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1、(10)申请公布号 CN 103304632 A (43)申请公布日 2013.09.18 CN 103304632 A *CN103304632A* (21)申请号 201310153902.4 (22)申请日 2013.04.28 C07K 7/06(2006.01) A61K 38/08(2006.01) A61P 35/02(2006.01) (71)申请人 苏州谷力生物科技有限公司 地址 215213 江苏省苏州市吴江区汾湖经济 区金字路西侧 (72)发明人 吴娟 (74)专利代理机构 南京经纬专利商标代理有限 公司 32200 代理人 李纪昌 (54) 发明名称 一种微管蛋白聚合剂。
2、多肽 2 及其应用 (57) 摘要 本发明涉及药物领域， 具体涉及具有促进微 管蛋白聚合， 治疗急性淋巴细胞性白血病的多肽。 其序列为 RQASSIYDDS 是全新的序列， 它们可以在 1 微摩尔水平上体外促进微管蛋白聚合， 并在体 内试验中提高荷瘤小鼠生存率， 具有潜在的新药 开发价值。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 序列表 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书3页 序列表1页 (10)申请公布号 CN 103304632 A CN 103304632 A *CN103304632A* 1/1 页 2 1. 。
3、微管蛋白聚合剂多肽 2， 其特征在于其序列为 RQASSIYDDS。 2. 微管蛋白聚合剂多肽 2 在制备、 治疗急性淋巴细胞性白血病药物中的应用。 权 利 要 求 书 CN 103304632 A 2 1/3 页 3 一种微管蛋白聚合剂多肽 2 及其应用 技术领域 0001 本发明涉及微管蛋白聚合剂多肽 2 及其应用， 具体涉及具有促进微管蛋白聚合、 治疗急性淋巴细胞性白血病的多肽。 背景技术 0002 急性淋巴细胞性白血病 （ALL） 是一种进行性恶性疾病， 其特征为大量的类似于淋 巴母细胞的未成熟白细胞。这些细胞可在血液、 骨髓、 淋巴结、 脾脏和其它器官中发现。急 性淋巴细胞性白血病占。
4、儿童急性白血病的 80%， 发病率高峰在 3 岁至 7 岁之间。ALL 也可发 生于成年人， 占所有成年人白血病的 20%。近年来随着医学研究的深入， 对急性淋巴细胞性 白血病的认识和治疗取得了很大进展。其中， 微管蛋白在急性淋巴细胞性白血病中扮演着 重要角色。 0003 微管是细胞骨架的主要组成部分， 由-微管蛋白和-微管蛋白异二聚体组成， 具有中空管状结构的特点。此外， 还有一种微管蛋白， 它不是微管的组成成分， 但参与微 管的组装。微管具有聚合和解聚的动力学特性， 在维持细胞形态、 细胞分裂、 信号转导及物 质输送等过程中起着重要作用。微管在细胞分裂前期聚合成为纺锤体， 而纺锤体在有丝分。
5、 裂中牵引染色体向两极移动进入两个子细胞中， 完成细胞增殖。微管的组装过程是 - 和 -微管蛋白异性二聚体之间紧密的非共价相互作用， 这一过程是受GTP水解驱动的。 异性 二聚体不断地在微管的正极生长， 在负极收缩， 并且维持动态稳定。 当微管的动态稳定性被 破坏时， 细胞的有丝分裂过程就有可能被阻止， 从而导致细胞死亡。 由于微管在细胞分裂中 具有极其重要的作用， 现已成为抗肿瘤药物研究的重要靶点之一。 0004 微管蛋白抑制剂有两种分类方法。一种是根据作用机制的不同分为两种类型 ： 抑制微管蛋白聚合的微管蛋白解聚剂 ； 促进微管蛋白聚合的微管蛋白聚合剂。 0005 促进微管蛋白聚合的微管蛋。
6、白聚合剂有紫杉醇等化合物， 多用于肿瘤治疗。这类 化合物其特点是作用于微管的长春碱位点的微管蛋白解聚剂。研究表明， 紫杉醇与细胞接 触后会诱发 DNA 断裂， 引起细胞凋亡。此外， 它还能诱导细胞中肿瘤坏死因子(TNF-) 基因的表达， 提高蛋白质， 包括 MAP 激酶和 Raf-1 激酶的酪氨酸残基的磷酸化水平。 1992 年 12 月， 美国 FDA 批准了紫杉醇用于乳腺癌和卵巢癌的治疗。紫杉醇有 3 个重要 的因素限制了它在临床上的应用 ：（1） 紫杉醇在数种红豆杉属植物中含量很低， 使来源受 到限制 ；（2） 水溶性相对较低， 吸收能力差 ；（3） 用紫杉醇处理过的癌细胞会过量表达 P。
7、- 糖 蛋白， 具有多向抗药性。 0006 因此， 需要开发水溶性好， 副作用小的微管蛋白聚合剂用于治疗急性淋巴细胞白 血病。微管蛋白聚合剂包括大分子和小分子。 大分子聚合剂的制备和使用限制了它们的 发展， 例如重组人微管蛋白促进因子的体内半衰期只有 4 分钟。很多成功的小分子聚合剂， 可以在纳摩尔水平上促进微管蛋白的活力， 但小分子聚合剂缺乏特异性， 如果在慢性疾病 中长期使用缺乏特异性的微管蛋白聚合剂可产生较大副作用。 因而， 从微管蛋白聚合剂的 应用角度来看， 以急性淋巴细胞白血病作为研究对象是正确的选择。 在急性反应期， 机体能 说 明 书 CN 103304632 A 3 2/3 页。
8、 4 够耐受短期的、 微管蛋白广谱聚合剂对正常生理功能的抑制， 同时使关键组织器官的生理 结构免受破坏， 增加了生存几率。 0007 本专利中的微管蛋白聚合剂多肽 2 已证明在急性淋巴细胞白血病中有效， 具有在 其他肿瘤模型中开发的前景。 发明内容 0008 发明目的 本发明提供全新的序列， 该序列微管蛋白聚合剂， 对急性淋巴细胞白血病具有很好的 疗效。 0009 技术方案 微管蛋白聚合剂多肽 2， 其特征在于其序列为 RQASSIYDDS。 0010 微管蛋白聚合剂多肽 2 在制备治疗急性淋巴细胞白血病药物中的应用。 0011 有益效果 利用固相合成法化学合成微管蛋白聚合剂多肽 2， 该多肽。
9、具有全新的序列， 该多肽可体 外促进微管蛋白， 治疗急性淋巴细胞白血病。在内毒素休克模型实验中成功的增加了小鼠 的生存率。我们发现的微管蛋白聚合剂多肽 2 可以同时促进微管蛋白聚合活力， 并在体内 试验中提高荷瘤小鼠生存率， 具有潜在的新药开发价值。 具体实施方式 0012 实施例 1 微管蛋白聚合剂多肽 2 对体外微管蛋白聚合与解聚的作用。 0013 取新鲜牛脑组织， 剥去脑膜和大的血管， 剪碎， 用冷 MES 缓冲液洗涤 1-2 次， 以每克脑组织 0.5-1ml 的比例加入 MES 缓冲液， 在 4下， 用电动匀浆器匀浆 ； 4， 105000g 离心 1h， 取上清， 加入等体积的微管。
10、聚合缓冲液， 37水浴保温 30min。26， 105000g 离心 1h， 取沉淀， 加入约 1/10 匀浆体积的冷 MES 缓冲液， 轻轻搅拌或用匀浆器 将沉淀碾碎 ； 将悬液放冰浴 30min， 使沉淀完全溶解。用 Lowry s 法测定蛋白含量 （SDS 聚酰胺凝胶电泳法） 。微管蛋白用 MES 缓冲液稀释至 4-5mg/ml， 置液氮中保存。取冷冻 的微管蛋白溶液， 快速用常温水冲其壁， 使之融化， 放入冰浴， 用 MES 缓冲液稀释至所需浓 度 （2-3mg/ml） ， 加入 ATP 至 1mmol/l。以从冰浴中马上取出的微管蛋白溶液在分光光度 计 350nm 处调定为 “0” 。
11、点。然后将比色杯在 37温度下测定微管蛋白溶液的 OD 值， 连续 20-30min， 记录温度 - 吸光值曲线 （T-OD 曲线） ， 重复三次。 0014 抑制率计算 ： 抑制率 （%） =（对照管 “OD” 值加药管 “OD” 值） 对照管 “OD” 实验组设五个剂量 ： 0.75M、 1.5M、 3M、 12M、 24M， 阳性对照组紫杉醇剂量 3M， 空白组加入等体积的溶剂 DMSO ； 按上述操作测定吸光值。 结果， 随微管蛋白聚合剂多 肽 2 浓度增加， 聚合抑制率逐渐升高， 说明有聚合能力的微管蛋白随药物浓度的增加而不 断增强。 0015 实施例 2 微管蛋白聚合剂多肽 2 对。
12、体外培养肿瘤细胞的生长和存活 IC50。 0016 采用 MTT 比色法。将对数生长的 U937 细胞， 以 1.0105 加入 96 孔培养板中， 说 明 书 CN 103304632 A 4 3/3 页 5 培养 24h， 实验孔、 阳性药物对照孔分别加入不同浓度的实验药物微管蛋白聚合剂多肽 2 和阳性对照药物紫杉醇 ； 空白组加入相同体积的溶剂。每孔设五个复孔， 培养 48h， 分别在 0h、 2h、 8h、 14h、 20h、 24h、 36h、 ， 48h 每孔加入 MTT， 作用 4h 后， 加入 DMSO， 孵育 30min， 在 酶标仪 620nm 处测定吸光度 A 值， 按公。
13、式肿瘤细胞生长抑制率 （1- 实验组吸光值 / 对 照组吸光值） 100。计算出实验药物的 IC50 为 4.34M。 0017 实施例 3 用肿瘤模型检测微管蛋白聚合剂多肽 2 的体内活力。 0018 建立 U937 肿瘤模型， 阳性对照药物紫杉醇 ； 空白组加入相同体积的溶剂， 实验 组设 3 个剂量 ： 0.75、 1.5M、 3M mg/Kg。21 天后， 观察小鼠存活数量， 计算存活率。结 果显示， 微管蛋白聚合剂多肽 2 可有效地保护小白鼠， 提高荷瘤小鼠的生存率， 生存率达到 74.9%。 说 明 书 CN 103304632 A 5 1/1 页 6 序列表 SEQUENCE LISTING 一种微管蛋白聚合剂多肽 2 及其应用 1 PatentIn version 3.3 1 18 PRT 人工序列 1 Arg Gln Ala Ser Ser Ile Tyr Asp Asp Ser 1 5 序 列 表 CN 103304632 A 6 。