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1、(10)申请公布号 CN 104255487 A (43)申请公布日 2015.01.07 CN 104255487 A (21)申请号 201410463359.2 (22)申请日 2014.09.12 A01H 4/00(2006.01) (71)申请人 南京通泽农业科技有限公司 地址 210046 江苏省南京市栖霞区尧化街道 甘家边 108 号 1 幢 701 室 (72)发明人 杨存 (54) 发明名称 一种珍珠莲悬浮细胞的快速繁殖方法 (57) 摘要 本发明研究了一种珍珠莲悬浮细胞培养的快 速繁殖方法， 包括愈伤组织的诱导、 愈伤组织的增 殖、 悬浮细胞的培养、 细胞悬浮体系的优化等。
2、步 骤。本发明方法所制备的珍珠莲悬浮细胞生长周 期短， 次生代谢物产量高， 增殖率高， 有利于获得 大规模的珍珠莲悬浮细胞以及药用次生代谢物 质。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书2页 (10)申请公布号 CN 104255487 A CN 104255487 A 1/1 页 2 1. 一种珍珠莲悬浮细胞的快速繁殖方法， 其特征是 ： 珍珠莲的叶片经消毒处理， 接种 在 N6+6-BA2.5mg/L+IBA0.5mg/L+NAA0.25mg/L+ 多胺 10mmol/L 培养基上进行愈。
3、伤组织诱导 培养， 将诱导出来的愈伤组织接入培养基 N6+6-BA4.0mg/L+2， 4-D6.0mg/L+NAA0.5mg/L+ 柠 檬酸 12-15mg/L 中进行愈伤组织增殖培养， 增殖培养两代后挑选均一稳定的愈伤组织接入 MS+KT2.0mg/L+TDZ2.0mg/L+2,4-D2.0mg/L+5- 磺基水杨酸 0.5%-3% 的液体培养基中进行悬 浮细胞培养， 洗涤， 干燥。 2. 根据权利要求 1 所述的一种珍珠莲悬浮细胞的快速繁殖方法， 其特征是 ： 所述的消 毒处理为 ： 选用珍珠莲幼嫩的叶片， 用肥皂水刷洗 5 分钟， 自来水冲洗 15 分钟， 在超净工作 台上用 2的次氯。
4、酸钠消毒 8 分钟， 无菌水冲洗 7 次。 3. 根据权利要求 1 所述的一种珍珠莲悬浮细胞的快速繁殖方法， 其特征是 ： 诱导愈伤 组织的培养基中附加了多胺， 可以提高诱导成活率。 4. 根据权利要求 1 所述的一种珍珠莲悬浮细胞的快速繁殖方法， 其特征是 ： 诱导愈伤 组织的条件为暗光照， 温度 24， 湿度 75%。 5. 根据权利要求 1 所述的一种珍珠莲悬浮细胞的快速繁殖方法， 其特征是 ： 珍珠莲愈 伤组织增殖培养中添加了柠檬酸， 具有抗氧化作用， 可以防止褐化现象的出现。 6. 根据权利要求 1 所述的一种珍珠莲悬浮细胞的快速繁殖方法， 其特征是 ： 珍珠莲悬 浮细胞培养中添加了。
5、 5- 磺基水杨酸， 对悬浮细胞的生长和内含物含量的调控具有显著的 作用。 7. 根据权利要求 1 所述的一种珍珠莲悬浮细胞的快速繁殖方法， 其特征是 ： 愈伤组织 的增殖和悬浮细胞的培养条件为光照强度 5000lx， 光照 16h/d， 温度 24， 湿度 85%。 权 利 要 求 书 CN 104255487 A 2 1/2 页 3 一种珍珠莲悬浮细胞的快速繁殖方法 技术领域 0001 本发明涉及组培条件下珍珠莲悬浮细胞的培养， 属于生物技术领域。 背景技术 0002 珍珠莲，Ficus sarmentosa var. henryi， 桑科， 木质攀援匍匐藤状灌木， 又名凉 粉树、 冰粉树。
6、、 岩石榴、 幼枝密被褐色长柔毛， 叶革质， 卵状椭圆形， 长 8-10 厘米， 宽 3-4 厘 米， 先端渐尖， 基部圆形至楔形， 表面无毛， 背面密被褐色柔毛或长柔毛， 基生侧脉延长， 侧 脉 5-7 对， 小脉网结成蜂窝状 ； 叶柄长 5-10 毫米， 被毛。产台湾、 浙江、 江西、 福建、 广西、 广 东、 湖南、 湖北、 贵州、 云南、 四川、 陕西、 甘肃。常生于阔叶林下或灌木丛中。本变种在我国 分布广， 各地常见。清热解毒， 消炎止泻。治小儿高热， 惊风， 肺炎， 膀胱炎， 百日咳， 脚气病， 肠炎， 痢疾。 发明内容 0003 本发明所要解决的技术问题是提供珍珠莲悬浮细胞培养的。
7、快速繁殖方法， 生长周 期短， 次生代谢物产量高， 增殖率高， 有利于获得大规模的珍珠莲悬浮细胞以及药用次生代 谢物质。 0004 为解决上述技术问题， 本发明采用下列技术方案 ： 选用珍珠莲幼嫩的叶片， 用肥皂水刷洗 5 分钟， 自来水冲洗 15 分钟， 在超净工作台 上用 2的次氯酸钠消毒 8 分钟， 无菌水冲洗 7 次， 接种在 N6+6-BA2.5mg/L+IBA0.5mg/ L+NAA0.25mg/L+ 多胺 10mmol/L 培养基上进行愈伤组织诱导培养， 条件为暗光照， 温 度 24， 湿度 75%， 将诱导出来的愈伤组织接入培养基 N6+6-BA4.0mg/L+2， 4-D6.。
8、0mg/ L+NAA0.5mg/L+ 柠檬酸 12-15mg/L 中进行愈伤组织增殖培养， 增殖培养两代后挑选均一稳 定的愈伤组织接入MS+KT2.0mg/L+TDZ2.0mg/L+2,4-D2.0mg/L+5-磺基水杨酸0.5%-3%的液 体培养基中进行悬浮细胞培养， 培养条件为光照强度 5000lx， 光照 16h/d， 温度 24， 湿度 85%， 洗涤， 干燥。 0005 采用本发明制备的珍珠莲悬浮细胞， 产量大， 能耗少， 生长周期短， 次生代谢物产 量高。 0006 下面将结合具体实施方式对本发明作进一步阐述， 但本发明要求保护的范围并不 局限于下列实施方式。 具体实施方式 000。
9、7 实施例 1 选用珍珠莲幼嫩的叶片， 用肥皂水刷洗 5 分钟， 自来水冲洗 15 分钟， 在超净工作台 上用 2的次氯酸钠消毒 8 分钟， 无菌水冲洗 7 次， 接种在 N6+6-BA2.5mg/L+IBA0.5mg/ L+NAA0.25mg/L+ 多胺 10mmol/L 培养基上进行愈伤组织诱导培养， 条件为暗光照， 温 度 24， 湿度 75%， 将诱导出来的愈伤组织接入培养基 N6+6-BA4.0mg/L+2， 4-D6.0mg/ 说 明 书 CN 104255487 A 3 2/2 页 4 L+NAA0.5mg/L+ 柠檬酸 12mg/L 中进行愈伤组织增殖培养， 增殖培养两代后挑选。
10、均一稳定的 愈伤组织接入 MS+KT2.0mg/L+TDZ2.0mg/L+2,4-D2.0mg/L+5- 磺基水杨酸 0.5% 的液体培养 基中进行悬浮细胞培养， 培养条件为光照强度 5000lx， 光照 16h/d， 温度 24， 湿度 85%， 洗 涤， 干燥， 悬浮细胞增长率 59%。 0008 实施例 2 选用珍珠莲幼嫩的叶片， 用肥皂水刷洗 5 分钟， 自来水冲洗 15 分钟， 在超净工作台 上用 2的次氯酸钠消毒 8 分钟， 无菌水冲洗 7 次， 接种在 N6+6-BA2.5mg/L+IBA0.5mg/ L+NAA0.25mg/L+ 多胺 10mmol/L 培养基上进行愈伤组织诱导。
11、培养， 条件为暗光照， 温 度 24， 湿度 75%， 将诱导出来的愈伤组织接入培养基 N6+6-BA4.0mg/L+2， 4-D6.0mg/ L+NAA0.5mg/L+ 柠檬酸 13mg/L 中进行愈伤组织增殖培养， 增殖培养两代后挑选均一稳定的 愈伤组织接入 MS+KT2.0mg/L+TDZ2.0mg/L+2,4-D2.0mg/L+5- 磺基水杨酸 1% 的液体培养基 中进行悬浮细胞培养， 培养条件为光照强度5000lx， 光照16h/d， 温度24， 湿度85%， 洗涤， 干燥， 悬浮细胞增长率 55%。 0009 实施例 3 选用珍珠莲幼嫩的叶片， 用肥皂水刷洗 5 分钟， 自来水冲洗。
12、 15 分钟， 在超净工作台 上用 2的次氯酸钠消毒 8 分钟， 无菌水冲洗 7 次， 接种在 N6+6-BA2.5mg/L+IBA0.5mg/ L+NAA0.25mg/L+ 多胺 10mmol/L 培养基上进行愈伤组织诱导培养， 条件为暗光照， 温 度 24， 湿度 75%， 将诱导出来的愈伤组织接入培养基 N6+6-BA4.0mg/L+2， 4-D6.0mg/ L+NAA0.5mg/L+ 柠檬酸 15mg/L 中进行愈伤组织增殖培养， 增殖培养两代后挑选均一稳定的 愈伤组织接入 MS+KT2.0mg/L+TDZ2.0mg/L+2,4-D2.0mg/L+5- 磺基水杨酸 3% 的液体培养基 中进行悬浮细胞培养， 培养条件为光照强度5000lx， 光照16h/d， 温度24， 湿度85%， 洗涤， 干燥， 悬浮细胞增长率 54%。 说 明 书 CN 104255487 A 4 。