CD82/TIMP1在制备抑制人胰腺癌细胞迁移的药物中的应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 104338119 A (43)申请公布日 2015.02.11 CN 104338119 A (21)申请号 201410654257.9 (22)申请日 2014.11.18 A61K 38/17(2006.01) A61P 35/04(2006.01) (71)申请人 南京森沐生物科技有限公司 地址 211100 江苏省南京市江宁区科学园芝 兰路 18 号 5 号楼 208 室 (72)发明人 韩晓 张洁心 (74)专利代理机构 江苏圣典律师事务所 32237 代理人 邓丽 (54) 发明名称 CD82/ TIMP1 在制备抑制人胰腺癌细胞迁移 的药物中的应用 。

2、(57) 摘要 本发明公开 CD82/TIMP1 在制备抑制人胰腺 癌细胞迁移的药物中的应用， 属于生物工程技术 领域， CD82 与 TIMP1 直接结合， 引发 TIMP1 的胞 内运输、 循环， 阻断细胞骨架重塑， 减少层形足板 / 丝足突出形成， 抑制细胞活力、 迁移。TIMP1 通 过胰腺癌细胞膜上 CD82 增强 Akt 信号通路， 阻断 细胞骨架重塑， 减少层形足板 / 丝足突出形成， 抑制细胞活力、 迁移， 且对癌细胞生长无影响。对 TIMP1/CD82 轴作为抑制肿瘤转移新的信号通路 的深入阐释， 将有助于我们更加清晰地认识并理 解癌症转移的过程， 有助于寻找到癌症转移防治 。

3、的关键节点。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书3页 附图5页 (10)申请公布号 CN 104338119 A CN 104338119 A 1/1 页 2 1.CD82/ TIMP1 在制备抑制人胰腺癌细胞迁移的药物中的应用， 其特征在于， 由四次 跨膜蛋白超家族成员的细胞膜表面 CD82 分子与基质金属蛋白酶组织抑制因子的细胞外 TIMP1 分子直接结合， 引发 TIMP1 分子的胞内运输、 循环， 阻断细胞骨架重塑， 减少层形足板 / 丝足突出形成， 抑制细胞活力、。

4、 迁移。 2.根据权利要求1所述的一种CD82/ TIMP1在制备抑制人胰腺癌细胞迁移的药物中的 应用包括以下制备步骤 ： （1） 、 PANC-1 细胞培养于含有 10% 胎牛血清、 100U/ml 青霉素和 100U/ml 链霉素的 DMEM 培养液中 ； （2） 、 在低分化高迁移力PANC-1细胞的含5%血清的培养液中加入重组TIMP1， 浓度依次 为 50ng/ml， 100ng/ml， 200ng/ml， 进行体外伤痕愈合实验， 环巴胺 （10uM） 作为系统阳性参 照物 ； （3） 、 加入 CD82 干扰组， 并在 6 小时、 18 小时这两个时间点分别观察细胞迁移情况 ； （。

5、4） 、 在 PANC-1 细胞的含 5% 血清的培养液中加入重组 TIMP2， 浓度依次为 50ng/ml， 100ng/ml， 200ng/ml， 500ng/ml， 环巴胺 （10uM） 重复伤痕愈合实验 ； （5） 、 收集 TIMP1、 环巴胺刺激后细胞样品进行流式细胞术检测 ； （6） 、 使用荧光标记的鬼笔环肽对 F- 肌动蛋白进行标记， 以观察 PANC-1 细胞中肌丝分 布情况 ； （7） 、 对其中相关信号通路进行了探索。 权 利 要 求 书 CN 104338119 A 2 1/3 页 3 CD82/ TIMP1 在制备抑制人胰腺癌细胞迁移的药物中的应 用 0001 技术。

6、领域 0002 本发明属于生物工程技术领域， 具体是 CD82/ TIMP1 在制备抑制人胰腺癌细胞迁 移的药物中的应用。 背景技术 0003 癌细胞转移至今仍然是癌症死亡的主要原因。癌转移是个多步骤的过程， 其中第 一步是癌细胞由原发部位发生运动迁移， 之后进入血循环， 随血液到达全身远端部位后生 长和增殖， 最终形成转移灶。 对癌转移发生发展的过程包括其中相关分子机制的全面认识， 必将有利于研究者们开发出新型的癌症治疗药物和疗法。在过去的几十年中， 随着特异性 癌转移抑制基因被逐渐发现， 人们对癌转移过程有了越来越多的了解。 同时， 研究者们还观 察到此类抑制因子对原发灶内癌细胞的生长并没。

7、有显著的作用， 提示这类蛋白是直接或者 间接影响了癌细胞及其周围微环境。 0004 TIMP1 是基质金属蛋白酶组织抑制因子家族的代表之一， 这个家族一共有四个成 员。除个别 MT-MMPs 外， TIMP1 对所有的 MMPs 都有抑制效果， 与 ADAM-10 作用的 Kis 系数 小于 nM 级。有研究显示， TIMP1 在一些特定癌细胞中发生上调， 非 MMP 依赖性地促进癌细 胞生长和存活， 推动癌症发展。TIMP1 通过与未知受体结合， 激活下游 JAK（或 FAK） /PI3K/ Akt/Bad-BclXL（红细胞系、 骨髓来源细胞系、 上皮来源细胞系） 或 Ras/Raf1/F。

8、AK（骨肉瘤 细胞系） 信号通路。因此， TIMP1 对肿瘤发展的作用很可能是双重的 ： 一方面抑制 MMPs（如 MMP-9） 活性和阻碍新生血管形成， 另一方面又可以促进癌细胞生长和存活。 其中， proMMP9/ TIMP1 间平衡的失衡很可能是癌症发展的原因， 从这个环节中找到的关键分子将是预防和 治疗的潜在靶标。 0005 CD82 是糖蛋白 tetraspanin 超家族成员之一， 它的主要作用是抑制癌细胞活力和 发生侵袭， 促进癌细胞极化， 在刺激因子作用下引起癌细胞衰老和凋亡。 而上述这些都是通 过 CD82 对细胞膜性结构、 蛋白细胞内穿梭及相互作用的调控来实现的， 其中涉及。

9、到一些胞 内信号传导通路。CD82 从多个方面抑制癌细胞转移， 但它本身不具有酶活性。CD82 一方面 通过调控其结合蛋白在细胞中的运输， 另一方面直接影响细胞膜运动， 对多条信号通路进 行整合。目前， 多数研究都集中在体外各种癌细胞系中过表达 CD82 蛋白， 观察其对细胞活 力、 粘附力或衰老的改变。 发明内容 0006 本发明的目的在于克服现有技术缺陷， 提供 CD82/ TIMP1 在制备抑制人胰腺癌细 胞迁移的药物中的应用。 0007 本发明的目的可以通过以下技术方案实现 ： 说 明 书 CN 104338119 A 3 2/3 页 4 CD82/TIMP1 在制备抑制人胰腺癌细胞迁。

10、移的药物中的应用， 其特征在于， CD82 与 TIMP1 直接结合， 引发 TIMP1 的胞内运输、 循环， 阻断细胞骨架重塑， 减少层形足板 / 丝足突 出形成， 抑制细胞活力、 迁移。 0008 本发明的有益效果 ： TIMP1 通过胰腺癌细胞膜上 CD82 增强 Akt 信号通路， 阻断细 胞骨架重塑， 减少层形足板 / 丝足突出形成， 抑制细胞活力、 迁移， 且对癌细胞生长无影响。 对 TIMP1/CD82 轴作为抑制肿瘤转移新的信号通路的深入阐释， 将有助于我们更加清晰地 认识并理解癌症转移的过程， 有助于寻找到癌症转移防治的关键节点， 具有很好的实用性， 可以开发一种新的抑制癌细。

11、胞迁移的药物， 能够产生较好的经济效益和社会效益。 附图说明 0009 图 1-4 为放大 200 倍下体外伤痕愈合实验 ； 图 5 为流式细胞术 PI 染色法检测 PANC-1 细胞周期 ； 图 6 为放大 400 倍下绿色荧光鬼笔环肽标记 F-actin ； 图 7 为 Western blot 方法检测 PANC-1 细胞中 CD82 干扰前后， TIMP1 刺激 p-Akt473磷 酸化水平。 具体实施方式 0010 为了便于本领域技术人员理解， 下面结合附图对本发明作进一步的说明。 0011 人胰腺癌 PANC-1 细胞系购买自美国 ATCC 公司 ； 重组 TIMP1、 CD82-。

12、LEL 蛋白 购买自北京义翘神州生物技术有限公司 ； 环巴胺 （cyclopamine）购买自美国 Biomol International Lp 公司 ； FITC 标记鬼笔环肽购买自美国 Sigma 公司。 0012 1、 PANC-1 细胞培养于含有 10% 胎牛血清、 100U/ml 青霉素和 100U/ml 链霉素的 DMEM 培养液中。 0013 2、 在低分化高迁移力PANC-1细胞的含5%血清的培养液中加入重组TIMP1， 浓度依 次为 50ng/ml， 100ng/ml， 200ng/ml， 进行体外伤痕愈合实验， 环巴胺 （10uM） 作为系统阳性 参照物。 0014 3、。

13、 加入 CD82 干扰组， 并在 6 小时、 18 小时这两个时间点分别观察细胞迁移情况。 0015 4、 在 PANC-1 细胞的含 5% 血清的培养液中加入重组 TIMP2， 浓度依次为 50ng/ml， 100ng/ml， 200ng/ml， 500ng/ml， 环巴胺 （10uM） 重复伤痕愈合实验。 0016 5、 收集 TIMP1、 环巴胺刺激后细胞样品进行流式细胞术检测。 0017 6、 使用荧光标记的鬼笔环肽对 F- 肌动蛋白进行标记， 以观察 PANC-1 细胞中肌丝 分布情况。 0018 7、 对其中相关信号通路进行了初步探索。 0019 如图 1 所示， 尽管不如 cyc。

14、lopamine 明显， 100ng/ml 的 TIMP1 即有效地抑制了 PANC-1 细胞向中心迁移。100ng/ml 的 TIMP1 与 10uM 的 cyclopamine 早在 6 小时就表现出 明显的对 PANC-1 细胞迁移的抑制作用， 并且一直持续到实验结束如图 2、 3， 第一行。CD82 是癌细胞转移抑制因子， 将其干扰后， PANC-1 细胞迁移力得到恢复， 如图 2、 3， 第二行， 同时 也影响了 TIMP1 的功能， 如图 2、 3， 第三行。随着实验时间延长， c+si 组也出现了明显的细 胞迁移现象如图2、 3， 第四行。 加入重组TIMP2、 环巴胺重复伤痕愈。

15、合实验， 如图4， 结果显示 说 明 书 CN 104338119 A 4 3/3 页 5 TIMP2 不能抑制 PANC-1 细胞迁移。综合伤痕愈合实验和流式结果， TIMP1 可特异性地抑制 PANC-1 细胞迁移而不影响其生长。用荧光标记的鬼笔环肽对 F- 肌动蛋白进行标记， 观察 PANC-1 细胞中肌丝分布情况。结果显示， 未干扰 CD82 加入 TIMP1， 肌丝呈现细丝状不规则 结构如图 5， 第二列相较于第一列 ； 加入环巴胺呈现局限性点状， 第三列相较于第一列。干 扰CD82后， 肌丝排列成较粗的平行丝网状分布在整个细胞浆中， 如图6第四、 五、 六列， 并在 其末端有明显的。

16、密集突出结构， 第五列最显著。相关信号通路进行初步探索显示 CD82 干扰 后 PANC-1 细胞中 Akt473本底磷酸化水平较干扰前下降， TIMP1（100ng/ml） 刺激 Akt473磷酸 化时间依赖性上调也发生明显抑制， 如图 7。 0020 以上结果表明， PANC-1细胞膜表面的CD82分子参与了TIMP1、 环巴胺的抑癌功能， 并在两者介导的信号通路上处于极其关键的位置。 0021 TIMP1/CD82 复合体内化后在细胞中的特殊亚细胞定位与功能相关。CD82 可特异 性地聚集在层形足板 / 丝足突出边缘， 而 TIMP1/CD82 协同抑制 PANC-1 细胞迁移的作用早 。

17、在 6 小时就已经非常明显， 两者共同增强 Akt 信号通路， 影响肌丝重组， 减少层形足板 / 丝 足突出形成， 减弱细胞活力进而抑制迁移， 同时对 PANC-1 细胞生长无影响， 如图 6。伤痕愈 合实验结果还提示， CD82 在胰腺导管癌中的抑制作用同时涵盖了 EGF 和 Hedgehog 信号通 路。 0022 以上内容仅仅是对本发明所作的举例和说明， 所属本技术领域的技术人员对所描 述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代， 只要不偏离发明或者超 越本权利要求书所定义的范围， 均应属于本发明的保护范围。 说 明 书 CN 104338119 A 5 1/5 页 6 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 104338119 A 6 2/5 页 7 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 104338119 A 7 3/5 页 8 图 5 说 明 书 附 图 CN 104338119 A 8 4/5 页 9 图 6 说 明 书 附 图 CN 104338119 A 9 5/5 页 10 图 7 说 明 书 附 图 CN 104338119 A 10 。