内酰胺酶。在本发明的一个方面，式A-I化合物抑制临床菌株(图2表II)中的KPC-2或KPC-3β-内酰胺酶。在本发明的一个方面，式II化合物抑制临床菌株(图2表II)中的KPC-2或KPC-3β-内酰胺酶。在本发明的一个方面，式A-II化合物 抑制临床菌株(图2表II)中的KPC-2或KPC-3β-内酰胺酶。C类β-内酰胺酶例如包括但不限于染色体AmpC和质粒基ACC、DHA、CMY、FOX、ACT、MIR、LAT、MOXβ-内酰胺酶。D类β-内酰胺酶例如包括但不限于苯唑西林酶(oxacillinase)或OXAβ-内酰胺酶。在本发明的一优选方面，本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)抑制OXA-15β-内酰胺酶。在本发明的一优选方面，式I化合物抑制OXA-15β-内酰胺酶。在本发明的一优选方面，式A-I化合物抑制OXA-15β-内酰胺酶。在本发明的一优选方面，式II化合物抑制OXA-15β-内酰胺酶。在本发明的一优选方面，式A-II化合物抑制OXA-15β-内酰胺酶。
除非另外指示，否则BLI化合物的活性可通过自协同MIC测定或BLI增强测定(例如如本文所述)获得的MIC值加以描述，所述两种测定均是在β-内酰胺存在下操作。sMIC或MIC值越低，BLI的活性越大，无论BLI化合物的作用机制(例如包括由BLI抑制β-内酰胺酶或任何其它作用机制或作用机制的组合)如何。sMIC和BLI增强测定数据支持本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)通过抑制β-内酰胺酶来增强(即使得更强力)β-内酰胺抗生素针对β-内酰胺酶产生性菌株的活性。
在一个实施方案中，BLI活性是由在协同MIC(sMIC)测定中对β-内酰胺酶产生性细菌菌株的生长抑制来度量。优选地，本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)的sMIC值是8μg/mL或小于8μg/mL。在本发明的一更优选方面，本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)的sMIC值是4μg/mL至8μg/mL。在本发明的一甚至更优选方面，本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)的sMIC值是1至2μg/mL。在本发明的一更优选方面，本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)的sMIC值是0.2至0.5μg/mL。代表性本发明化合物的协同MIC描述于表III(参见图3)中。本领域技术人员应了解的是对β-内酰 胺酶产生性菌株的生长抑制也可通过如同国际专利申请号WO2008/039420中公开的测定的棋盘式协同测定或使用固定浓度的BLI进行的标准BLI增强测定来测量。
在一个实施方案中，BLI活性是由在使用固定浓度的BLI进行的标准BLI增强测定中对β-内酰胺酶产生性细菌菌株的生长抑制来度量。优选地，本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)的MIC值是8μg/mL或小于8μg/mL。在本发明的一更优选方面，本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)的MIC值是4至8μg/mL。在本发明的一甚至更优选方面，本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)的MIC值是1至2μg/mL。在本发明的一更优选方面，本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)的MIC值是0.2μg/mL至0.5μg/mL。
本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)具有跨越广泛多种β-内酰胺酶产生性细菌的广谱活性。惊人地发现本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)在增强β-内酰胺抗生素(具体来说是头孢特咯瓒(Ceftolozane))针对表达D类β-内酰胺酶OXA-15β-内酰胺酶的菌株的活性方面具有活性。当前销售的BLI抑制大多数A类β-内酰胺酶，但不良抑制A类KPCβ-内酰胺酶和C类β-内酰胺酶且在抑制青霉素酶和碳青霉烯酶型D类β-内酰胺酶方面取得不同程度的成功。本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)针对广泛多种表达A类和C类β-内酰胺酶的细菌菌株具有活性，以及惊人的是针对表达D类头孢菌素酶OXA-15的细菌菌株(表II和III)具有活性。针对D类β-内酰胺酶的这个活性增加是关键的，因为针对不同类型的β-内酰胺酶产生性细菌的差异性有效性为有效使用β-内酰胺抗生素来处理抗性细菌菌株所必需(参见下文)。
在一个实施方案中，本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合 物、式II化合物、式A-II化合物)出乎意料地针对表达OXA-15β-内酰胺酶的细菌菌株比结构最类似的化合物阿维巴坦(Avibactam)(比较化合物CCC)具有更大活性。针对表达D类头孢菌素酶OXA-15的细菌菌株比阿维巴坦具有更大活性的化合物是例如化合物603、604、611、614、618。
在一个实施方案中，本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)出乎意料地针对表达KPCβ-内酰胺酶的细菌菌株比结构最类似的化合物阿维巴坦具有更大活性，和/或显示针对表达KPCβ-内酰胺酶的细菌菌株的活性谱比结构最类似的化合物阿维巴坦广泛。针对至少一种表达KPCβ-内酰胺酶的细菌菌株比阿维巴坦具有更大活性，和/或显示针对表达KPCβ-内酰胺酶的细菌菌株的活性谱优于阿维巴坦的化合物是例如化合物601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、620、621、622、623、624、625、626和627。
在本发明的另一方面，本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)对β-内酰胺酶具有高结合亲和力。因此，这些化合物是β-内酰胺酶的较好抑制剂。本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)的抑制动力学是根据实施例37中概述的程序测量。本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)对β-内酰胺酶具有高结合亲和力。
在一个实施方案中，本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)具有结合亲和力1000-5000mM-1s-1。具有结合亲和力1000-5000mM-1s-1的化合物是例如化合物604和608(表IV)。
在一个实施方案中，本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)具有结合亲和力100-999mM-1s-1。 具有结合亲和力100-999mM-1s-1的化合物是例如化合物601、603、605、606、607、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626和627(表IV)。
在一个实施方案中，本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)具有结合亲和力1-99mM-1s-1。具有结合亲和力1-99mM-1s-1的化合物是例如602(表IV)。
惊人地发现本发明化合物对β-内酰胺酶的结合亲和力高于最密切结构比较物阿维巴坦(表IV，参见图4)。
也显示本发明化合物是比如图5中所示的其它比较化合物更好的BLI。
包含本发明化合物的药物组合物及其用途
本发明的另一目标是包含本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)或其盐，优选进一步包含β-内酰胺抗生素的药物组合物或制剂。在本发明的一个实施方案中，药物组合物或制剂包含式I化合物或其盐，优选进一步包含β-内酰胺抗生素。在本发明的一个实施方案中，药物组合物或制剂包含式A-I化合物或其盐，优选进一步包含β-内酰胺抗生素。在本发明的一个实施方案中，药物组合物或制剂包含式II化合物或其盐，优选进一步包含β-内酰胺抗生素。在本发明的一个实施方案中，药物组合物或制剂包含式A-II化合物或其盐，优选进一步包含β-内酰胺抗生素。在本发明的一个实施方案中，药物组合物或制剂包含表I的化合物。在本发明的一个实施方案中，药物组合物或制剂包含式
化合物或其盐，优选进一步包含β-内酰胺抗生素。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物或制剂或其盐包含式
化合物，优选进一步包含β-内酰胺抗生素。
可配制用于经口、静脉内、肌肉内、皮下或胃肠外施用以治疗性或防治性治疗如细菌性感染的疾病的药物组合物。优选地，配制用于静脉内施用的药物组合物。
本文公开的药物制剂可根据标准程序加以制备且在被选择来减轻、防止或消除感染的剂量下施用(关于用于施用供人疗法用的各种抗微生物剂的方法的一般性描述，参见例如Remington's Pharmaceuti cal Sciences,Mack Publishing Company,Easton,PA以及Goodman和Gilman's“The Pharmaceutical Basis of Therapeutics,”Pergamon Press,New York,NY，其内容以引用的方式并入本文)。
药物组合物可包含一种或多种本文公开的化合物(例如一种或多种式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)，优选是式A-I或式A-II化合物，连同β-内酰胺抗生素一起以及一种或多 种无毒药学上可接受的载体和/或稀释剂和/或佐剂和/或赋形剂。如本文所用，短语“药学上可接受的载体”是指可与医药施用相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂等。医药活性物质的所述介质和试剂的使用在本领域中是熟知的。载体和赋形剂的非限制性实例包括玉米淀粉或明胶、乳糖、蔗糖、微晶纤维素、高岭土、甘露糖醇、磷酸二钙、氯化钠和海藻酸。组合物可含有交联羧甲基纤维素钠、微晶纤维素、玉米淀粉、淀粉乙醇酸钠和海藻酸。
可包括的片剂粘合剂是阿拉伯胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮(聚维酮)、羟丙基甲基纤维素、蔗糖、淀粉和乙基纤维素。
可使用的润滑剂包括硬脂酸镁或其它金属硬脂酸盐、硬脂酸、硅氧烷流体、滑石、蜡、油和胶体二氧化硅。
也可使用调味剂，如胡椒薄荷、冬青油、樱桃调味剂等。也可合乎需要的是添加着色剂以使得剂型在外观上更美观或帮助识别产品。
对于经口或胃肠外施用，可将优选是式A-I或式A-II化合物的本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)连同β-内酰胺抗生素一起与常规医药载体和赋形剂混合且以片剂、胶囊、酏剂、混悬液、糖浆、粉片等形式使用。包含本发明化合物的组合物可含有自约0.1重量％至约99重量％的活性化合物，如自约10％至约30％。
对于经口使用，如片剂和胶囊的固体制剂是适用的。也可设计持续释放或肠溶包衣制剂。对于小儿和老人施用，一个实施方案提供混悬液、糖浆和可咀嚼片剂。对于经口施用，药物组合物呈例如片剂、胶囊、混悬液或液体形式。
药物组合物可以含有治疗有效量的活性成分的剂量单位形式制 备。所述剂量单位的实例是片剂和胶囊。出于治疗目的，除活性成分之外，片剂和胶囊也可含有常规载体，如粘合剂，例如阿拉伯胶、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、山梨糖醇或胶黄芪；填充剂，例如磷酸钙、甘氨酸、乳糖、玉米淀粉、山梨糖醇或蔗糖；润滑剂，例如硬脂酸镁、聚乙二醇、二氧化硅或滑石；崩解剂，例如马铃薯淀粉；调味剂或着色剂或可接受的湿润剂。经口液体制剂通常呈水性或油性溶液、混悬液、乳剂、糖浆或酏剂形式，本发明的制剂可含有常规添加剂，如混悬剂、乳化剂、非水性试剂、防腐剂、着色剂和调味剂。用于液体制剂的添加剂的非限制性实例包括阿拉伯胶、杏仁油、乙醇、分馏椰子油、明胶、葡萄糖糖浆、甘油、氢化可食用脂肪、卵磷脂、甲基纤维素、对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、丙二醇、山梨糖醇或山梨酸。
对于静脉内(IV)使用，可将优选是式A-I或式A-II化合物的药物组合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)连同β-内酰胺抗生素一起溶解或混悬于任何通常使用的静脉内流体中且通过输注来施用。静脉内流体不加限制地包括生理食盐水或林格氏溶液(Ringer's solution)。静脉内施用可通过使用(不限于)注射器、小型泵或静脉内管线来达成。
用于胃肠外注射的优选是式A-I或式A-II化合物的本发明的药物组合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)包括药学上可接受的水性或非水性溶液、分散液、混悬液或乳剂以及供仅在使用之前复原至无菌可注射溶液或分散液中的无菌粉末。适合水性和非水性载体、稀释剂、溶剂或媒介物的实例包括水、乙醇、苯甲醇、多元醇(如甘油、丙二醇和聚乙二醇)及其适合混合物、植物油(如玉米油或橄榄油)以及可注射有机酯，如油酸乙酯。适当流动性可例如通过使用包覆材料(如卵磷脂(lecithin))、在分散液的情况下通过维持所需粒度以及通过使用表面活性剂加以维持。组合物可包括各种缓冲剂。
这些组合物也可含有佐剂，如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。它们也可含有标签剂或本领域中熟知的其它防仿剂。防止微生物作用可通过包括各种抗细菌和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、和苯酚、山梨酸)来确保。也可能合乎需要的是包括等张剂，如糖和氯化钠。延长可注射医药形式的吸收可通过包括延迟吸收的试剂，如单硬脂酸铝和明胶来达成。
可注射储库形式可通过在如聚交酯-聚乙醇酸交酯的生物可降解聚合物中形成药物的微囊封基质来制备。视药物与聚合物的比率和所用特定聚合物的性质而定，可控制药物释放的速率。其它生物可降解聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。储库式可注射制剂也可通过将药物包埋在可与身体组织相容的脂质体或微乳剂中来制备。
可注射制剂可例如通过经细菌保留性过滤器过滤，或通过以可仅在使用之前溶解或分散于无菌水或其它无菌可注射介质中的无菌固体组合物形式并入灭菌剂来灭菌。
用于经口施用的固体剂型包括胶囊、片剂、丸剂、粉末和颗粒剂。所述形式可包括在口腔环境中快速溶解或崩解的形式。在所述固体剂型中，可将优选是式A-I或式A-II化合物的活性化合物连同β-内酰胺抗生素一起与至少一种惰性药学上可接受的赋形剂或载体混合。适合赋形剂包括例如(a)填充剂或增量剂，如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和硅酸；(b)粘合剂，如纤维素和纤维素衍生物(如羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素和羧甲基纤维素)、海藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，如甘油；(d)崩解剂，如淀粉乙醇酸钠、交联羧甲基纤维素、琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；(e)溶解阻滞剂，如石蜡；(f)吸收加速剂，如季铵化合物；(g)湿润剂，如十六醇和甘油单硬脂酸酯、脱水山梨醇的脂肪酸酯、泊洛沙姆(poloxamer)和聚乙二醇；(h)吸收剂，如高岭土和膨润土；(i)润滑剂，如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠及其混合物；和(j)助流剂，如滑石和硅氧烷 二氧化物。其它适合赋形剂包括例如柠檬酸钠或磷酸二钙。各剂型也可包含缓冲剂。
可制备具有包衣和外壳，如功能性和美观性肠溶包衣和医药配制领域中熟知的其它包衣的固体剂型，包括片剂、糖衣片、胶囊、丸剂和颗粒剂的固体剂型。它们可任选含有遮光剂和着色剂。它们也可呈能够控制或持续释放的形式。
可用于所述目的的包埋组分的实例包括聚合物质和蜡。药物组合物可使用控制(例如胶囊)或持续释放(例如生物可侵蚀基质)递送系统来递送。用于药物递送的适于施用药物组合物的示例性延迟释放递送系统描述于美国专利号4,452,775(授予Kent)、5,039,660(授予Leonard)和3,854,480(授予Zaffaroni)中。
在一些情况下，为延长药物的作用，可能合乎需要的是在皮下或肌肉内注射之后减缓药物的吸收。这可通过使用水溶性不良的结晶或非晶物质的液体混悬液来达成。非晶物质可单独或必要时连同稳定剂一起使用。药物的吸收速率则取决于它的溶解速率，所述溶解速率又可取决于晶体大小和结晶形式。
或者，可通过将药物溶解或混悬于油媒介物中来达成胃肠外施用的药物形式的延迟吸收。
对于肌肉内制剂，可于如注射用水(WFI)、生理食盐水或5％葡萄糖的医药稀释剂中溶解和施用优选是式A-I或式A-II化合物的化合物连同β-内酰胺抗生素或其适合可溶性盐形式(例如盐酸盐)一起的无菌制剂。可以于水性基质或药学上可接受的油基质(例如长链脂肪酸的酯，如油酸乙酯)中的混悬液形式制备和施用化合物的适合不溶性形式。
优选是式A-I或式A-II化合物的化合物连同β-内酰胺抗生素一起的一定剂量的静脉内、肌肉内或胃肠外化合物制剂可以团块形式或 通过缓慢输注来施用。团块是在小于30分钟内施用的剂量。在一个实施方案中，团块是在小于15或小于10分钟内施用。在另一实施方案中，团块是在小于5分钟内施用。在另一实施方案中，团块是在1分钟或小于1分钟内施用。输液是在30分钟或大于30分钟的速率下施用的剂量。在一个实施方案中，输注是1小时或大于1小时。在另一实施方案中，输注是大致上恒定的。
对于表面使用，也可以适于向皮肤或鼻和咽喉的粘膜施用的形式制备优选是式A-I或式A-II化合物连同β-内酰胺抗生素一起的药物组合物，且可采用霜剂、软膏剂、液体喷雾剂或吸入剂、糖锭或咽喉涂剂形式。所述表面制剂可进一步包括化合物，如二甲亚砜(DMSO)以有助于活性成分穿透表面。
对于向眼或耳的施用，药物组合物可以于疏水性或亲水性基质中配制的呈软膏剂、霜剂、洗剂、涂剂或粉末形式的液体或半液体形式提供。
对于经直肠施用，可以与常规载体混合的栓剂形式施用优选是式A-I或式A-II化合物连同β-内酰胺抗生素一起的药物组合物，所述载体如可可脂、聚乙二醇或栓剂蜡或在室温下是固体，但在体温下是液体，且因此在直肠或阴道腔中熔融且释放活性化合物的其它甘油酯。
或者，药物组合物可呈供在递送时于适当药学上可接受的载体中复原的粉末形式。在另一实施方案中，优选是式A-I或式A-II化合物的化合物连同β-内酰胺抗生素一起的单位剂型可为于无菌气密安瓿或无菌注射器中的一种或多种化合物或其盐于适合稀释剂中的溶液。视所用化合物和它的溶解度以及由医师所需的剂量而定，优选是式A-I或式A-II化合物的化合物连同β-内酰胺抗生素一起在单位剂量中的浓度可变化，例如自约1％至约50％。如果组合物含有多个剂量单位，那么各剂量单位可含有1-500mg活性物质。对于成人治疗，视施用的途径和频率而定，所用剂量可在每天5mg至10g的范围内。
可将本文公开的药物组合物置放在药学上可接受的载体中且根据已知药物递送方法向接受受试者(例如人)递送。一般来说，体内递送药物组合物的方法利用本领域认可的用于递送药剂的方案，其中唯一实质性程序修改是用本发明化合物替代本领域认可的方案中的药物。同样，使用所要求的组合物处理培养物中的细胞例如以消除或降低细胞培养物的细菌性污染水平的方法利用本领域认可的用于用抗细菌剂处理细胞培养物的方案，其中唯一实质性程序修改是用优选与β-内酰胺抗生素组合的本发明化合物替代本领域认可的方案中的药物。
用于递送抗细菌剂的示例性程序描述于授予Rogers的美国专利号6,468,967；6,852,689；和5,041,567中和PCT专利申请号EP94/02552(公布号WO 95/05384)中，所述专利的公开内容以引用的方式整体并入本文。在一个实施方案中，一种或多种优选是式A-I或式A-II化合物的本发明化合物连同β-内酰胺抗生素一起或其药物组合物是经口、经直肠或通过注射(静脉内、肌肉内或皮下)施用。在另一实施方案中，一种或多种优选是式A-I或式A-II化合物的本发明化合物连同β-内酰胺抗生素一起或其药物组合物是经口、经直肠或通过注射(静脉内、肌肉内或皮下)施用以治疗由β-内酰胺抗性细菌引起的感染。在另一实施方案中，一种或多种优选是式A-I或式A-II化合物的本发明化合物连同β-内酰胺抗生素一起或其药物组合物是经口施用以治疗由β-内酰胺酶产生性细菌引起的感染。
如本文所用，短语“治疗有效剂量”和“治疗有效量”是指化合物防止细菌性感染发作，减轻细菌性感染的症状，终止细菌性感染的进展，或产生另一所需生物学结果(例如像临床征象改良或淋巴细胞和/或抗体的水平降低/升高)的量。
术语“治疗(treating/treatment)”定义为向受试者施用治疗有效量的一种或多种化合物以防止感染发生以及控制或消除感染。需要治疗者可包括已患有特定医学疾病的个体以及处于所述疾病的风险下的个 体(即可能最终获得病症的个体)。
如本文所用的术语“受试者”是指哺乳动物、植物、低等动物或细胞培养物。在一个实施方案中，受试者是需要抗细菌治疗的人或其它动物患者。
术语“施用(administering/administration)”等是指向需要治疗的受试者提供本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)。优选地，受试者是哺乳动物，更优选是人。本发明包括连同β-内酰胺抗生素一起施用本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)。当本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)是连同β-内酰胺抗生素一起施用时，所述本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)和所述β-内酰胺抗生素可在相同时间或不同时间施用。当本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)和β-内酰胺抗生素是同时施用时，它们可以单一组合物或药物组合物形式施用或它们可分开施用。应了解的是当本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)是连同β-内酰胺抗生素一起施用时，活性剂可以单一组合形式或以多个组合形式施用。举例来说，当通过静脉内施用时，可将本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)溶解或混悬于任何通常使用的静脉内流体中且通过输注施用，接着可将β-内酰胺抗生素溶解或混悬于任何通常使用的静脉内流体中且通过输注施用。相反，可将β-内酰胺抗生素溶解或混悬于任何通常使用的静脉内流体中且通过输注施用，接着可将式I化合物溶解或混悬于任何通常使用的静脉内流体中且通过输注施用。或者，可将包含本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)和β-内酰胺抗生素的药物组合物溶解或混悬于任何通常使用的静脉内流体中且通过输注施用。
在本发明的一个实施方案中，提供一种治疗或预防细菌性感染的 方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的包含本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)和β-内酰胺抗生素的药物组合物。在本发明的一个实施方案中，提供一种治疗或预防细菌性感染的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的包含式I化合物和β-内酰胺抗生素的药物组合物。在本发明的一个实施方案中，提供一种治疗或预防细菌性感染的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的包含式A-I化合物和β-内酰胺抗生素的药物组合物。在本发明的一个实施方案中，提供一种治疗或预防细菌性感染的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的包含式II化合物和β-内酰胺抗生素的药物组合物。在本发明的一个实施方案中，提供一种治疗或预防细菌性感染的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的包含式A-II化合物和β-内酰胺抗生素的药物组合物。
在本发明的一个实施方案中，提供一种治疗或预防细菌性感染的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的β-内酰胺抗生素以及本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)。在本发明的一个实施方案中，提供一种治疗或预防细菌性感染的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的β-内酰胺抗生素以及式I化合物。在本发明的一个实施方案中，提供一种治疗或预防细菌性感染的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的β-内酰胺抗生素以及式A-I化合物。在本发明的一个实施方案中，提供一种治疗或预防细菌性感染的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的β-内酰胺抗生素以及式II化合物。在本发明的一个实施方案中，提供一种治疗或预防细菌性感染的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的β-内酰胺抗生素以及式A-II化合物。在本发明的一个实施方案中，提供一种治疗或预防细菌性感染的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的β-内酰胺抗生素以及表I的化合物。在本发明的一个实施方案中，提供一种治疗或预防细菌性感染的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的β-内酰 胺抗生素以及式
在本发明的一个实施方案中，提供一种治疗或预防细菌性感染的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的β-内酰胺抗生素以及式
在本发明的一个实施方案中，提供一种治疗或预防受试者的细菌性感染的方法，其包括以下步骤：
a.向所述受试者施用本发明化合物；以及
b.向所述受试者施用治疗有效量的β-内酰胺抗生素。
在一个实施方案中，步骤a中的化合物是式I化合物。在一个实施方案中，步骤a中的化合物是式A-I化合物。在一个实施方案中，步骤a中的化合物是式II化合物。在一个实施方案中，步骤a中的化合物是式A-II化合物。在一个实施方案中，步骤a中的化合物是表I的化合物。在一个实施方案中，步骤a中的化合物是式A-II化合物。
在一个实施方案中，步骤a中的化合物是式
化合物。
在一个实施方案中，步骤a中的化合物是式
化合物。
在一个实施方案中，步骤b中的β-内酰胺抗生素是头孢特咯瓒或头孢他啶(Ceftazidime)。在一个实施方案中，步骤a中的化合物是式
且步骤b中的β-内酰胺抗生素是头孢特咯瓒。在一个实施方案中，步骤a中的化合物是式
且步骤b中的β-内酰胺抗生素是头孢特咯瓒。
在本发明的一个实施方案中，提供一种治疗或预防受试者的细菌性感染的方法，其包括以下步骤：
a.向所述受试者施用治疗有效量的β-内酰胺抗生素；以及
b.向所述受试者施用本发明化合物。
在一个实施方案中，步骤b中的化合物是式I化合物。在一个实施方案中，步骤b中的化合物是式A-I化合物。在一个实施方案中，步骤b中的化合物是式II化合物。在一个实施方案中，步骤b中的化合物是式A-II化合物。在一个实施方案中，步骤b中的化合物是表I的化合物。在一个实施方案中，步骤b中的化合物是式
化合物。
在一个实施方案中，步骤b中的化合物是式
化合物。
在一个实施方案中，步骤a中的β-内酰胺抗生素是头孢特咯瓒或头孢他啶。在一个实施方案中，步骤b中的化合物是式
化合物。
且步骤a中的β-内酰胺抗生素是头孢特咯瓒。在一个实施方案中，步骤b中的化合物是式
化合物，
且步骤a中的β-内酰胺抗生素是头孢特咯瓒。在一个实施方案中，本发明提供一种用于治疗受试者的感染的方法，所述方法是通过施用治疗有效量的一种或多种优选是式A-I或式A-II化合物的本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)以及β-内酰胺抗生素或其组合物来达成。在一个实施方案中，所述方法包括向有需要的受试者施用包含至少一种优选是式A-I或式A-II化合物的本文所述的化合物以及β-内酰胺抗生素的药物组合物。在一个实 施方案中，化合物具有式连同β-内酰胺抗生素，优选是头孢特咯瓒或头孢他啶一起或其组合物。在一个实施方案中，化合物具有式连同β-内酰胺抗生素，优选是头孢特咯瓒或头孢他啶一起或其组合物。在一个实施方案中，药物组合物可包含任一本文所述的化合物作为唯一活性化合物或与另一化合物、组合物或生物物质组合。化合物可经口、胃肠外、通过吸入、表面、经直肠、经鼻、经颊、经阴道、或通过植入的储集囊、外部泵或导管施用。化合物可被制备来供眼部使用或喷雾使用。本发明化合物可以气雾剂形式施用以治疗肺炎或其它基于肺的感染。在一个实施方案中，气雾剂递送载体是无水或干燥粉末吸入器。也可将一种或多种优选是式A-I或式A-II化合物的本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)连同β-内酰胺抗生素一起或其药物组合物直接注射或施用至脓肿、脑室或关节中。胃肠外施用包括皮下、静脉内、肌肉内、关节内、滑膜内、脑池、鞘内、肝内、病变内和颅内注射或输注。在一个实施方案中，一种或多种优选是式A-I或式A-II化合物的本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)连同β-内酰胺抗生素一起是静脉内、皮下或经口施用。在用于向细胞培养物施用一种或多种优选是式A-I或式A-II化合物的本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)以及β-内酰胺抗生素的一个实施方案中，所述一种或多种化合物可被施用在营养培养基中。
在一个实施方案中，一种或多种优选是式A-I或A-II化合物的本 发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)连同β-内酰胺抗生素一起可用于治疗患有其中感染是由任何类型的细菌(如革兰氏阴性细菌)引起或加剧的细菌性感染的受试者。在本发明的一个方面，细菌性感染是由β-内酰胺抗性细菌引起。在一个方面，细菌性感染是由β-内酰胺酶产生性细菌引起。在另一方面，细菌性感染是由A类、C类或D类β-内酰胺酶产生性细菌引起。在另一方面，细菌性感染是由A类β-内酰胺酶产生性细菌引起。在另一方面，感染是由C类β-内酰胺酶产生性细菌引起。在另一方面，感染是由D类β-内酰胺酶产生性细菌引起。在另一方面，感染是由KPCβ-内酰胺酶产生性细菌引起。在另一方面，感染是由OXAβ-内酰胺酶产生性细菌引起。在另一方面，细菌性感染是由产生多种β-内酰胺酶的细菌引起。产生多种β-内酰胺酶的细菌可产生相同类别或不同类别(例如A类和A类、或A类和C类、或A类和D类等)的β-内酰胺酶。
已知会表达β-内酰胺酶的代表性革兰氏阴性病原体包括但不限于不动杆菌属种(Acinetobacter spp.)(包括鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii))、柠檬酸杆菌属种(Citrobacter spp.)、埃希氏菌属种(Escherichia spp.)(包括大肠杆菌(Escherichia coli))、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、摩氏摩根菌(Morganella morganii)、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、克雷伯氏菌属种(包括肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae))、肠杆菌属种(Enterobacter spp.)(包括阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)和产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes))、巴斯德菌属种(Pasteurella spp.)、变形杆菌属种(包括奇异变形杆菌(Proteus mirabilis))、沙雷氏菌属种(Serratia spp.)(包括粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens))和普罗威登菌属种(Providencia spp.)。细菌性感染可由革兰氏阴性细菌引起或加剧，所述革兰氏阴性细菌包括表达可赋予对青霉素、头孢菌素、单环β-内酰胺和/或碳青霉烯的抗性的β-内酰胺酶的菌株。共同施用抑制这些β-内酰胺酶的新型BLI与β-内酰胺抗生素可用于治疗由β-内酰胺抗性细菌引起的感染。
在本发明的一个方面，感染是由选自不动杆菌属种、柠檬酸杆菌属种、大肠杆菌、阴沟肠杆菌、流感嗜血杆菌、绿脓假单胞菌、奇异变形杆菌、粘质沙雷氏菌和肺炎克雷伯氏菌的β-内酰胺酶产生性细菌引起。
可与本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)并行施用的β-内酰胺抗生素包括但不限于头孢菌素、碳青霉烯、单环β-内酰胺、青霉烯和青霉素类抗生素。
在本发明的一个实施方案中，β-内酰胺抗生素是头孢菌素。头孢菌素的实例包括但不限于头孢赛曲(Cefacetrile/cephacetrile)、头孢羟胺苄(Cefadroxil/cefadroxyl)、头孢立新(Cefalexin/cephalexin)、头孢苷氨酸(Cefaloglycin/cephaloglycin)、头孢罗宁(Cefalonium/cephalonium)、头孢噻啶(Cefaloridine/cephaloradine)、头孢噻吩(Cefalotin/cephalothin)、头孢吡硫(Cefapirin/cephapirin)、头孢三嗪(Cefatrizine)、头孢氮氟(Cefazaflur)、头孢西酮(Cefazedone)、头孢唑啉(Cefazolin/cephazolin)、头孢雷定(Cefradine/cephradine)、头孢沙定(Cefroxadine)、头孢替唑(Ceftezole)、头孢克洛(Cefaclor)、头孢羟唑(Cefamandole)、头孢美唑(Cefmetazole)、头孢尼西(Cefonicid)、头孢替坦(Cefotetan)、头孢西丁(Cefoxitin)、头孢罗齐(Cefprozil/cefproxil)、头孢呋辛(Cefuroxime)、头孢唑南(Cefuzonam)、头孢卡品(Cefcapene)、头孢达肟(Cefdaloxime)、头孢地尼(Cefdinir)、头孢托仑(Cefditoren)、头孢他美(Cefetamet)、头孢克肟(Cefixime)、头孢甲肟(Cefmenoxime)、头孢地嗪(Cefodizime)、头孢噻肟(Cefotaxime)、头孢咪唑(Cefpimizole)、头孢泊肟(Cefpodoxime)、头孢特仑(Cefteram)、头孢布坦(Ceftibuten)、头孢噻夫(Ceftiofur)、头孢噻林(Ceftiolene)、头孢唑肟(Ceftizoxime)、头孢曲松(Ceftriaxone)、头孢哌酮(Cefoperazone)、头孢他啶(Ceftazidime)、头孢克定(Cefclidine)、头孢吡肟(Cefepime)、头孢瑞南(Cefluprenam)、头孢噻利(Cefoselis)、头孢唑兰(Cefozopran)、头孢匹罗(Cefpirome)、头孢喹诺(Cefquinome)、头孢氯嗪(Cefaclomezine)、头孢罗兰(Cefaloram)、头孢哌罗(Cefaparole)、头孢卡奈(Cefcanel)、头孢屈洛(Cefedrolor)、头孢吡酮(Ce fempidone)、头孢三唑(Cefetrizole)、头孢维曲(Cefivitril)、头孢马替林(Cefmatilen)、头孢莫匹(Cefmepidium)、头孢维星(Cefovecin)、头孢恶唑(Cefoxazole)、头孢罗替(Cefrotil)、头孢舒米(Cefsumide)、头孢他洛林(Ceftaroline)、头孢噻氧(Ceftioxide)、头孢呋汀(Cefuracetime)、头孢拉宗(cefbuperazone)、头孢米诺(cefminox)、头孢雷特(ceforanide)、头孢替安(cefotiam)、头孢匹胺(cefpiramide)、头孢磺啶(cefsulodin)、头孢吡普(ceftobiprole)、拉他头孢(latamoxef)、氯拉卡比(loracarbef)和头孢特咯瓒。在一个实施方案中，头孢菌素是头孢特咯瓒或头孢他啶。
在本发明的一个实施方案中，β-内酰胺抗生素是碳青霉烯(carbapenem)。碳青霉烯抗生素的实例包括但不限于亚胺培南(Imipenem)、亚胺培南/西司他丁(Cilastatin)、比阿培南(Biapenem)、多利培南(Doripenem)、美罗培南(Meropenem)、厄他培南(Ertapenem)和帕尼培南(Panipenem)。在一个实施方案中，碳青霉烯是亚胺培南/西司他丁或美罗培南。
在本发明的一个实施方案中，β-内酰胺抗生素是单环β-内酰胺(monobactam)。单环β-内酰胺抗生素的实例包括但不限于胺曲南、替吉莫南(Tigemonam)、卡卢莫南(Carumonam)、BAL30072和诺卡霉素(Nocardicin A)。
在本发明的一个实施方案中，β-内酰胺抗生素是青霉烯。在本发明的一个实施方案中，β-内酰胺抗生素是青霉素。青霉素抗生素的实例包括但不限于阿莫西林(Amoxicillin)、氨苄西林(Ampicillin)、阿洛西林(Azlocillin)、美洛西林(Mezlocillin)、阿帕西林(Apalcillin)、海他西林(Hetacillin)、巴氨西林(Becampicillin)、羧苄西林(Carbenicillin)、磺苄西林(Sulbenicillin)、提卡西林(Ticarcillin)、哌拉西林(Piperacillin)、阿洛西林、甲亚胺青霉素(Mecillinam)、匹呋甲亚胺青霉素(Pivmecillinam)、甲氧西林(Methicillin)、环己西林(Ciclacillin)、酞氨西林(Talampicillin)、阿扑西林(Aspoxicillin)、苯唑西林(Oxacillin)、氯唑西林(Cloxacillin)、双氯西林(Dicloxacillin)、氟氯西林(Flucloxacillin)、萘夫西 林(Nafcillin)和匹氨西林(Pivampicillin)。
优选是本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)连同β-内酰胺抗生素一起的药物组合物可用于治疗体内任何器官或组织的由β-内酰胺抗性细菌(优选革兰氏阴性β-内酰胺抗性细菌)引起的细菌性感染。这些器官或组织不加限制地包括骨骼肌、皮肤、血流、肾、心脏、肺和骨。举例来说，可向受试者施用包含至少一种优选是式A-I或式A-II化合物的本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)以及β-内酰胺抗生素的药物组合物以治疗(不限于)皮肤和软组织感染(例如复杂皮肤感染)、菌血症、腹内感染和泌尿道感染(例如cUTI)。此外，本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)可用于治疗社区获得性呼吸道感染，不加限制地包括中耳炎、窦炎、慢性支气管炎和肺炎(包括社区获得性肺炎、医院获得性肺炎和呼吸机相关肺炎)，包括由药物抗性绿脓假单胞菌引起的肺炎。可将至少一种优选是式A-I或式A-II化合物的本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)连同β-内酰胺抗生素一起向受试者施用以治疗包含不同类型的革兰氏阴性细菌或包含格兰氏阳性细菌与革兰氏阴性细菌两者的混合感染。这些类型的感染包括腹内感染和产科/妇科感染。也可将至少一种优选是式A-I或式A-II化合物的本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)连同β-内酰胺抗生素一起向受试者施用以治疗感染，包括(不限于)心内膜炎、肾炎、脓毒性关节炎、腹内败血症、骨和关节感染以及骨髓炎。也可将至少一种优选是式A-I或式A-II化合物的本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)连同β-内酰胺抗生素一起或其药物组合物直接注射或施用至脓肿、脑室或关节中。优选是式A-I或式A-II化合物连同β-内酰胺抗生素一起的本发明的药物组合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)可以气雾剂形式施用以治疗肺炎或其它基于肺的感染。在一个实施方案中，气雾剂递送载体 是无水、液体或干燥粉末吸入器。
一种或多种优选是式A-I或式A-II化合物的本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)连同β-内酰胺抗生素一起的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平可变化以便针对特定患者、组合物和施用模式获得活性化合物达成所需治疗反应的治疗有效量。可如本文所述确定有效量。所选剂量水平将取决于特定化合物的活性、施用途径、所治疗病状的严重性、以及所治疗患者的状况和先前病史。然而，属于本领域的技能的是在水平低于为达成所需治疗作用所需的水平下开始化合物的剂量，且逐渐增加剂量直至达成所需作用。在一个实施方案中，自测定获得的数据可用于配制一定范围的剂量供在人中使用。本领域技术人员应了解的是当组合物包含本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)和β-内酰胺抗生素时，所述本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)与所述β-内酰胺抗生素两者均是活性化合物。
方法包括向受试者施用有效剂量的一种或多种本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)，优选连同β内酰胺抗生素一起。本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)的有效剂量通常在125mg/天至2000mg/天之间。在一个实施方案中，有效剂量是自约0.1至约100mg/kg的一种或多种本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)或其药学上可接受的盐。在一个实施方案中，剂量是自约0.1至约50mg/kg的一种或多种本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)或其药学上可接受的盐。在另一实施方案中，剂量是自约1至约25mg/kg的一种或多种本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)或其药学上可接受的盐。在另一实施方案中，剂量是自约1至约12mg/kg的一种或多种本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)。在另一实施方 案中，剂量是约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12mg/kg的一种或多种本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)。在另一实施方案中，本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)是在每天多达四次每剂100mg至1000mg的剂量下向人施用。在另一实施方案中，本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)是在每天多达四次每剂125mg至750mg的剂量下向人施用。在另一实施方案中，本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)是在1天多达四次每剂250mg至500mg的剂量下向人施用。用于细胞培养物的有效剂量通常在约0.1与约1000μg/mL之间。μ在一个实施方案中，用于细胞培养物的作用剂量在约0.1与约200μg/mL之间。
在一个实施方案中，β-内酰胺抗生素和本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)是以抗生素:本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)的比率1:4至8:1施用。在一个实施方案中，比率是1:4。在另一实施方案中，比率是3:4。在另一实施方案中，比率是5:4。在另一实施方案中，比率是7:4。在另一实施方案中，比率是1:2。在另一实施方案中，比率是3:2。在另一实施方案中，比率是5:2。在另一实施方案中，比率是7:2。在另一实施方案中，比率是1:3。在另一实施方案中，比率是2:3。在另一实施方案中，比率是4:3。在另一实施方案中，比率是5:3。在另一实施方案中，比率是7:3。在另一实施方案中，比率是1:2。在另一实施方案中，比率是3:2。在另一实施方案中，比率是5:2。在另一实施方案中，比率是7:2。在另一实施方案中，比率是1:1。在另一实施方案中，比率是2:1。在另一实施方案中，比率是3:1。在另一实施方案中，比率是4:1。在另一实施方案中，比率是5:1。在另一实施方案中，比率是6:1。在另一实施方案中，比率是7:1。在另一实施方案中，比率是8:1。本领域技术人员应了解的是β-内酰胺抗生素和本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化 合物、式A-II化合物)可在提供的比率的范围内施用，无论药物递送方法如何。本领域技术人员也应了解的是β-内酰胺抗生素和本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)可在提供的比率的范围内一起例如以药物组合物形式施用，或依序施用，即施用β-内酰胺抗生素，随后施用本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)，或反过来也是一样。
一种或多种本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)也可于患者或动物的膳食或饲料中施用。如果作为总膳食摄取的一部分施用，那么所用化合物的量可小于膳食的1重量％，如至多0.5重量％。用于动物的膳食可为化合物可添加至其中的正常食物，或它可添加至预混合物中。
一种或多种优选是式A-I或式A-II化合物的本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)连同β-内酰胺抗生素一起可以每日单次剂量形式或以每天多次剂量形式施用。在一个实施方案中，一种或多种优选是式A-I或式A-II化合物的本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)连同β-内酰胺抗生素一起是以每天单次剂量形式施用。在另一实施方案中，一种或多种优选是式A-I或式A-II化合物的本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)连同β-内酰胺抗生素一起是以每天两次相等剂量形式施用。在另一实施方案中，优选是式A-I或式A-II化合物的本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)连同β-内酰胺抗生素一起是以每天三次相等剂量形式施用。在另一实施方案中，优选是式A-I或式A-II化合物的本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)连同β-内酰胺抗生素一起是以每天四次相等剂量形式施用。治疗方案可需要历经延长时期，例如持续数天或持续两至四周进行施用。每剂施用量或施用总量将取决于如感染的性质和严重性、患者的年龄和总体健康状况、患者对本发明化 合物和β-内酰胺抗生素的耐受性、以及感染中涉及的一种或多种微生物的因素。用于一种类型的感染的治疗方案可大大不同于另一感染的治疗方案。举例来说，一种类型的感染可需要每日一次通过静脉内施用进行施药，而另一感染可需要多次经口给药的治疗方案。
可根据这个方法将一种或多种优选是式A-I或式A-II化合物的本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)连同β-内酰胺抗生素一起施用直至细菌性感染得以根除或减轻。在一个实施方案中，一种或多种优选是式A-I或式A-II化合物的本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)连同β-内酰胺抗生素一起是持续3天至6个月的时期施用。在另一实施方案中，一种或多种优选是式A-I或式A-II化合物的本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)连同β-内酰胺抗生素一起是持续7至56天施用。在另一实施方案中，一种或多种优选是式A-I或式A-II化合物的本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)连同β-内酰胺抗生素一起是持续7至28天施用。在另一实施方案中，一种或多种优选是式A-I或式A-II化合物的本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)连同β-内酰胺抗生素一起是持续7至14天施用。本发明化合物可持续较长或较短时期施用，如果需要这样的话。
本发明的其它实施方案包括：
一种药物组合物，其包含优选是式A-I或式A-II化合物的本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)和至少1种β-内酰胺抗生素或其药学上可接受的盐。
一种药物组合物，其包含优选是式A-I或式A-II化合物的本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)和至少1种头孢菌素抗生素或其药学上可接受的盐。
一种药物组合物，其包含优选是式A-I或式A-II化合物的本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)和头孢特咯瓒或其药学上可接受的盐。
一种药物组合物，其包含优选是式A-I或式A-II化合物的本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)和至少1种碳青霉烯抗生素或其药学上可接受的盐。
一种药物组合物，其包含优选是式A-I或式A-II化合物的本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)和至少1种单环β-内酰胺抗生素或其药学上可接受的盐。
本文所述的实施方案提供作为新型和活性β-内酰胺酶抑制剂的本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)，优选是式A-I或式A-II化合物。本文所述的其它实施方案提供优选是式A-I或式A-II化合物的新型本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)连同β-内酰胺抗生素一起用于治疗感染。本文所述的其它实施方案提供针对β-内酰胺酶显示同类其它化合物不具有的出乎意料活性的新型本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)，优选是式A-I或式A-II化合物。
制备本发明化合物
可通过多种合成途径，包括本文所述的合成流程制备本发明化合物(例如式I化合物、式A-I化合物、式II化合物、式A-II化合物)。这些合成途径可在适当调整反应顺序、反应条件、分离/纯化方法和选择环境友好且有成本效益的溶剂下应用于大规模合成。
除非另外指示，否则以下缩写具有以下含义。以下未定义的缩写具有它们的通常接受的含义。
Bn ＝ 苯甲基
Boc ＝ 叔丁氧基羰基
Boc2O ＝ 二碳酸二叔丁酯
布鲁日(Burgess)试剂 ＝ N-(三乙基铵磺酰基)氨基甲酸甲酯
CDI ＝ 羰基二咪唑
CFU ＝ 菌落形成单位
CLSI ＝ 临床实验室标准协会
cSSSI ＝ 复杂皮肤和皮肤结构感染
DBU ＝ 1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一-7-烯
DCM ＝ 二氯甲烷
DEAD ＝ 偶氮二甲酸二乙酯
DIAD ＝ 偶氮二甲酸二异丙酯
DIPEA ＝ 二异丙基乙胺
DMF ＝ N，N-二甲基甲酰胺
DMAc ＝ N，N-二甲基乙酰胺
DMSO ＝ 二甲亚砜
EDCI ＝ 1-乙基-3-(3′-
二甲基氨基丙基)碳二亚胺
ELSD ＝ 蒸发光散射检测器
EtOAc ＝ 乙酸乙酯
ESI-MS ＝ 电喷雾离子化质谱分析
Fmoc ＝ 芴基甲基氧基羰基
HAP ＝ 医院获得性肺炎
HATU ＝ 六氟磷酸2-(7-氮杂-1H-苯并三唑-1-基)-
1，1，3，3-四甲基脲
HCl ＝ 氯化氢
HOBt ＝ 1-羟基苯并三唑
Hrs ＝ 小时
HPLC ＝ 高效液相色谱
许尼希氏碱
(Hunig’s base) ＝ N，N-二异丙基乙胺
劳森氏试剂 ＝ 2，4-双(4-甲氧基苯基)-1，3，2，4-
(Lawesson’s reagent) 二硫杂二磷杂丁烷-2，4-二硫化物
MIC ＝ 最小抑制浓度
mL ＝ 毫升
MS ＝ 质谱分析
MRSA ＝ 甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
NMR ＝ 核磁共振
Ns ＝ 硝基苯磺酰基
Pa ＝ 绿脓假单胞菌
Prep ＝ 制备型
Ppm ＝ 百万分率
Py ＝ 吡啶
sat. ＝ 饱和
rt ＝ 室温
TBAF ＝ 氟化四丁铵
TBS ＝ 叔丁基二甲基硅烷基
TES ＝ 三乙基硅烷基
TEA ＝ 三乙胺
TEMPO ＝ 2，2，6，6-四甲基-1-哌啶基氧基，
自由基
THF ＝ 四氢呋喃
TFA ＝ 三氟乙酸
TMS ＝ 三甲基硅烷基
TLC ＝ 薄层色谱
VAP ＝ 呼吸机相关肺炎
可使用可易于获得的起始物质、试剂和常规合成程序，包括例如US7112592和WO2009/091856中所述的程序，根据以下反应流程和实施例或其修改形式，自中间体1制备式(I)化合物。可遵循标准异噁唑环形成化学自可自酯中间体1制备的氯肟中间体2d合成化合物3(参见例如Abele，E.；Lukevics，E.Heterocycles 2000，53，2285-2336；Barr，L.；Lincoln，S.F.；Easton，C.J.Chemistry-A European Journal 2006，12，8571-8580；Walker，D.G.；Brodfuehrer，P.R.；Brundidge，S.P.Shih，K.M.；Sapino，C.Jr.J.Org.Chem.1988，53，983-991和其中引用的参考 文献)。
视R1基团的性质而定，可能必要的是保护分子中的某些官能基。保护这些官能基应属于本领域技术人员的专长。参见例如P.G.M.Wuts和T.W.Greene,Protective Groups in Organic Synthesis,第4版,John Wiley and Sons,2006，下文指示为Greene。
流程1
3中的苄型醚保护基可通过标准氢解条件(如但不限于Pd/H2，于MeOH或THF中)或通过酸催化的水解(如但不限于BCl3，于DCM中)移除以提供羟基-脲中间体4，其可不经进一步纯化即直接用于下一步骤中。4的硫酸化可通过在0-80℃的温度下，优选在室温下，用硫酸化试剂(如但不限于SO3.吡啶复合物)在适当溶剂(如吡啶、DMF或DMAc)中处理来达成。化合物5可接着通过常规方法加以分离和纯化。举例来说，5可通过使用适当缓冲系统(即甲酸铵缓冲液)进行标准反相制备型HPLC来纯化。在一些情况下，5可在转化成如硫酸四丁铵盐的适当盐形式之后通过正相硅胶色谱来纯化。四丁铵盐可接着通过阳离子交换转化成钠盐。当保护基存在于侧链中时(即Boc或Fmoc用于保护胺和胍，TBS或TES用于保护醇等)，需要脱保护步 骤来使5转化成它的最终产物6，其可通过使用以上提及的条件进行制备型HPLC来纯化。举例来说，对于N-Boc脱保护，5可在0-30℃的温度下，优选在0℃至室温下用如TFA的酸在如DCM的适当溶剂中处理以得到6。对于O-TBS或O-TES脱保护，可使用氟化物试剂，如HF.吡啶、HF.NEt3或TBAF。对于Fmoc脱保护，可使用胺，如二乙胺、DBU、哌啶等。
实施例
以下特定实施例说明某些化合物的合成。公开的方法可被改适成各种变化形式以产生未另外明确公开的式(I)化合物。此外，本公开包括本文所述的方法的用以产生式(I)化合物的变化形式，所述变化形式将由本领域技术人员基于本公开而了解。
当未指定时，所有温度都应理解成以摄氏度(℃)计。核磁共振(NMR)光谱特征是指用百万分率(ppm)表示的相对于作为参照标准的四甲基硅烷(TMS)的化学位移(γ)。质子NMR光谱数据中针对各种位移报道的相对面积对应于分子中具有特定功能类型的氢原子的数目。关于多重性的位移性质被报道为宽单峰(br s)、宽双重峰(br d)、单峰(s)、多重峰(m)、双重峰(d)、四重峰(q)、双二重峰(dd)、双三重峰(dt)和双四重峰(dq)。用于获取NMR光谱的溶剂是DMSO-d6(全氘二甲亚砜)、D2O(氘化水)、CDCl3(氘化氯仿)和其它常规氘化溶剂。制备型HPLC条件是：Waters SunFire(30x100mm，5μm OBD)柱；流动速率：30-80毫升/分钟，ELSD或质量触发的分级收集；样本装载：视不同粗样本的溶解度和纯度分布而定，不同粗样本的各注射装载量自30-300mg变化；使用甲酸铵缓冲液的溶剂系统：溶剂A：具有20mM甲酸铵的水，溶剂B：含85％乙腈的具有20mM甲酸铵的水。使用NH4HCO3缓冲液的溶剂系统：溶剂A：具有10mM NH4HCO3的水，溶剂B：乙腈。使用NH4OH缓冲液的溶剂系统：溶剂A：具有0.1％NH4OH的水，溶剂B：具有0.1％NH4OH的乙腈。
实施例1：合成(2S,5R)-6-(苯甲基氧基)-7-氧代-1,6-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-2-甲酸乙酯(中间化合物1)
步骤1：合成(S)-5-氧代哌啶-1,2-二甲酸1-叔丁酯2-乙酯
方法A：
在-78℃下逐滴添加n-BuLi(600mL，1.5mol)至TMSCHN2(690mL，1.38mol)于无水THF(3L)中的溶液中，且在-78℃下搅拌混合物30分钟。接着通过导管将混合物转移至(S)-5-氧代吡咯烷-1,2-二甲酸1-叔丁酯2-乙酯(300g，1.17mol)于无水THF(3L)中的溶液中，且在-78℃下搅拌混合物30分钟。反应混合物接着用饱和NH4Cl溶液淬灭，且用DCM(3x)萃取。减压浓缩合并的有机层且粗产物通过硅胶柱色谱(3:1石油醚:EtOAc)加以纯化以提供呈黄色固体状的(S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-6-重氮基-5-氧代己酸乙酯(262g，75％)。
添加(S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-6-重氮基-5-氧代己酸乙酯(350g，1.18mol)于DCM(1500mL)中的溶液至Rh2(OAc)4(3.5g，7.9mmol)于DCM(750mL)中的0℃溶液中。接着将反应混合物在20℃下搅拌过夜且接着减压浓缩。粗样本通过硅胶柱色谱(5:1石油醚/EtOAc)加以纯化以提供呈黄色油状的(S)-5-氧代哌啶-1,2-二甲酸1-叔丁酯2-乙酯(175.9g，55％)。
方法B：
添加t-BuOK(330g，2.9mol)至碘化三甲基氧化锍(750g，3.5mol)于无水DMSO(3L)中的溶液中且在室温下搅拌混合物1小时。添加(S)-5-氧代吡咯烷-1,2-二甲酸1-叔丁酯2-乙酯(900g，3.5mol)且在室温下搅拌混合物2-3小时。添加水以淬灭反应且混合物用EtOAc(5x)萃取。减压浓缩合并的有机层且粗样本通过硅胶柱色谱(1:1石油醚/EtOAc，接着1:10MeOH/DCM)加以纯化以提供呈白色固体状的硫叶立德中间体(977g，80％)。
通过穿过溶液鼓泡氮气10分钟来将硫叶立德中间体(156g，0.446mol)和[Ir(COD)Cl]2(3g，4.46mmol)于甲苯(4L)中的溶液脱气。加热反应混合物至80-90℃，持续2-3小时，且接着冷却至20℃。减压浓缩甲苯，且所得残余物通过硅胶柱色谱(10:1至3:1梯度洗脱石油醚/EtOAc)加以纯化以提供呈黄色油状的(S)-5-氧代哌啶-1,2-二甲酸1-叔丁酯2-乙酯(140g，57.8％)。
步骤2：合成(2S,5S)-5-羟基哌啶-1,2-二甲酸1-叔丁酯2-乙酯
分数份添加NaBH4(36g，1.0mol)至(S)-5-氧代哌啶-1,2-二甲酸1-叔丁酯2-乙酯(250g，0.92mol)于EtOH(1500mL)中的-40℃溶液中。接着在-40℃下搅拌反应混合物0.5小时，然后用10％HOAc溶液淬灭。在用水稀释之后，混合物用DCM(3x)萃取。减压浓缩合并的有机层且通过硅胶柱色谱(1:1石油醚/EtOAc)加以纯化以提供呈黄色油状的(2S,5S)-5-羟基哌啶-1,2-二甲酸1-叔丁酯2-乙酯(205g，80％)。
步骤3：合成(2S,5R)-5-(N-(苯甲基氧基)-2-硝基苯基磺酰氨基)哌 啶-1,2-二甲酸1-叔丁酯2-乙酯
逐滴添加2-硝基苯-1-磺酰氯(500g，2.26mol)于吡啶(1500mL)中的溶液至O-苯甲基羟基胺盐酸盐(400g，2.51mol)于吡啶(1500mL)中的0℃溶液中。使反应混合物升温至室温，接着在20℃下搅拌过夜。减压浓缩混合物，用DCM稀释且用HCl(10％，3x)洗涤。减压浓缩合并的有机层且用DCM重结晶以提供呈黄色固体状的N-(苯甲基氧基)-2-硝基苯磺酰胺(485g，62.6％)。
向N-(苯甲基氧基)-2-硝基苯磺酰胺(212g，0.69mol)于THF(1000mL)中的溶液中添加(2S,5S)-5-羟基哌啶-1,2-二甲酸1-叔丁酯2-乙酯(171g，0.63mol)和PPh3(275g，1.05mol)，随后逐滴添加DEAD(195g，1.12mol)于THF(500mL)中的溶液。接着将混合物在20℃下搅拌过夜。接着减压浓缩反应混合物且通过硅胶柱色谱(3:1石油醚/EtOAc)加以纯化以提供呈黄色油状的(2S,5R)-5-(N-(苯甲基氧基)-2-硝基苯基磺酰氨基)哌啶-1,2-二甲酸1-叔丁酯2-乙酯(283.8g，80％)。
步骤4：合成(2S,5R)-5-((苯甲基氧基)氨基)哌啶-1,2-二甲酸1-叔丁酯2-乙酯
添加LiOH·H2O(95g，2.3mol)和2-巯基乙酸(124g，1.3mol)至(2S,5R)-5-(N-(苯甲基氧基)-2-硝基苯基磺酰氨基)哌啶-1,2-二甲酸1-叔 丁酯2-乙酯(251g，0.45mol)于DMF(1200mL)中的溶液中。接着将反应混合物在20℃下搅拌过夜。反应混合物用水稀释且用EtOAc(3x)萃取。合并的有机层用饱和氯化钠(3x)洗涤，减压浓缩且通过硅胶柱色谱(3:1石油醚/EtOAc)加以纯化以提供呈黄色固体状的(2S,5R)-5-((苯甲基氧基)氨基)哌啶-1,2-二甲酸1-叔丁酯2-乙酯(122.9g，85％)。
步骤5：合成(2S,5R)-5-((苯甲基氧基)氨基)哌啶-2-甲酸乙酯
在20℃下添加TFA(600mL)至(2S,5R)-5-((苯甲基氧基)氨基)哌啶-1,2-二甲酸1-叔丁酯2-乙酯(263g，0.7mol)于DCM(600mL)中的溶液中。将混合物在室温下搅拌过夜且接着减压浓缩。粗产物用粗产物用饱和NaHCO3溶液调整至pH 10，且接着用DCM(3x)萃取。减压浓缩合并的有机层且通过硅胶柱色谱(20:1DCM/MeOH)加以纯化以提供呈黄色油状的(2S,5R)-5-((苯甲基氧基)氨基)哌啶-2-甲酸乙酯(184.9g，95％)。
步骤6：合成(2S,5R)-6-(苯甲基氧基)-7-氧代-1,6-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-2-甲酸乙酯
分数份添加三光气(21.3g，72mmol)至(2S,5R)-5-((苯甲氧基)氨基)哌啶-2-甲酸乙酯(50g，0.18mol)和DIPEA(128mL，0.72mol)于DCM(2000mL)中的0℃溶液中。使反应混合物升温至室温。在室温下搅拌过夜之后，反应混合物用H3PO4(10％)、饱和NaHCO3和饱和NaCl洗涤。合并的有机层在减压下浓缩且通过硅胶柱色谱(3:1 石油醚/EtOAc)加以纯化以提供呈黄色固体状(2S,5R)-6-(苯甲基氧基)-7-氧代-1,6-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-2-甲酸乙酯(27.4g,50％)。1H N MR(400Mz,CDCl3):δ7.43-7.36(m,5H),5.06(d,J＝11.4Hz,1H),4.90(d,J＝11.4Hz,1H),4.24(q,J＝7.1Hz,2H),4.11-4.08(m,1H),3.32-3.31(m,1H),3.08-3.05(m,1H),2.93(d,J＝11.9Hz,1H),2.14-2.05(m,2H),2.05-2.00(m,1H),1.71-1.63(m,1H),1.29(t,J＝7.1Hz,3H)。
实施例2：合成(2S,5R)-6-(苯甲基氧基)-7-氧代-1,6-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-2-甲醛(中间化合物2b)
添加LiBH4(0.54g，24.67mmol)至(2S,5R)-6-(苯甲氧基)-7-氧代-1,6-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-2-甲酸乙酯(5g，16.44mmol)于MeOH(50mL)中的-10℃溶液中。在15分钟之后，添加另一份LiBH4(0.54g，24.67mmol)且在-10至0℃下搅拌混合物4～5小时。在0℃下通过添加饱和NaH2PO4(50mL)小心淬灭反应混合物。混合物用水(20mL)稀释且用DCM(3x)萃取。浓缩合并的有机层且通过硅胶柱色谱(梯度洗脱0-100％EtOAc/石油醚，接着0～2％MeOH/EtOAc)加以纯化以得到呈白色固体状的(2S,5R)-6-(苯甲氧基)-2-(羟基甲基)-1,6-二氮杂双环[3.2.1]辛-7-酮(3.8g，88％)。ESI-MS(EI+,m/z):263.1。1H NMR(500M,CDCl3):7.44-7.35(m,5H),5.05(d,J＝11.5Hz,1H),4.90(d,J＝11.5Hz,1H),3.73-3.69(m,1H),3.61-3.58(m,2H),3.33(m,1H),3.01(br d,J＝12.0Hz,1H),2.91(m,1H),2.03-1.95(m,2H),1.58-1.54(m,1H), 1.39-1.24(m,1H)。
分数份添加TEMPO(48mg，0.3mmol)至(2S,5R)-6-(苯甲氧基)-2-(羟基甲基)-1,6-二氮杂双环[3.2.1]辛-7-酮(7.8g，30mmol)和1,3,5-三氯-1,3,5-三环氮乙烷-2,4,6-三酮(7.0g，30mmol)于DCM(100mL)中的0℃溶液中。在0℃下搅拌混合物2小时，且经过滤。滤液经Na2SO4干燥且浓缩以提供呈黄色油状的(2S,5R)-6-(苯甲氧基)-7-氧代-1,6-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-2-甲醛(7.0g，90％)。ESI-MS (EI+,m/z):261.1。1H NMR(500M,CDCl3):9.74(s,1H),7.45-7.36(m,5H),5.07(d,J＝11.5Hz,1H),4.92(d,J＝11.5Hz,1H),3.89(d,J＝8.0Hz,1H),3.27(m,1H),3.21-3.05(m,1H),2.56(d,J＝12.0Hz,1H),2.20-2.15(m,1H),2.05-2.01(m,1H),1.95-1.93(m,1H),1.49-1.46(m,1H)。
实施例3：合成(E)-6-(苯甲氧基)-7-氧代-1,6-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-2-甲醛肟(中间化合物2c)
在室温下搅拌(2S,5R)-6-(苯甲氧基)-7-氧代-1,6-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-2-甲醛(510mg，1.96mmol)、羟胺盐酸盐(158mg，2.27mmol)和吡啶(621mg，7.85mmol)于EtOH(15mL)中的溶液2小时。接着，浓缩反应混合物且残余物用DCM(25mL)稀释，用水(3x)和饱和氯化钠洗涤，经Na2SO4干燥且浓缩。残余物通过硅胶柱色谱(3:1至3:2石油醚/EtOAC)加以纯化以提供呈白色固体状的(E)-6-(苯甲氧基)-7-氧代-1,6-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-2-甲醛肟(228mg，42％)。ESI-MS(EI+,m/z):276[M+H]+。
实施例4：合成硫酸氢(2S,5R)-2-(5-(氨基甲基)异噁唑-3-基)-7-氧代-1,6-二氮杂双环[3.2.1]辛-6-基酯(化合物601)
步骤1：在室温下添加NCS(295mg，2.2mmol)至6-(苯甲氧基)-7-氧代-1,6-二氮杂-双环[3.2.1]辛烷-2-甲醛肟(560mg，2.0mmol)于无水DCM(15mL)中的溶液中。接着添加吡啶(一滴)，且在室温下搅拌反应混合物18小时。蒸发溶液以提供(2S,5R)-6-(苯甲氧基)-N-羟基-7-氧代-1,6-二氮杂-双环[3.2.1]辛烷-2-甲亚氨酰氯，其直接用于下一步骤中。ESI-MS(EI+,m/z):274[M-Cl]+。
步骤2：添加丙-2-炔-1-基氨基甲酸叔丁酯(0.37g，2.4mmol)至(2S,5R)-6-(苯甲氧基)-N-羟基-7-氧代-1,6-二氮杂-双环[3.2.1]辛烷-2-甲亚氨酰氯(约2.0mmol)于无水DCM(20mL)中的溶液中，随后历经30分钟的时期添加含TEA(0.31mL，2.2mmol)的无水DCM(2.0mL)。将反应混合物在室温下搅拌隔夜，接着混合物用EtOAc稀释，用水和饱和氯化钠洗涤。有机层经Na2SO4干燥，浓缩且通过硅胶柱色谱(1:2石油醚/EtOAc)加以纯化以提供呈白色固体状的((3-((2S,5R)-6-(苯甲氧基)-7-氧代-1,6-二氮杂双环[3.2.1]辛-2-基)异噁唑-5-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯(180mg，21％(对于两步而言))。ESI-MS(EI+,m/z):429.1[M+H]+。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ7.45-7.35(m,5H),6.24(s,1H), 5.09(d,J＝11.5Hz,1H),4.93(d,J＝11.5Hz,1H),4.58(d,J＝7.5Hz,1H),4.43(m,2H),3.32(s,1H),2.86-2.84(m,1H),2.68(d,J＝11.5Hz,1H),2.34-2.30(m,1H),2.23-2.18(m,1H),2.10-2.04(m,1H),1.82-1.78(m,1H),1.45(s,9H)。
步骤3：向(3-((2S,5R)-6-(苯甲氧基)-7-氧代-1,6-二氮杂-双环[3.2.1]辛-2-基)异噁唑-5-基)甲基氨基甲酸叔丁酯(210mg，0.5mmol)于THF(5mL)中的溶液中添加10％Pd/C(100mg)。接着过滤反应混合物且浓缩以提供呈淡黄色固体状的((3-((2S,5R)-6-羟基-7-氧代-1,6-二氮杂双环[3.2.1]辛-2-基)异噁唑-5-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯(180mg，99％)，其直接用于下一步骤中。ESI-MS(EI+,m/z):339.1[M+H]+。
步骤4：向(3-((2S,5R)-6-羟基-7-氧代-1,6-二氮杂-双环[3.2.1]辛-2-基)异噁唑-5-基)甲基氨基甲酸叔丁酯(180mg，0.5mmol)于无水吡啶(2.5mL)中的溶液中添加SO3·Py(480mg，3.0mmol)。在室温下搅拌混合物3小时且接着减压浓缩。将残余物再溶解于NaH2PO4水溶液(1.5M，20mL)中，接着添加硫酸氢四丁铵(230mg，0.67mmol)。在室温下搅拌混合物20分钟，接着用EtOAc(4x)萃取。干燥并浓缩合并的有机层且残余物通过硅胶柱色谱(梯度洗脱10:1至3:1DCM/丙酮)加以纯化以提供呈白色固体状的(2S,5R)-2-(5-(((叔丁氧基羰基)氨基)甲基)异噁唑-3-基)-7-氧代-1,6-二氮杂双环[3.2.1]辛-6-基硫酸四丁铵(180mg，54％)。ESI-MS(EI-,m/z):417.0[M-H]-。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ6.28(s,1H),4.97(bs,1H),4.54(d,J＝7Hz,1H),4.44-4.30(m,2H),4.35(m,1H),3.35-3.28(m,8H),3.19-3.17(m,1H),2.76(d,J＝11.5Hz,1H),2.36-2.32(m,1H),2.27-2.24(m,1H),2.18-2.12(m,1H),1.87-1.81(m,1H),1.71-1.65(m,8H),1.50-1.47(m,17H),1.01(t,J＝7.0Hz,12H)。
步骤5，树脂交换：将(2S,5R)-2-(5-(叔丁氧基羰基氨基甲基)-异噁唑-3-基)-7-氧代-1,6-二氮杂-双环[3.2.1]辛-6-基硫酸四丁铵(180mg，0.27mmol)溶解于最小量的HPLC级水(约10mL)中且穿过20g道威 克斯50WX 8Na+树脂(所述树脂用>0.5L HPLC级水预洗涤)的管柱并用HPLC级水洗脱以提供在冻干之后以白色固体形式获得的(2S,5R)-2-(5-(((叔丁氧基羰基)氨基)甲基)异噁唑-3-基)-7-氧代-1,6-二氮杂双环[3.2.1]辛-6-基硫酸钠(109mg，92％)。ESI-MS(EI-,m/z):417.0[M-H]-。1H NMR(500MHz,D2O):δ6.32(s,1H),4.61(d,J＝6.5Hz,1H),4.32(s,2H),4.13(m,1H),3.10-3.08(m,1H),2.91(d,J＝12.5Hz,1H),2.21-2.17(m,1H),2.09-2.02(m,2H),1.86-1.82(m,1H),1.34(s,9H)。
步骤6：添加TFA(0.40mL)至(2S,5R)-2-(5-(叔丁氧基羰基氨基甲基)-异噁唑-3-基)-7-氧代-1,6-二氮杂-双环[3.2.1]辛-6-基硫酸钠(54mg，0.12mmol)于无水DCM(1.2mL)中的0℃溶液中。在0℃下搅拌反应混合物30分钟至1小时且接着用乙醚稀释。通过离心收集沉淀，用乙醚(3x)洗涤且进一步在高真空下干燥以提供呈TFA盐形式的硫酸氢(2S,5R)-2-(5-(氨基甲基)异噁唑-3-基)-7-氧代-1,6-二氮杂双环[3.2.1]辛-6-基酯(约30mg)。ESI-MS(EI+,m/z):319.2。TFA盐(约30mg)进一步通过使用甲酸铵缓冲液进行制备型HPLC加以纯化以提供呈白色固体状的硫酸氢(2S,5R)-2-(5-(氨基甲基)异噁唑-3-基)-7-氧代-1,6-二氮杂双环[3.2.1]辛-6-基酯(601，10mg，26％)。ESI-MS(EI+,m/z):319.21。1H NMR(300MHz,D2O)δ6.61(s,1H),4.68-4.65(m,1H),4.35(s,2H),4.17-4.14(m,1H),3.14-3.10(m,1H),2.95-2.91(m,1H),2.31-1.80(m,4H)。
实施例5：合成硫酸氢(2S,5R)-2-(5-(胍基甲基)异噁唑-3-基)-7-氧代-1,6-二氮杂双环[3.2.1]辛-6-基酯(化合物603)
步骤1：合成1-(2,3-双(叔丁氧基羰基)胍基)丙-2-炔：
添加(1H-吡唑-1-基)甲烷二亚基二氨基甲酸二叔丁基酯(1.71g，5.5mmol)至丙-2-炔-1-胺(275mg，5.0mmol)和TEA(1.5g，15mmol)于MeOH(40mL)中的0℃溶液中。在0℃下搅拌反应混合物3小时且接着减压浓缩。残余物通过硅胶柱色谱(1:10EtOAc/己烷)加以纯化以得到呈白色固体状的1-(2,3-双(叔丁氧基羰基)胍基)丙-2-炔(1.4g，93％)。ESI-MS(EI+,m/z):298.1[M+H]+。
步骤2：合成(2S,5R)-6-(苯甲氧基)-2-(5-((2,3-双(叔丁氧基羰基)胍基)甲基)异噁唑-3-基)-1,6-二氮杂-双环[3.2.1]辛-7-酮：
在室温下添加1-(2,3-双(叔丁氧基羰基)胍基)丙-2-炔(362mg，1.22mmol)至(2S,5R)-6-(苯甲氧基)-N-羟基-7-氧代-1,6-二氮杂-双环[3.2.1]辛烷-2-甲亚氨酰氯(473mg，1.53mmol)于无水DCM(20mL)中的溶液中，随后逐滴添加TEA(0.16g，1.53mmol)。在室温下搅拌混合物2小时且接着浓缩。残余物通过硅胶柱色谱(梯度洗脱1:15至1:5EtOAc/ 己烷)加以纯化以得到呈白色固体状的(2S,5R)-6-(苯甲氧基)-2-(5-((2,3-双(叔丁氧基羰基)胍基)甲基)异噁唑-3-基)-1,6-二氮杂-双环[3.2.1]辛-7-酮(190mg，22％(对于两步而言))。ESI-MS(EI+,m/z):571.2[M+H]+。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ11.49(s,1H),8.86(bs,1H),7.47-7.34(m,5H),6.32(s,1H),5.09(d,J＝11.5Hz,1H),4.93(d,J＝12.0Hz,1H),4.87-4.76(m,2H),4.59(d,J＝7.0Hz,1H),3.36(s,1H),2.87-2.85(m,1H),2.70(d,J＝12Hz,1H),2.35-2.30(m,1H),2.24-2.18(m,1H),2.10-2.05(m,1H),1.81-1.78(m,1H),1.50(s,18H)。
步骤3：合成(2S,5R)-6-(羟基)-2-(5((2,3-双(叔丁氧基羰基)胍基)甲基)异噁唑-3-基)-1,6-二氮杂-双环[3.2.1]辛-7-酮：
向(2S,5R)-6-(苯甲氧基)-2-(5-((2,3-双(叔丁氧基羰基)胍基)甲基)异噁唑-3-基)-1,6-二氮杂-双环[3.2.1]辛-7-酮(240mg，0.42mmol)于THF(20mL)中的溶液中添加10％Pd/C(120mg)。在室温下在H2氛围下搅拌混合物1.5小时。接着过滤反应混合物且浓缩以提供呈白色固体状的(2S,5R)-6-(羟基)-2-(5-((2,3-双(叔丁氧基羰基)胍基)甲基)异噁唑-3-基)-1,6-二氮杂-双环[3.2.1]辛-7-酮(200mg，99％)，其直接用于下一步骤中。ESI-MS(EI+,m/z):481.2[M+H]+。
步骤4：合成(2S,5R)-2-(5-((2,3-双(叔丁氧基羰基)胍基)甲基)异噁唑-3-基)-7-氧代-1,6-二氮杂-双环[3.2.1]辛-6-基硫酸四丁铵：
向(2S,5R)-6-(羟基)-2-(5-((2,3-双(叔丁氧基羰基)胍基)甲基)异噁唑-3-基)-1,6-二氮杂-双环[3.2.1]辛-7-酮(200mg，0.42mmol)于无水吡啶(2.5mL)中的溶液中添加SO3·Py(400mg，2.5mmol)。在室温下搅拌混合物3小时，接着减压浓缩。将残余物再溶解于NaH2PO4水溶液(1.5M，20mL)中。添加硫酸氢四丁铵(200mg，0.58mmol)。在室温下搅拌混合物20分钟，接着用EtOAc(4x)萃取。干燥并浓缩合并的有机层且残余物通过硅胶柱色谱(梯度洗脱10:1至5:1DCM/丙酮)加以纯化以得到呈白色固体状的(2S,5R)-2-(5-((2,3-双(叔丁氧基羰基) 胍基)甲基)异噁唑-3-基)-7-氧代-1,6-二氮杂-双环[3.2.1]辛-6-基硫酸四丁铵(220mg，66％)。ESI-MS(EI-,m/z):559.0[M-H]-。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ11.48(s,1H),8.78(bs,1H),6.34(s,1H),4.77-4.76(m,2H),4.55(d,J＝7.5Hz,1H),4.35(m,1H),3.38-3.28(m,8H),3.20-3.18(m,1H),2.78(d,J＝11.5Hz,1H),2.37-2.30(m,1H),2.28-2.24(m,1H),2.17-2.11(m,1H),1.88-1.82(m,1H),1.71-1.63(m,8H),1.50-1.44(m,26H),1.01(t,J＝7.0Hz,12H)。
步骤5：添加TFA(2.20mL)至(2S,5R)-2-(5-((2,3-双(叔丁氧基羰基)胍基)甲基)异噁唑-3-基)-7-氧代-1,6-二氮杂-双环[3.2.1]辛-6-基硫酸四丁铵(465mg，0.60mmol)于无水DCM(6.60mL)中的0℃溶液中。使反应混合物升温至室温。在室温下搅拌反应混合物2小时且接着用乙醚稀释。通过离心收集沉淀，用乙醚(3x)洗涤且进一步在高真空下干燥。粗TFA盐通过使用甲酸铵缓冲液进行制备型HPLC加以纯化以提供呈白色固体状的硫酸氢(2S,5R)-2-(5-(胍基甲基)异噁唑-3-基)-7-氧代-1,6-二氮杂双环[3.2.1]辛-6-基酯(603，60mg，20％)。ESI-MS(EI+,m/z):361.2。1H NMR(300MHz,D2O/DMSO-d6)δ6.58(s,1H),4.74-4.71(m,1H),4.67(s,2H),4.23(br s,1H),3.22-3.17(m,1H),2.99(d,J＝12.0Hz,1H),2.36-2.26(m,1H),2.24-2.10(m,2H),2.02-1.91(m,1H)。
实施例6：合成硫酸氢(2S,5R)-2-(5-(2-氨基乙基)异噁唑-3-基)-7-氧代-1,6-二氮杂双环[3.2.1]辛-6-基酯(化合物602)
遵循实施例4中的步骤1-6，用丁-3-炔-1-基氨基甲酸叔丁酯替代步骤2中的丙-2-炔-1-基氨基甲酸叔丁酯；获得呈淡黄色固体状的硫酸氢(2S,5R)-2-(5-(2-氨基乙基)-1,3,4-噁二唑-2-基)-7-氧代-1,6-二氮杂 双环[3.2.1]辛-6-基酯TFA盐(602，8mg)。ESI-MS(EI+,m/z):333.2。1H NMR(300MHz,D2O)δ6.39(s,1H),4.62(d,J＝6.8Hz,1H),4.16-4.12(m,1H),3.32(t,J＝7.1Hz,3H),3.25-3.04(m,4H),2.97-2.93(m,1H),2.30-1.79(m,4H)。
实施例7：合成硫酸氢(2S,5R)-2-(5-(2-胍基乙基)异噁唑-3-基)-7-氧代-1,6-二氮杂双环[3.2.1]辛-6-基酯(化合物604)
遵循实施例5中的步骤1-5，用丁-3-炔-1-胺替代步骤1中的丙-2-炔-1-胺；在使用甲酸铵缓冲液进行制备型HPLC纯化之后获得呈淡黄色固体状的硫酸氢(2S,5R)-2-(5-(2-胍基乙基)异噁唑-3-基)-7-氧代-1,6-二氮杂双环[3.2.1]辛-6-基酯(604，48mg)。ESI-MS(EI+,m/z):375.1。1H NMR(300MHz,D2O/DMSO-d6)δ6.33(s,1H),4.62(d,J＝6.6Hz,1H),4.14(br s,1H),3.51(t,J＝6.4Hz,2H),3.15–3.07(m,1H),3.05(t,J＝6.4Hz,2H),2.88(d,J＝6.4Hz,1H),2.26-1.99(m,3H),1.85-1.80(m,1H)。
实施例8：合成硫酸氢(2S,5R)-7-氧代-2-(5-(哌啶-4-基)异噁唑-3-基)-1,6-二氮杂双环[3.2.1]辛-6-基酯(化合物606)
遵循实施例4中的步骤1-6，用4-乙炔基哌啶-1-甲酸叔丁酯替代步骤2中的丙-2-炔-1-基氨基甲酸叔丁酯，在使用甲酸铵缓冲液进行制备型HPLC纯化之后获得呈白色固体状的硫酸氢(2S,5R)-7-氧代 -2-(5-(哌啶-4-基)异噁唑-3-基)-1,6-二氮杂双环[3.2.1]辛-6-基酯(606，35mg)。ESI-MS(EI+,m/z):371.3。
实施例9：合成硫酸氢(2S,5R)-2-(5-(1-脒基哌啶-4-基)异噁唑-3-基)-7-氧代-1,6-二氮杂双环[3.2.1]辛-6-基酯(化合物607)
遵循实施例5中的步骤1-5，用4-乙炔基哌啶替代步骤1中的丙-2-炔-1-胺；获得硫酸氢(2S,5R)-2-(5-(1-脒基哌啶-4-基)异噁唑-3-基)-7-氧代-1,6-二氮杂双环[3.2.1]辛-6-基酯TFA盐(607，32mg)。ESI-MS(EI+,m/z):415.2。
实施例10：合成硫酸氢(2S,5R)-2-(5-((2-氨基乙基)氨基甲酰基)异噁唑-3-基)-7-氧代-1,6-二氮杂双环[3.2.1]辛-6-基酯(化合物605)
遵循实施例4中的步骤1-6，用(2-丙炔酰氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯替代步骤2中的丙-2-炔-1-基氨基甲酸叔丁酯，获得呈淡黄色固体状的硫酸氢(2S,5R)-2-(5-((2-氨基乙基)氨基甲酰基)异噁唑-3-基)-7-氧代-1,6-二氮杂双环[3.2.1]辛-6-基酯TFA盐(605，20mg)。ESI-MS(EI+,m/z):376.1。1H NMR(300MHz,D2O)δ7.05(s,1H),4.70(m,1H,overlapped with D2O peak)4.16(br s,1H),3.66(t,J＝5.8Hz,2H),3.19(t,J＝5.8Hz,2H),3.16-3.08(m,1H),2.93(d,J＝12.0Hz,1H),2.31-2.24(m,1H),2.16-2.04(m,2H),1.94-1.85(m,1H)。
实施例11：合成硫酸氢(2S,5R)-2-(5-((2-胍基乙基)氨基甲酰基)异噁唑-3-基)-7-氧代-1,6-二氮杂双环[3.2.1]辛-6-基酯(化合物608)
遵循实施例5中的步骤1-5，用N-(2-氨基乙基)丙炔酰胺替代步骤1中的丙-2-炔-1-胺；在使用甲酸铵缓冲液进行制备型HPLC纯化之后获得呈白色固体状的硫酸氢(2S,5R)-2-(5-((2-胍基乙基)氨基甲酰基)异噁唑-3-基)-7-氧代-1,6-二氮杂双环[3.2.1]辛-6-基酯(608，25mg)。ESI-MS(EI+,m/z):418.12。1H NMR(300MHz,D2O)δ4.79-4.76(m,1H),4.16(br s,1H),4.47-4.32(m,4H),4.17-4.11(m,2H),3.19–3.16(m,1H),2.92(d,J＝12.0Hz,1H),2.32-2.22(m,1H),2.20-2.06(m,2H),1.97-1.88(m,1H)。
实施例12：合成硫酸氢(2S,5R)-7-氧代-2-(5-(2-(哌啶-4-基氨基)乙基)异噁唑-3-基)-1,6-二氮杂双环[3.2.1]辛-6-基酯(化合物609)
合成流程：
程序和表征：
步骤1：合成4-(丁-3-炔基氨基)哌啶-1-甲酸叔丁酯：
在室温下搅拌丁-3-炔-1-胺盐酸盐(26.4g，0.25mol)、K2CO3(17.4g，0.13mol)和4-氧代哌啶-1-甲酸叔丁酯(41.8g，0.21mol)于MeOH(500mL)中的混合物5小时。接着，添加NaBH(OAc)3(133.6g，0.63mol)且在室温下搅拌混悬液17小时。粗反应混合物直接用于下一步骤中。ESI-MS(EI+,m/z):253.2[M+H]+。
步骤2：合成4-(丁-3-炔基(叔丁氧基羰基)氨基)哌啶-1-甲酸叔丁酯:
冷却步骤1中的反应混合物至0℃且添加Et3N(88.0mL，0.63mol)和(Boc)2O(91.6g，0.42mol)。使溶液升温至室温，接着在室温下搅拌17小时。浓缩反应混合物，且接着添加EtOAc(800mL)。有机层用饱和氯化钠(3x)洗涤，经Na2SO4干燥，且浓缩。残余物通过硅胶柱色谱(梯度洗脱0～10％EtOAC/石油醚)加以纯化以提供呈无色油状的4-(丁-3-炔基(叔丁氧基羰基)氨基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(66.0g，90％)。ESI-MS(EI+,m/z):353.2[M+H]+。
步骤3-6：遵循实施例5中的步骤2-5，用4-(丁-3-炔-1-基(叔丁氧基羰基)氨基)哌啶-1-甲酸叔丁酯替代步骤2中的1-(2,3-双(叔丁氧基羰基)胍基)丙-2-炔；在使用甲酸铵缓冲液进行制备型HPLC纯化之后获得呈白色固体状的硫酸氢(2S,5R)-7-氧代-2-(5-(2-(哌啶-4-基氨基)乙基)异噁唑-3-基)-1,6-二氮杂双环[3.2.1]辛-6-基酯(609，220mg)。ESI-MS(EI+,m/z):416.4。1H NMR(300MHz,D2O)δ6.29(s,1H),4.59(d,J＝6.3Hz,1H),4.12(s,1H),3.39(d,J＝13.3Hz,2H),3.10-2.91(m,9H),2.23–1.95(m,5H),1.87-1.76(m,1H),1.54–1.40(m,2H)。
实施例13：合成硫酸氢(2S,5R)-2-(5-(2-((1-脒基哌啶-4-基)氨基)乙基)异噁唑-3-基)-7-氧代-1,6-二氮杂双环[3.2.1]辛-6-基酯(化合物610)
合成流程：
程序和表征：
步骤1：合成哌啶-4-酮：
在室温下搅拌4-氧代哌啶-1-甲酸叔丁酯(10.0g，50mmol)、TFA(20mL)和CH2Cl2(100mL)的混合物1小时。接着浓缩反应混合物以提供呈无色油状的哌啶-4-酮(15.0g，100％)。1H NMR:(500MHz,DMSO-d6):δ2.51(m,4H),3.43(m,4H),9.03(m,2H)。
步骤2：合成(4-氧代哌啶-1-基)亚甲基二氨基甲酸二叔丁基酯：
添加(Z)-(1H-咪唑-1-基)亚甲基二氨基甲酸二叔丁酯(16.3g，52.5mmol)至哌啶-4-酮(15g，50mmol)和Et3N(25.4g，251mmol)于MeOH(200mL)中的0℃溶液中。使反应混合物升温至室温，接着在室温下搅拌17小时。浓缩反应混合物，且接着添加EtOAc(300mL)。有机层用饱和氯化钠(3x)洗涤，经Na2SO4干燥，且浓缩。残余物通过硅胶柱色谱(梯度洗脱0～20％EtOAc/石油醚)加以纯化以提供呈白色固体状的(4-氧代哌啶-1-基)亚甲基二氨基甲酸二叔丁酯(12.8g，75％)。ESI-MS(EI+,m/z):342.1[M+H]+。
步骤3：合成(4-(丁-3-炔基氨基)哌啶-1-基)甲烷二亚基二氨基甲酸二叔丁酯：
在室温下搅拌丁-3-炔-1-胺盐酸盐(3.0g，28.4mmol)、K2CO3(2.0g，14.2mmol)、MeOH(150mL)、(4-氧代哌啶-1-基)亚甲基-二氨基甲酸二叔丁酯(8.1g，23.7mmol)和分子筛(6.0g)的混合物3小时。接着，添加NaBH(OAc)3(15.1g，71.1mmol)，且在70℃下搅拌混悬液1小时。过滤反应混合物且浓缩以提供呈黄色油状的(4-(丁-3-炔基氨基)哌啶-1-基)甲烷二亚基二氨基甲酸二叔丁酯(约15.0g)，其直接用于下一步骤中。
步骤4：合成(4-(丁-3-炔基(氨基甲酸叔丁酯))哌啶-1-基)甲烷二亚基二氨基甲酸二叔丁酯：
在室温下搅拌(4-(丁-3-炔基氨基)哌啶-1-基)甲烷二亚基二氨基甲酸二叔丁酯(约15.0g)、二碳酸二叔丁酯(10.3g，47.4mmol)、NaHCO3水溶液(60mL)于THF(120mL)中的混合物2小时。接着浓缩反应混合物且用EtOAc(3x)萃取。干燥(Na2SO4)合并的有机物且浓缩。残余物通过硅胶柱色谱(梯度洗脱0～20％EtOAc/石油醚)加以纯化以提供呈无色油状的(4-(丁-3-炔基(氨基甲酸叔丁酯))哌啶-1-基)甲烷二亚基二氨基甲酸二叔丁酯(7.1g，60％)。ESI-MS(EI+,m/z):495.3[M+H]+。
步骤5-8：遵循实施例5中的步骤2-5，用(1-(N,N'-双(叔丁氧基羰基)脒基)哌啶-4-基)(丁-3-炔-1-基)氨基甲酸叔丁酯替代步骤2中的1-(2,3-双(叔丁氧基羰基)胍基)丙-2-炔；在使用甲酸铵缓冲液进行制备型HPLC纯化之后获得呈白色固体状的硫酸氢(2S,5R)-2-(5-(2-((1-脒基哌啶-4-基)氨基)乙基)异噁唑-3-基)-7-氧代-1,6-二氮杂双环[3.2.1]辛-6-基酯(610，502mg)。ESI-MS(EI+,m/z):458.0。1H NMR(300MHz,D2O)δ6.35(s,1H),4.59(d,J＝7.0Hz,1H),4.12(s,1H),3.85(d,J＝14.5Hz,2H),3.40-3.30(m,3H),3.20–2.90(m,6H),2.20-1.75(m, 6H),1.62-1.46(m,2H)。
如遵循实施例1-13的类似程序的反应流程中所述制备实施例14-33中所述的化合物
实施例14：合成硫酸氢(2S,5R)-2-(5-((R*)-2-胍基-1-羟基乙基)异噁唑-3-基)-7-氧代-1,6-二氮杂双环[3.2.1]辛-6-基酯(化合物611)
合成流程：
表征：
在使用甲酸铵缓冲液进行制备型HPLC纯化之后获得呈白色固体状的硫酸氢(2S,5R)-2-(5-((R*)-2-胍基-1-羟基乙基)异噁唑-3-基)-7-氧代-1,6-二氮杂双环[3.2.1]辛-6-基酯(611，46mg)。ESI-MS(EI+,m/z):391.0。1H NMR(300MHz,D2O)δ6.46(s,1H),5.04(t,J＝5.2Hz,1H),4.62(d,J＝6.7Hz,1H),4.11(s,1H),3.56(d,J＝5.2Hz,2H),3.08(d,J＝11.6Hz,1H),2.85(d,J＝12.1Hz,1H),2.24–2.14(m,1H),2.12-2.00(m,2H),1.86-1.76(m,1H)。
实施例15合成硫酸氢(2S,5R)-2-(5-((S*)-2-胍基-1-羟基乙基)异噁唑-3-基)-7-氧代-1,6-二氮杂双环[3.2.1]辛-6-基酯(化合物612)
合成流程：
表征：
在使用甲酸铵缓冲液进行制备型HPLC纯化之后获得呈白色固体状的硫酸氢(2S,5R)-2-(5-((S*)-2-胍基-1-羟基乙基)异噁唑-3-基)-7-氧代-1,6-二氮杂双环[3.2.1]辛-6-基酯(612，72mg)。ESI-MS(EI+,m/z):391.0。1H NMR(300MHz,D2O)δ6.47(s,1H),5.04(t,J＝5.4Hz,1H),4.63(d,J＝6.2Hz,1H),4.12(s,1H),3.65–3.49(m,2H),3.09(br d,J＝12.7Hz,1H),2.87(d,J＝12.2Hz,1H),2.20-1.98(m,3H),1.86-1.78(m,1H)。
实施例16：合成硫酸氢(2S,5R)-2-(5-((1-胍基环丙基)甲基)异噁唑-3-基)-7-氧代-1,6-二氮杂双环[3.2.1]辛-6-基酯(化合物613)
合成流程：
表征：
在使用甲酸铵缓冲液进行制备型HPLC纯化之后获得呈白色固体状的硫酸氢(2S,5R)-2-(5-((1-胍基环丙基)甲基)异噁唑-3-基)-7-氧代-1,6-二氮杂双环[3.2.1]辛-6-基酯(613，28mg)。ESI-MS(EI+,m/z):401.3。1H NMR(300MHz,D2O)δ6.35(s,1H),4.61(d,J＝6.6Hz,1H),4.12(br s,1H),3.11-3.09(m,1H),3.08-2.98(m,2H),2.89(d,J＝12.0Hz,1H),2.20-2.00(m,3H),1.89–1.78(m,1H),0.97-0.95(m,4H)。
实施例17：合成硫酸氢(2S,5R)-2-(5-((1-甲基胍基)甲基)异噁唑-3-基)-7-氧代-1,6-二氮杂双环[3.2.1]辛-6-基酯(化合物614)
合成流程：
表征：
在使用甲酸铵缓冲液进行制备型HPLC纯化之后获得呈白色固体状的硫酸氢(2S,5R)-2-(5-((1-甲基胍基)甲基)异噁唑-3-基)-7-氧代-1,6-二氮杂双环[3.2.1]辛-6-基酯(614，12mg)。ESI-MS(EI+,m/z):375.1。1H NMR(300MHz,D2O与几滴DMSO-d6)δ6.55(s,1H),4.73(s,2H),4.64(d,J＝6.0Hz,1H),4.14(br s,1H),3.15-3.07(m,1H),3.06(s,3H),2.89(d,J＝12.2Hz,1H),2.26-2.20(m,1H),2.15-2.09(m,2H),1.92-1.85(m,1H)。
实施例18：合成硫酸氢(2S,5R)-2-(5-(3-胍基丙基)异噁唑-3-基)-7-氧代-1,6-二氮杂双环[3.2.1]辛-6-基酯(化合物615)
合成流程：
表征：
在使用甲酸铵缓冲液进行制备型HPLC纯化之后获得呈白色固体状的硫酸氢(2S,5R)-2-(5-(3-胍基丙基)异噁唑-3-基)-7-氧代-1,6-二氮杂双环[3.2.1]辛-6-基酯(615，18mg)。ESI-MS(EI+,m/z):389.1。1HNMR(300MHz,D2O与几滴DMSO-d6)δ6.28(s,1H),4.57(d,J＝6.5Hz,1H),4.11(s,1H),3.17(t,J＝6.7Hz,2H),3.07(br d,J＝11.5Hz,1H),2.88(d,J＝12.4Hz,1H),2.83(t,J＝6.7Hz,2H),2.22–1.75(m,6H)。
实施例19：合成硫酸氢(2S,5R)-2-(5-((1s,3R)-3-氨基环丁基)异噁唑-3-基)-7-氧代-1,6-二氮杂双环[3.2.1]辛-6-基酯(化合物616)
合成流程：
表征：
在使用甲酸铵缓冲液进行制备型HPLC纯化之后获得呈白色固体状的硫酸氢(2S,5R)-2-(5-((1s,3R)-3-氨基环丁基)异噁唑-3-基)-7-氧代-1,6-二氮杂双环[3.2.1]辛-6-基酯(616，7mg)。ESI-MS(EI+,m/z):359.0。1H NMR(300MHz,DMSO)δ6.43(s,1H),4.46(d,J＝6.1Hz, 1H),4.02(br s,1H),3.75-3.68(m,1H),3.51-3.45(m,1H),2.94–2.85(m,1H),2.72-2.60(m,3H),2.36–2.30(m,2H),2.15-1.95(m,1H),1.99-1.90(m,2H),1.78-1.72(m,1H)。
实施例20：合成硫酸氢(2S,5R)-2-(5-((1s,3R)-3-胍基环丁基)异噁唑-3-基)-7-氧代-1,6-二氮杂双环[3.2.1]辛-6-基酯(化合物617)
合成流程：
表征：
在使用甲酸铵缓冲液进行制备型HPLC纯化之后获得呈白色固体状的硫酸氢(2S,5R)-2-(5-((1s,3R)-3-胍基环丁基)异噁唑-3-基)-7-氧代-1,6-二氮杂双环[3.2.1]辛-6-基酯(617，37mg)。ESI-MS(EI+,m/z):401.0。1H NMR(300MHz,DMSO)δ8.11(br s,1H),7.14(brs,4H),6.41(s,1H),4.45(d,J＝6.3Hz,1H),4.02(br s,2H),3.40-3.30(m,1H), 2.91(br d,J＝10.3Hz,1H),2.80-2.63(m,3H),2.30–2.10(m,3H),2.00–1.85(m,2H),1.82–1.66(m,1H)。
实施例21：合成硫酸氢(2S,5R)-2-(5-(氮杂环丁烷-3-基甲基)异噁唑-3-基)-7-氧代-1,6-二氮杂双环[3.2.1]辛-6-基酯(化合物618，)
合成流程：
表征：
在使用甲酸铵缓冲液进行制备型HPLC纯化之后获得呈白色固体状的硫酸氢(2S,5R)-2-(5-(氮杂环丁烷-3-基甲基)异噁唑-3-基)-7-氧代-1,6-二氮杂双环[3.2.1]辛-6-基酯(618，75mg)。ESI-MS(EI+,m/z):359.0。1H NMR(300MHz,D2O)δ6.23(s,1H),4.56(d,J＝6.6Hz,1H),4.15-4.08(m,2H),3.93–3.82(m,2H),3.44(dd,J＝14.3,7.2Hz,1H),3.28(dt,J＝15.9,7.9Hz,1H),3.10–3.03(m,3H),2.87(d,J＝12.1Hz, 1H),2.21–1.94(m,3H),1.84-1.76(m,1H)。
实施例22：合成硫酸氢(2S,5R)-2-(5-((1-脒基氮杂环丁烷-3-基)甲基)异噁唑-3-基)-7-氧代-1,6-二氮杂双环[3.2.1]辛-6-基酯(化合物619，)
合成流程：
表征：
在使用甲酸铵缓冲液进行制备型HPLC纯化之后获得呈白色固体状的硫酸氢(2S,5R)-2-(5-((1-脒基氮杂环丁烷-3-基)甲基)异噁唑-3-基)-7-氧代-1,6-二氮杂双环[3.2.1]辛-6-基酯(619，45mg)。ESI-MS(EI+,m/z):401.0。1H NMR(300MHz,DMSO)δ7.28(br s,4H),6.36(s,1H),4.45(d,J＝6.8Hz,1H),4.18(t,J＝8.4Hz,2H),4.02(br s,1H),3.86–3.71(m,2H),3.16(d,J＝7.0Hz,2H),3.09-3.04(m,1H),2.90(br d,J＝8.7Hz,1H),2.67(d,J＝11.8Hz,1H),2.16-2.09(m,1H),2.00–1.90 (m,2H),1.80–1.72(m,1H)。
实施例23：合成硫酸氢(2S,5R)-2-(5-(2-((2-氨基乙基)氨基)乙基)异噁唑-3-基)-7-氧代-1,6-二氮杂双环[3.2.1]辛-6-基酯(化合物620)
合成流程：
表征：
在使用甲酸铵缓冲液进行制备型HPLC纯化之后获得呈白色固 体状的硫酸氢(2S,5R)-2-(5-(2-((2-氨基乙基)氨基)乙基)异噁唑-3-基)-7-氧代-1,6-二氮杂双环[3.2.1]辛-6-基酯(620，20mg，呈甲酸盐形式)。ESI-MS(EI+,m/z):376.3。1H NMR(300MHz,D2O)δ8.32(s,1H),6.35(s,1H),4.59(d,J＝6.5Hz,1H),4.11(br s,1H),3.34(t,J＝6.8Hz,2H),3.30–3.13(m,6H),3.11–3.03(m,1H),2.91(d,J＝12.2Hz,1H),2.21–1.98(m,3H),1.88–1.78(m,1H)。
实施例24：合成硫酸氢(2S,5R)-2-(5-(2-((2-胍基乙基)氨基)乙基)异噁唑-3-基)-7-氧代-1,6-二氮杂双环[3.2.1]辛-6-基酯(化合物621，)
合成流程：
表征：
在使用甲酸铵缓冲液进行制备型HPLC纯化之后获得呈白色固体状的硫酸氢(2S,5R)-2-(5-(2-((2-胍基乙基)氨基)乙基)异噁唑-3-基)-7-氧代-1,6-二氮杂双环[3.2.1]辛-6-基酯(612，15mg，呈甲酸盐形式)。ESI-MS(EI+,m/z):418.0。1H NMR(300MHz,D2O)δ8.28(s,1H),6.30(s,1H),4.55(d,J＝5.9Hz,1H),4.07(br s,1H),3.40(t,J＝5.9Hz,2H),3.25(t,J＝6.1Hz,2H),3.14-3.01(m,5H),2.87(d,J＝12.1Hz,1H),2.16-2.09(m,1H),2.07-1.92(m,2H),1.83-1.74(m,1H)。
实施例25：合成硫酸氢(2S,5R)-2-(5-((氮杂环丁烷-3-基氨基)甲基)异噁唑-3-基)-7-氧代-1,6-二氮杂双环[3.2.1]辛-6-基酯(化合物622，)
合成流程：
表征：
在使用甲酸铵缓冲液进行制备型HPLC纯化之后获得呈白色固体状的硫酸氢(2S,5R)-2-(5-((氮杂环丁烷-3-基氨基)甲基)异噁唑-3-基)-7-氧代-1,6-二氮杂双环[3.2.1]辛-6-基酯(622，267mg)。ESI-MS(EI+,m/z):374.0。1H NMR(400MHz,D2O)δ6.55(s,1H),4.66(d,J＝6.6Hz,1H),4.29–4.10(m,5H),4.10–3.98(m,2H),3.12(d,J＝12.0Hz,1H),2.91(d,J＝12.1Hz,1H),2.30–2.18(m,1H),2.18–1.99(m,2H),1.97–1.78(m,1H)。
实施例26：合成硫酸氢(2S,5R)-2-(5-(2-(氮杂环丁烷-3-基氨基)乙基)异噁唑-3-基)-7-氧代-1,6-二氮杂双环[3.2.1]辛-6-基酯(化合物623，)
合成流程：
表征：
在使用甲酸铵缓冲液进行制备型HPLC纯化之后获得呈白色固体状的硫酸氢(2S,5R)-2-(5-(2-(氮杂环丁烷-3-基氨基)乙基)异噁唑-3-基)-7-氧代-1,6-二氮杂双环[3.2.1]辛-6-基酯(623，41mg)。ESI-MS(EI+,m/z):388.0。
实施例27：合成硫酸氢(2S,5R)-2-(5-((氮杂环丁烷-3-基氧基)甲基)异噁唑-3-基)-7-氧代-1,6-二氮杂双环[3.2.1]辛-6-基酯(化合物624)
合成流程：
表征：
在使用甲酸铵缓冲液进行制备型HPLC纯化之后获得呈白色固体状的硫酸氢(2S,5R)-2-(5-((氮杂环丁烷-3-基氧基)甲基)异噁唑-3-基)-7-氧代-1,6-二氮杂双环[3.2.1]辛-6-基酯(624，349mg)。ESI-MS(EI+,m/z):375.2。1H NMR(300MHz,D2O)δ6.51(s,1H),4.64(s,2H),4.62(d,J＝7.2Hz,1H),4.56-4.52(m,1H),4.20(dd,J＝12.5,6.7Hz,2H),4.11(br s,1H),3.93(dd,J＝12.3,5.2Hz,2H),3.08(br d,J＝12.4Hz,1H),2.87(d,J＝12.2Hz,1H),2.22-2.14(m,1H),2.12–2.00(m,2H),187-1.78(m,1H)。
实施例28：合成硫酸(2S,5R)-2-(5-(1-甲基吡啶-1-鎓-4-基)异噁唑-3-基)-7-氧代-1,6-二氮杂双环[3.2.1]辛-6-基酯(化合物625)
合成流程：
表征：
获得呈白色固体状的硫酸(2S,5R)-2-(5-(1-甲基吡啶-1-鎓-4-基)异噁唑-3-基)-7-氧代-1,6-二氮杂双环[3.2.1]辛-6-基酯(625，20mg)。ESI-MS(EI-,m/z):379.0。1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ9.15(d,J＝5.2Hz,2H),8.60(d,J＝5.2Hz,2H),7.86(s,1H),4.66(d,J＝5.6Hz,1H),4.36(s,3H),4.07(br s,1H),3.00–2.98(m,1H),2.79(d,J＝12.2Hz,1H),2.24–2.20(m,1H),2.10–2.00(m,2H),1.82–1.78(m,1H)。
实施例29：合成硫酸(2S,5R)-2-(5-(1,1-二甲基哌啶-1-鎓-4-基)异噁唑-3-基)-7-氧代-1,6-二氮杂双环[3.2.1]辛-6-基酯(化合物626)
合成流程：
表征：
在使用甲酸铵缓冲液进行制备型HPLC纯化之后获得呈白色固体状的硫酸(2S,5R)-2-(5-(1,1-二甲基哌啶-1-鎓-4-基)异噁唑-3-基)-7-氧代-1,6-二氮杂双环[3.2.1]辛-6-基酯(626，86mg)。ESI-MS(EI-,m/z):399.2。1H NMR(400MHz,CF3COOD):δ7.24(s,1H),6.03(d,J＝6.8Hz,1H),5.44(br s,1H),4.76–4.72(m,1H),4.51(d,J＝12.2Hz,1H),4.26–4.12(m,4H),3.99–3.92(m,1H),3.85(s,3H),3.82(s,3H),3.26–3.22(m,1H),3.21–2.85(m,7H)。
实施例30：合成硫酸氢(2S,5R)-7-氧代-2-(5-(哌啶-4-基甲基)异噁唑-3-基)-1,6-二氮杂双环[3.2.1]辛-6-基酯(化合物627)
合成流程：
表征：
在使用甲酸铵缓冲液进行制备型HPLC纯化之后获得呈白色固体状的硫酸氢(2S,5R)-7-氧代-2-(5-(哌啶-4-基甲基)异噁唑-3-基)-1,6-二氮杂双环[3.2.1]辛-6-基酯(627，31mg)。ESI-MS(EI+,m/z):387.0。
实施例31：合成硫酸氢(2S,5R)-2-(5-(氮杂环丁烷-3-基)异噁唑-3-基)-7-氧代-1,6-二氮杂双环[3.2.1]辛-6-基酯(化合物628)
表征：
在使用甲酸铵缓冲液进行制备型HPLC纯化之后获得呈白色固体状的硫酸氢(2S,5R)-2-(5-(氮杂环丁烷-3-基)异噁唑-3-基)-7-氧代-1,6-二氮杂双环[3.2.1]辛-6-基酯(628，15mg)。ESI-MS(EI+,m/z):345.0。1H NMR(300MHz,D2O)δ6.48(s,1H),4.62(d,J＝5.2Hz,1H),4.47–4.22(m,5H),4.15-4.12(m,1H),3.17–3.03(m,1H),2.91(d,J＝12.0Hz,1H),2.24–2.17(m,1H),2.12-2.00(m,2H),1.90–1.80(m,1H)。CB-606,122。
实施例32：合成硫酸氢(2S,5R)-2-(2-(5-(氮杂环丁烷-3-基)乙基)异噁唑-3-基)-7-氧代-1,6-二氮杂双环[3.2.1]辛-6-基酯(化合物629)
合成流程：
表征：
在使用甲酸铵缓冲液进行制备型HPLC纯化之后获得呈白色固体状的硫酸氢(2S,5R)-2-(5-(2-(氮杂环丁烷-3-基)乙基)异噁唑-3-基)-7-氧代-1,6-二氮杂双环[3.2.1]辛-6-基酯(629，34mg)。ESI-MS(EI+,m/z):373.0。1H NMR(300MHz,DMSO)δ8.33(br s,2H),6.33(s,1H),4.45(d,J＝6.4Hz,1H),4.01(br s,1H),3.92(t,J＝9.0Hz,2H),3.61(t,J＝9.0Hz,2H),3.40–3.26(m,1H),2.94–2.88(m,1H),2.85–2.70(m,4H),2.16–2.08(m,1H),2.06–1.87(m,3H),1.84–1.67(m,1H)。
实施例33：合成硫酸氢(2S,5R)-7-氧代-2-(5-(吡咯烷-3-基甲基)异噁唑-3-基)-1,6-二氮杂双环[3.2.1]辛-6-基酯(化合物630)
合成流程：
表征：
在使用甲酸铵缓冲液进行制备型HPLC纯化之后获得呈白色固体状的硫酸氢(2S,5R)-7-氧代-2-(5-(吡咯烷-3-基甲基)异噁唑-3-基)-1,6-二氮杂双环[3.2.1]辛-6-基酯(630，9mg)。ESI-MS(EI-,m/z):371.0。1H NMR(300MHz,D2O)δ6.29(s,1H),4.59(d,J＝6.6Hz,1H),4.12(br s,1H),3.43(dd,J＝7.6,5.0Hz,1H),3.39–3.29(m,1H),3.26–3.14(m,1H),3.12–3.03(m,1H),2.97–2.85(m,4H),2.74-2.61(m,1H),2.20-2.00(m,4H),1.87-1.78(m,1H),1.74–1.60(m,1H)。
实施例34：构建同基因β-内酰胺酶菌株
通过将β-内酰胺酶基因克隆至pBR322(GenBank登录号J01749)的定制衍生物中且使工程化质粒转化至大肠杆菌中来构建一组β-内酰胺酶表达性同基因大肠杆菌菌株。移除pBR322的质粒骨架内的N deI限制位点以产生pBR322ΔNdeI。使用以下两种引物扩增减去bla TEM-1基因的pBR322ΔNdeI载体自身：(1)pBR-Pbla 5’-cgcatatgactcttcctttttcaatattattg-3，SEQ ID 1，在blaTEM-1启动子的3’末端处具有工程化NdeI限制位点的引物，和(2)pBR-vec-15’-gcggatccctgtcagaccaagtttactc-3’，SEQ ID 2，在blaTEM-1开放阅读框的3’末端处具有工程化BamHI限制位点的引物。通过使用在抗性基因的5’末端处具有工程化NdeI限制位点的引物(Pbla-cat 5’-gccatatgatggagaaaaaaatcactgg-3’，SEQ ID 3)和在抗性基因的3’末端处具有工程化BamHI限制位点的引物(Vec-1-cat 5’-cgggatccctagagaataggaacttcgg-3’，SEQ ID 4)自pKD3(GenBank登录号AY048742)进行PCR扩增来产生氯霉素抗性基因cat。将两种PCR产物pBR322ΔNdeI和cat连接在一起，从而产生pBR-CBST(pBR322ΔNdeIΔTEM-1::cat Seq.ID 5)，其保留pBR322四环素抗性盒tetA与质粒复制起点两者，但blaTEM-1基因被cat基因置换。
使用这个工程化策略，利用在各基因的5’末端处具有工程化NdeI限制位点以及在各基因的3’末端处具有BamHI限制位点的合成基因产生许多产生来自不同类别(参见下文)的β-内酰胺酶基因的质粒。将合成β-内酰胺酶基因与cat基因两者都连接至pBR322ΔNdeI PCR产物的NdeI/BamHI位点中且转化至电感受态大肠杆菌ElectroMax DH10B(Invitrogen/Life Technologies)中。在LB琼脂(补充有25μg/mL四环素)上选择具有重组质粒的大肠杆菌DH10B且接着将单一分离的菌落接种至5mL LB培养基(补充有25μg/mL四环素)中，并在37℃下在通气(250rpm)下孵育18小时。将培养物于20％甘油中冷冻回-80℃下。确认克隆的β-内酰胺酶基因的DNA序列。β-内酰胺酶基因在重组大肠杆菌菌株中的表达由pBR-CBST质粒中的blaTEM-1启动 子驱动且通过在发酵液微量稀释测定中相对于比较物β-内酰胺/BLI组合对大肠杆菌重组菌株进行MIC分布分析加以表征。
用于大肠杆菌同基因菌株中的pBR-CBST质粒(含有β-内酰胺酶或cat基因)的核苷酸序列(相关限制位点加下划线；β-内酰胺酶序列全部用大写表示，tetA序列用斜体表示)
实施例35：标准BLI增强MIC测定
通过使用发酵液微量稀释方法测定β-内酰胺和BLI化合物组合针对各种β-内酰胺酶产生性细菌菌株的最小抑制浓度(MIC)来证明化合物能够增强β-内酰胺的活性。根据临床和实验室标准研究所(CLSI)指导方针，在如下所述的修改下执行实验方案(CLSI指导方针可由2012年1月公布的CLSI文件M07-A9：“Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically；Approved Standard-第9版”获得)。
为准备MIC测试，临床分离物(肺炎克雷伯氏菌、大肠杆菌、肠杆菌属种、柠檬酸杆菌属种或绿脓假单胞菌)的冷冻甘油储备物用于划线以在含有5％绵羊血的富集非选择性胰蛋白酶大豆琼脂(TSAB)上分离菌落。含有克隆的β-内酰胺酶表达质粒的实验室工程化同基因大肠杆菌菌株的冷冻甘油储备物用于划线以在补充有用以维持质粒的25μg/mL四环素的富集选择性LB琼脂上分离菌落。所有菌株都在37℃下孵育18-24小时。
在测试当天，通过自含有临床菌株的TSAB板或含有工程化菌株的补充有四环素的LB板刮除5-10个菌落来开始原代培养。将临床菌 株材料在14mL培养管中混悬于约5mL阳离子调整的穆勒欣顿发酵液(CAMHB)中。将工程化菌株材料在14mL培养管中混悬于CAMHB(补充有25μg/mL四环素)中。所有菌株都在37℃下在通气(200rpm)下孵育约2小时，直至在600nm下的光密度(OD600)≥0.1。
将测定的两种化合物组分各自于CAMHB中稀释且添加至96孔发酵液微量稀释测定板中。以2倍稀释方式添加50μLβ-内酰胺至测定板的各孔中，其中最终浓度在128至0.13μg/mL的范围内。在最终浓度4μg/mL下添加25μL BLI化合物至发酵液微量稀释板中的所有孔中。通过以下方式来制备接种培养物：将原代培养物标准化至OD600＝0.1，且接着每1mL用于临床菌株的CAMHB或用于工程化菌株的CAMHB(在100μg/mL下补充有四环素)添加20μL调整的原代培养物，以使最终接种物密度是每毫升约105个菌落形成单位。稀释的接种培养物用于接种96孔发酵液微量稀释测定板中的每孔25μL。各孔的最终体积是100μL且含有在不同浓度下的β-内酰胺、在4μg/mL浓度下的BLI化合物、在OD600约0.001下的细菌培养物以及在必要时在25μg/mL下的四环素。
在37℃下在通气(200rpm)下孵育各板18-20小时。在孵育之后，将各板放置在观察装置(下部竖立有镜子)上，目视确认生长，且接着使用SpectraMax 340PC384板读取器(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)测量OD600。生长定义为可用肉眼检测到混浊或达成最小OD600为0.1。MIC值定义为不产生可见混浊的最低浓度。
代表性化合物的MIC值显示于表II中。
实施例36：协同MIC(sMIC)测定
协同MIC(sMIC)测定测定的是为增强固定浓度的β-内酰胺抗生素针对β-内酰胺酶产生性细菌菌株的活性所需的BLI浓度。根据临床和实验室标准研究所(CLSI)指导方针，在如下所述的修改下执行实验方案(CLSI指导方针可由2012年1月公布的CLSI文件M07-A9： “Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically；Approved Standard-第9版”获得)。通过以下方式来建立测定：跨越96孔发酵液微量稀释测定板的各行12个孔中的11个孔连续稀释BLI，在固定浓度下添加β-内酰胺至测定板中的所有孔中，用细菌菌株接种测定板，以及测定为抑制过夜细菌生长所需的最低BLI浓度。在测定板的含有在固定浓度下的β-内酰胺但不含有任何BLI的第12个孔中的细菌生长证明细菌菌株对在固定浓度4μg/mL下的β-内酰胺抗生素(例如头孢特咯瓒)具有抗性。
为准备MIC测试，临床分离物(肺炎克雷伯氏菌、大肠杆菌、肠杆菌属种、柠檬酸杆菌属种或绿脓假单胞菌)的冷冻甘油储备物用于划线以在含有5％绵羊血的富集非选择性胰蛋白酶大豆琼脂(TSAB)上分离菌落。含有克隆的β-内酰胺酶表达质粒的实验室工程化同基因大肠杆菌菌株的冷冻甘油储备物用于划线以在补充有用以维持质粒的25μg/mL四环素的富集选择性LB琼脂上分离菌落。所有菌株都在37℃下孵育18-24小时。
在测试当天，通过自含有临床菌株的TSAB板或含有工程化菌株的补充有四环素的LB板刮除5-10个菌落来开始原代培养。将临床菌株材料在14mL培养管中混悬于约5mL阳离子调整的穆勒欣顿发酵液(CAMHB)中。将工程化菌株材料在14mL培养管中混悬于CAMHB(在25μg/mL下补充有四环素)中。所有菌株都在37℃下在通气(200rpm)下孵育约2小时，直至OD600≥0.1。
将测定的两种化合物组分各自于CAMHB中制备且添加至96孔发酵液微量稀释测定板中。以2倍稀释方式添加50μL BLI至测定板的各孔中，其中最终浓度在128至0.13μg/mL的范围内。在最终浓度4μg/mL下添加25μLβ-内酰胺至发酵液微量稀释板中的所有孔中。通过以下方式来制备接种培养物：将原代培养物标准化至OD600＝0.1，且接着每1mL用于临床菌株的CAMHB或用于同基因菌株的CAMHB(在100μg/mL下补充有四环素)添加20μL调整的原代培养 物，以使最终接种物密度是每毫升约105个菌落形成单位。稀释的接种培养物用于接种96孔发酵液微量稀释测定板中的每孔25μL。各孔的最终体积是100μL且含有在不同浓度下的BLI、在4μg/mL浓度下的β-内酰胺、在OD600为约0.001下的细菌培养物以及在必要时在25ug/mL下的四环素。
解释sMIC数据：
在37℃下在通气(200rpm)下孵育各板18-20小时。在孵育之后，将各板放置在观察装置(下部竖立有镜子)上，目视确认生长，且接着使用SpectraMax 340PC384板读取器(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)测量OD600。生长定义为可用肉眼检测到混浊或达成最小OD600为0.1。sMIC值定义为不产生可见混浊的最低浓度。
sMIC值表示为增强4μg/ml CXA-101(头孢特咯瓒)或头孢他啶抑制β-内酰胺酶产生性细菌的生长的活性所需的BLI量。
代表性化合物的sMIC值显示于表III中。
实施例37：抑制动力学
使用100μM头孢硝噻(nitrocefin，NCF)作为报道体底物评估由测试抑制剂对KPC-2的抑制或失活。于96孔半区域板中以50μl反应体积在1x PBS(pH 7.4)、0.1mg/ml BSA中进行测定。将NCF溶解于DMSO中且于测定缓冲液中稀释。将测试抑制剂溶解于水或DMSO中且在测定中连续稀释，其中最终浓度在2000–0.195μM之间。
通过使用具有SoftMax Pro软件的SpectraMax Plus384微板读取器(Molecular Devices)以分光光度方式在486nm下在25℃下监测NCF的水解5分钟来测定在不同浓度的测试抑制剂存在下的酶活性。使用GraphPad Prism(GraphPad Software,Inc.)来进行数据分析。
相对于一级速率衰减等式(等式1)拟合进展曲线以确定k观察 (kobs)。
接着相对于等式2拟合kobs相对于抑制剂浓度[I]曲线以确定抑制剂解离常数(K)和在无穷大抑制剂浓度下的酶失活一级速率常数(kinact)。表IV显示代表性测试化合物的动力学结果。较大kinact/K比率指示酶失活剂更有效。
等式1
Yt=V0*(1-e(-kobs*t))/kobs]]>
其中Y是在时间t时的吸光度，V0是未抑制的酶速度，kobs是酶失活的观察速率常数。
等式2
kobs＝kinact*[1]/([1]+K(1+S/Km))
其中S是NCF浓度，Km是NCF的KPC-2Km