一种基于恒温级联核酸扩增的铅离子检测试剂盒及其检测方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103305612 A (43)申请公布日 2013.09.18 CN 103305612 A *CN103305612A* (21)申请号 201310218918.9 (22)申请日 2013.06.04 C12Q 1/68(2006.01) C12Q 1/34(2006.01) (71)申请人西安交通大学地址 710049 陕西省西安市咸宁西路 28 号申请人中国烟草总公司陕西省公司 (72)发明人赵永席张青袁慧王芳霞董绘阳白凯 (74)专利代理机构西安通大专利代理有限责任公司 61200 代理人汪人和 (54) 发明名称一种基于恒温。

2、级联核酸扩增的铅离子检测试剂盒及其检测方法 (57) 摘要本发明公开了一种基于恒温级联核酸扩增的铅离子检测试剂盒及其检测方法，通过脱氧核酶识别铅离子，并结合链置换扩增与单链触发的 DNA 分子机器实现恒温级联核酸扩增，将铅离子浓度转化为显著放大的荧光检测信号，从而精确测定微量铅离子浓度。本发明相对于基于脱氧核酶的其他方法相比更加快速，灵敏度更高；且对设备的要求更低，操作更加简单。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页说明书 5 页序列表 2 页附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书2页说明书5页序列表。

3、2页附图1页 (10)申请公布号 CN 103305612 A CN 103305612 A *CN103305612A* 1/2 页 2 1. 一种基于恒温级联核酸扩增的铅离子检测试剂盒，其特征在于，包括：脱氧核酶 - 底物连接体，包括通过连接序列连接的脱氧核酶和底物，在铅离子催化下脱氧核酶的底物断裂，产生可作为链置换扩增引物的寡聚脱氧核苷酸链；扩增底物，包括 dNTPs 混合物； DNA 分子机器工具，包括具有链置换扩增活性的 DNA 聚合酶和核酸切口酶；触发 DNA 分子机器工具的 SDA 模板，与脱氧核酶产生的寡聚核苷酸链杂交后被 DNA 聚合酶所扩。

4、增；具有发卡结构的发卡分子 H，能够与 SDA 模板产物相识别，在识别后杂交打开发卡结构；具有茎环结构的分子信标探针，其两端分别标记有荧光基团和猝灭基团，分子信标探针具有能够与被打开的发卡分子 H 相互补的序列；以及 DNA 分子机器扩增反应缓冲液。 2. 如权利要求 1 所述的基于恒温级联核酸扩增的铅离子检测试剂盒，其特征在于，铅离子检测试剂盒，包括 10mM Tris-HCl,50mM NaCl,10mM MgCl2,1mM dithiothreitol， 20nM 脱氧核酸， 10nM SDA 模板， 50nM 发卡分子 H， 250nM 分子信标， 2.。

5、5U Klenow fragment 聚合酶， 4U Nt.BbvCI 核酸切口酶，以及 0.2mM dNTPs。 3.如权利要求1或2所述的基于恒温级联核酸扩增的铅离子检测试剂盒，其特征在于，所述的脱氧核酶 - 底物连接体中，底物部分包括一个核糖核苷酸和能够与 SDA 模板相识别的寡聚脱氧核苷酸链；所述的 SDA 模板包括识别寡聚脱氧核苷酸链的序列、核酸切口酶识别位点和扩增与发卡分子 H 相识别产物的序列；所述的发卡分子 H 包括与 SDA 模板产物相识别的序列、核酸切口酶识别位点的双链中不被切割的序列和与分子信标相识别的序列；发卡分子 H 的 5 端突出有多。

6、个碱基序列， 3 端修饰有磷酸基团；所述的分子信标包括 Nt.BbvCI 酶的识别位点为 5 -CCTCAGC-3 ；所述的 DNA 分子机器工具由 KF 聚合酶和 Nt.BbvCI 核酸切口酶组成。 4.如权利要求1或2所述的基于恒温级联核酸扩增的铅离子检测试剂盒，其特征在于，所述的 SDA 模板的核苷酸序列如 SEQ.ID.NO.2 所示；发卡分子 H 的核苷酸序列如 SEQ.ID.NO.3 所示；分子信标探针的核苷酸序列如 SEQ.ID.NO.4 所示，其两端分别标记有荧光基团 FAM 和淬灭基团 DABCYL。 5. 一种基于恒温级联核酸扩增的铅离子检测方法，其。

7、特征在于，包括以下步骤： 1）将待检测的溶液超滤去除悬浮颗粒； 2）将待检测的溶液与脱氧核酶 - 底物连接体、扩增底物、 DNA 分子机器工具、具有发卡结构的发卡分子 H、分子信标探针以及 DNA 分子机器扩增反应缓冲液混合； 3）脱氧核酶在铅离子存在的情况下，脱氧核酶 - 底物连接体断裂，产生链置换扩增的寡聚核苷酸链，该寡聚核苷酸链与 SDA 模板杂交，寡聚核苷酸链 3端在 DNA 聚合酶的作用下进行扩增，待扩增至一定长度后，扩增产物中的核酸切口酶识别位点被识别并在扩增链的相应位点发生切割，产生 SDA 产物，而寡聚核苷酸链与 SDA 模板的杂交物。

8、继续进行扩增；权利要求书 CN 103305612 A 2 2/2 页 3 4）扩增所获得的 SDA 产物触发打开发卡分子 H 构成杂交体，发卡结构 H 被打开后，暴露出的与分子信标互补的区域，从而破坏分子信标的茎环结构，分子信标与杂交体构成双链结构，其荧光恢复；而分子信标参与形成的双链互补结构中还含有核酸切口酶识别位点，在形成双链结构后该位点被识别，并在分子信标序列上进行切割；被切割的分子信标从双链结构上脱落产生荧光信号，而SDA产物与发卡分子H构成的杂交体再打开新的分子信标，以产生更多的荧光信号； 5）待达到规定的反应时间后，检测荧光。

9、信号，对荧光信号分析得到待测溶液中铅离子的含量，在一定范围内，铅离子浓度越高，则荧光信号越强。 6. 如权利要求 5 所述的基于恒温级联核酸扩增的铅离子检测方法，其特征在于，脱氧核酶底物断裂点 3 端的序列与 SDA 模板 5 端的 DNA 序列完全互补。 7.如权利要求5所述的基于恒温级联核酸扩增的铅离子检测方法，其特征在于， SDA产物与发卡结构有 18 个 bp 的互补序列，可以在 37相互杂交从而打开发卡结构。 8. 如权利要求 5 所述的基于恒温级联核酸扩增的铅离子检测方法，其特征在于，链置换扩增模板中含有 Nt.BbvCI 识别双链中不被切割的单链序列。

10、3 -GGAGTCG-5 ；为了防止发卡自身 3 端的非特异性扩增影响单链触发的效率，发卡分子 H 的 3 端修饰有磷酸基团。 9. 如权利要求 5 所述的基于恒温级联核酸扩增的铅离子检测方法，其特征在于，发卡分子 H 的序列含有 Nt.BbvCI 识别双链中不被切割的单链序列 3 -GGAGTCG-5 ，发卡分子 H 没有被打开时，发卡分子 H 和分子信标均是茎环结构不发生作用；当发卡被打开后有 12 个 nt 与分子信标互补形成双链并且被 Nt.BbvCI 识别切断，切断的两段分子信标均不能够在 37下和发卡分子 H 形成稳定的双链结构而和发卡分子 H 分开，被打开。

11、的发卡分子 H 能够循环的打开多个分子信标，使荧光信号放大。 10. 如权利要求 5 所述的基于恒温级联核酸扩增的铅离子检测方法，其特征在于，检测中的反应温度为 37，反应时间为 45 分钟。权利要求书 CN 103305612 A 3 1/5 页 4 一种基于恒温级联核酸扩增的铅离子检测试剂盒及其检测方法技术领域 0001 本发明属于铅离子的检测技术领域，涉及一种基于恒温级联核酸扩增的铅离子检测试剂盒及其检测方法。背景技术 0002 铅离子是一种常见的高毒性污染物，会对水生生态系统中的植物和动物产生不良影响。铅污染的主要来源可能是汽油和铅基油漆。对于人。

12、类来说，铅离子会带来许多健康问题，如贫血，肾功能故障和肌肉麻痹。即使在低浓度下，铅中毒也会是对儿童大脑和中枢神经系统产生严重的损害。因此发展一种超灵敏和高选择性的铅离子检测方法对临床检测，工业和环境监测都是非常重要。 0003 传统的检测铅离子等重金属的主要方法是色谱法、原子吸收 / 发射光谱法、电感耦合等离子体质谱法等，但是这些方法存在很多弊端，比如依赖大型仪器设备，样品预处理过程复杂，需要专业人员操作，以及检测成本较高。近年来，基于脱氧核酶（DNAzyme）的新型铅离子传感检测方法得到了发展，如电化学法，比色法和荧光法。然而比色法虽然结果肉眼。

13、可见但是灵敏度不够高，并且纳米金的合成与准备过程也较为繁琐。而电化学法的灵敏度高但是操作复杂，时间较长，需要配备价格较为昂贵的电化学相关仪器，同时，核酶相关的荧光法由于没有进行放大虽然更加快速和简便，但是比较难以获得令人满意的灵敏度和检测范围。 0004 基于链置换扩增（Strand displacement amplification， SDA）的 DNA 分子机器（DNA-machine）技术利用具有链置换活性的 DNA 聚合酶的延伸反应与核酸切口酶（nicking enzyme）识别并切割特定双链中单链的性质，能够在恒温条件下迅速扩增出多条寡核苷酸单链。。

14、相比于传统扩增技术如 PCR， SDA 不仅具有较高的扩增效率，而且不需要精确地热循环设备，只需要简易的恒温装置即可。此外，具有链置换活性的 DNA 聚合酶如 KF 聚合酶（Klenow fragment polymerase， KF polymerase）等相对于 Taq DNA 聚合酶受复杂体系影响较小。因此近年来，这类 DNA 分子机器受到国内外研究学者的广泛关注，被越来越多地用于 DNA,microRNA, 以及其它生物活性分子的检测信号的放大。发明内容 0005 本发明解决的问题在于提供一种基于恒温级联核酸扩增的铅离子检测试剂盒及其检测方法，通过基于 DNA。

15、分子机器的恒温级联核酸扩增方法进行铅离子含量的检测，灵敏度高同时操作简便，成本较低。 0006 本发明是通过以下技术方案来实现： 0007 一种基于恒温级联核酸扩增的铅离子检测试剂盒，包括： 0008 脱氧核酶 - 底物连接体，包括通过连接序列连接的脱氧核酶和底物，在铅离子催化下脱氧核酶的底物断裂，产生可作为链置换扩增引物的寡聚脱氧核苷酸链；说明书 CN 103305612 A 4 2/5 页 5 0009 扩增底物，包括 dNTPs 混合物； 0010 DNA 分子机器工具，包括具有链置换扩增活性的 DNA 聚合酶和核酸切口酶； 0011 触发DNA分子。

16、机器工具的SDA模板，与脱氧核酶产生的寡聚核苷酸链杂交后被DNA 聚合酶所扩增； 0012 具有发卡结构的发卡分子 H，能够与 SDA 模板产物相识别，在识别后杂交打开发卡结构； 0013 具有茎环结构的分子信标探针，其两端分别标记有荧光基团和猝灭基团，分子信标探针具有能够与被打开的发卡分子 H 相互补的序列； 0014 以及 DNA 分子机器扩增反应缓冲液。 0015 所述的铅离子检测试剂盒，包括 10mM Tris-HCl,50mM NaCl,10mM MgCl2,1mM dithiothreitol， 20nM 脱氧核酸， 10nM SDA 模板， 50nM 发卡分。

17、子 H， 250nM 分子信标， 2.5U Klenow fragment 聚合酶， 4U Nt.BbvCI 核酸切口酶，以及 0.2mM dNTPs。 0016 所述的脱氧核酶 - 底物连接体中，底物部分包括一个核糖核苷酸和能够与 SDA 模板相识别的寡聚脱氧核苷酸链； 0017 所述的 SDA 模板包括识别寡聚脱氧核苷酸链的序列、核酸切口酶识别位点和扩增与发卡分子 H 相识别产物的序列； 0018 所述的发卡分子 H 包括与 SDA 模板产物相识别的序列、核酸切口酶识别位点的双链中不被发生切割的序列和与分子信标相识别的序列；发卡分子 H 的 5 端突出有多个碱基序列。

18、， 3 端修饰有磷酸基团； 0019 所述的分子信标包括 Nt.BbvCI 酶的识别位点为 5 -CCTCAGC-3 ； 0020 所述的 DNA 分子机器工具由 KF 聚合酶和 Nt.BbvCI 核酸切口酶组成。 0021 所述的 SDA 模板的核苷酸序列如 SEQ.ID.NO.2 所示； 0022 发卡分子 H 的核苷酸序列如 SEQ.ID.NO.3 所示； 0023 分子信标探针的核苷酸序列如 SEQ.ID.NO.4 所示，其两端分别标记有荧光基团 FAM 和淬灭基团 DABCYL。 0024 一种基于恒温级联核酸扩增的铅离子检测方法，包括以下步骤： 0025 1）将待检测。

19、的溶液超滤去除悬浮颗粒； 0026 2）将待检测的溶液与脱氧核酶 - 底物连接体、扩增底物、 DNA 分子机器工具、具有发卡结构的发卡分子 H、分子信标探针以及 DNA 分子机器扩增反应缓冲液混合； 0027 3）脱氧核酶在铅离子存在的情况下，脱氧核酶 - 底物连接体断裂，产生链置换扩增的寡聚核苷酸链，该寡聚核苷酸链与 SDA 模板杂交，寡聚核苷酸链 3端在 DNA 聚合酶的作用下进行扩增，待扩增至一定长度后，扩增产物中的核酸切口酶识别位点被识别并在扩增链的相应位点发生切割，产生SDA产物，而寡聚核苷酸链与SDA模板的杂交物继续进行扩增； 0028 4。

20、）扩增所获得的 SDA 产物触发打开发卡分子 H 构成杂交体，发卡结构 H 被打开后，暴露出的与分子信标互补的区域，从而破坏分子信标的茎环结构，分子信标与杂交体构成双链结构，其荧光恢复；而分子信标参与形成的双链互补结构中还含有核酸切口酶识别位点，在形成双链结构后该位点被识别，并在分子信标序列上进行切割；被切割的分子信标从双链结构上脱落产生荧光信号，而 SDA 产物与发卡分子 H 构成的杂交体再打开新的分子信说明书 CN 103305612 A 5 3/5 页 6 标，以产生更多的荧光信号； 0029 5）待达到规定的反应时间后，检测荧光信号，对荧。

21、光信号分析得到待测溶液中铅离子的含量，在一定范围内，铅离子浓度越高，则荧光信号越强。 0030 所述的脱氧核酶底物断裂点 3 端的序列（即 SDA 过程的引物）与 SDA 模板 5 端的 DNA 序列完全互补。 0031 所述的 SDA 产物与发卡结构有 18 个 bp 的互补序列，可以在 37 度相互杂交从而打开发卡结构。 0032 所述的链置换扩增模板中含有 Nt.BbvCI 识别双链中不被切割的单链序列 3 -GGAGTCG-5 ；为了防止发卡自身 3 端的非特异性扩增影响单链触发的效率，发卡分子 H 的 3 端修饰有磷酸基团。 0033 所述的发卡分子 H 的序列含。

22、有 Nt.BbvCI 识别双链中不被切割的单链序列 3 -GGAGTCG-5 ，发卡分子 H 没有被打开时，发卡分子 H 和分子信标均是茎环结构不发生作用；当发卡被打开后有 12 个 nt 与分子信标互补形成双链并且被 Nt.BbvCI 识别切断，切断的两段分子信标均不能够在 37下和发卡分子 H 形成稳定的双链结构而和发卡分子 H 分开，被打开的发卡分子 H 能够循环的打开多个分子信标，使荧光信号放大。 0034 所述的反应温度为 37 度，反应时间为 45 分钟。 0035 与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果： 0036 1、本发明提供的基于恒温级联核。

23、酸扩增的铅离子检测试剂盒及其检测方法，通过脱氧核酶识别铅离子，并结合链置换扩增与单链触发的 DNA 分子机器实现恒温级联核酸扩增，将铅离子浓度转化为显著放大的荧光检测信号，从而精确测定微量铅离子浓度。由于通过荧光信号来表征铅离子浓度，具有很高的灵敏度与检测范围。 0037 2、本发明提供的基于恒温级联核酸扩增的铅离子检测试剂盒及其检测方法，相对于基于脱氧核酶的其他方法相比更加快速，灵敏度更高；且对设备的要求更低，操作更加简单。 0038 3、本发明提供的基于恒温级联核酸扩增的铅离子检测试剂盒及其检测方法，利用的基于 DNA 分子机器的核酸扩增技术不容易受。

24、到复杂体系的干扰，由于用了 GR-5 脱氧核酶，对其他金属离子（尤其是锌离子）的抗干扰能力也更强。 0039 4、本发明提供的基于恒温级联核酸扩增的铅离子检测试剂盒及其检测方法，其所设计的链置换扩增技术和单链触发的 DNA 分子机器可以循环利用发卡结构来打开更多的分子信标，显著提高了信号放大的效率。 0040 5、本发明提供的基于恒温级联核酸扩增的铅离子检测试剂盒及其检测方法，将脱氧核酶，链置换扩增技术和单链触发的发卡结构进行串联，构建了一种新型的恒温级联核酸扩增信号放大系统。 0041 6、本发明提供的基于恒温级联核酸扩增的铅离子检测试剂盒及其检测方法，对。

25、铅离子具有较好的选择性，可以显著反映铅离子和其他金属离子的差异。 0042 7、本发明提供的基于恒温级联核酸扩增的铅离子检测试剂盒及其检测方法，可应用于河水中的铅离子的检测，为水体监测提供了一种新的监测手段。附图说明 0043 图 1 是本发明的检测方法原理示意图； 0044 图 2-1 2-2 是不同浓度的铅离子溶液的定量检测结果。说明书 CN 103305612 A 6 4/5 页 7 具体实施方式 0045 下面结合具体的附图和具体实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。 0046 参见图 1，其中 a 为核酶在铅离子存在的时候从底物。

26、RNA 碱基的 3 端切断底物， b 是底物和 SDA 模板杂交在聚合酶和切口酶存在下进行连置换扩增（SDA）， c 是连置换扩增产物触发切口酶放大信号的过程。整个过程使用了 4 种寡核苷酸探针，具体的探针序列如下所示（5 -3 ） : 0047 脱氧核酶 :AATCATCTCTGAAGTAGCGCCGCCGTATAGTGAGTTT ； 0048 TTTTTTTCTCACTATrAGGAAGAGATGATT ； 0049 SDA 模板 :AAGTGTGTGTGTCCTCGCTGAGGTTAATCATCTCTTCC ； 0050 发卡结构 :AAGTGTGTGTGTCCTCGCTGC。

27、GCTGAGGACACAC ； 0051 分子信标 :FAM-CCACGAGTCAGTGTCCTCAGCGTGG-DABCYL ； 0052 其中，脱氧核酶及其底物通过十个 T 来连接，形成的核酶 - 底物体的两臂分别为 10bps 和 9bps（靠近十个 T 的一臂），红色的碱基 rA 是 RNA 碱基，即核糖核苷酸，其他均为脱氧核糖核苷酸； 0053 SDA 模板由 3 个部分组成， SDA 模板 3 端的 13 个碱基和脱氧核酶 rA3 端的 13 个碱基互补，中间的 5 -GGAGTCG-3 是切口酶 Nt.BbvCI 的识别序列， 5 端的 18 个碱基和发卡结。

28、构 5端的 18 个碱基序列一样，这样可以保证 SDA 扩增出来的 DNA 序列能够和发卡结构 5 端互补从而打开发卡结构； 0054 发卡结构是一个杆有 10bps，环有 8nts 的结构， 5 端有 6 个突出的碱基序列， 3 端修饰了磷酸基团为了防止在体系中有 Klenow fragment 聚合酶存在下进行扩增，发卡结构中也含有切口酶 Nt.BbvCI 的识别位点 3 -GGAGTCG-5 （杆上有 4 个 nts，环上有 3nts） , 打开的发卡结构和分子信标有 12bps 互补，并且包含切口酶 Nt.BbvCI 的识别位点。分子信标的序列是 5 -FAM-C。

29、CACGAGTCAGTGTCCTCAGCGTGG-DABCYL-3 。 0055 具体的上述方法是个一步反应（one-step），所有的探针同时放在一个体系内进行反应。首先，脱氧核酶形成如图所示的结构，在铅离子存在的条件下底物链从 rA3 端断裂，底物 3 端部分由于只和核酶有 10bps 互补，在 37下不足以稳定形成双链结构，所以和核酶分开，形成一段 13nts 的短的寡核苷酸链。这条寡核苷酸链恰好作为引物和 SDA 模板的 3 端互补，在Klenow fragment聚合酶以及dNTP燃料存在的作用下，引物沿着模板聚合，形成一条和模板互补的序列，这条序列和。

30、模板形成的双链DNA序列中有一段Nt.BbvCI核酸切口酶识别位点， Nt.BbvCI 核酸切口酶切割新产生的那段 DNA 单链，暴露出一个 -OH 集团，又可以进行新一轮的聚合过程，同时将原来产生的那条单链置换下来，经过一段时间，就会产生出许多 SDA 产物（18nts）。 0056 发卡结构虽然和分子信标有互补区域，但是由于互补区域分别位于这两个分子的杆和环结构中，因此他们不能够相互杂交形成部分双链结构。而 SDA 产物与发卡结构的 3 端有 18 个互补，比原来发卡结构本身的杆（10bps）长，具有竞争优势，因此可以打开发卡结构，同时暴露出的与分子。

31、信标互补的区域，从而破坏分子信标的茎环结构，荧光恢复，同时形成的双链互补结构中还含有 Nt.BbvCI 核酸切口酶识别位点，切割位点在分子信标序列说明书 CN 103305612 A 7 5/5 页 8 上。切成两部分的分子信标都只和发卡结构有 6 个碱基的互补，不能再形成稳定双链结构从而解链，而未打开的分子信标又能进一步和发卡结构杂交使得荧光信号被放大。该恒温级联核酸扩增过程在 37 度下进行，反应时间为 45 分钟。之后利用荧光仪检测反应产物的荧光信号。 0057 图 2-1 2-2 是不同浓度的铅离子溶液的定量检测结果，其中图 2-1 反应了不同浓度的铅离。

32、子溶液对应的荧光发射光谱，其中从 a 到 o 曲线代表的铅离子浓度分别是 a)0p M,b)1pM,c)5pM,d)10pM,e)50pM,f)100pM,g)500pM， h)1nM,i)5nM,j)10nM,k)20nM,l)50nM, m)100nM,n)200nM,o)500nM ；图 2-2 反应了 518nm 处荧光增强倍数与铅离子浓度的关系。 0058 实施例 1 基于脱氧核酶，链置换扩增和切口酶放大荧光信号的河水中铅离子浓度检测方法，对复杂体系中铅离子浓度进行检测，具体操作为： 0059 1）处理待测溶液 0060 将收集到的河水溶液静置，用 0.2m 孔径的。

33、微膜过滤出去悬浮颗粒，分别加入 1 10-11mol,1010-11mol,10010-11mol 标准铅离子溶液待用。 0061 2）利用溶液中的铅离子触发恒温级联核酸扩增放大荧光信号 0062 分别将 2L 上述铅离子溶液加入到含有 20nM 脱氧核酸， 10nM SDA 模板， 50nM 发卡分子 H， 250nM 分子信标， 2.5U/L Klenow fragment 聚合酶 ,4U Nt.BbvCI 核酸切口酶 , 以及 0.2mM dNTPs 的 1NEB buffer2(10mM Tris-HCl,50mM NaCl,10mM MgCl2,1mM dithiothrei。

34、tol,pH=7.9) 中，总反应体积为 20L，在 37 度下反应 45 分钟后进行荧光检测。 0063 图 2-1 中各条曲线从下到上分别代表的铅离子浓度是 0pM,1pM,5pM,10pM,50pM,1 00pM,500pM， 1nM,5nM,10nM,20nM,50nM,100nM,200nM,50nM。如图 2-2 所示随着铅浓度的增加，荧光强度也相应增加。线性范围在 1pM-1nM, 符合线性方程 Y=1.05C+7.71，其中 C 是铅离子浓度， Y=10-5F(cps)，然后根据相应的荧光强度就可以得到铅离子浓度。说明书 CN 103305612 A 8 1/2 页 9 0001 0002 序列表 CN 103305612 A 9 2/2 页 10 序列表 CN 103305612 A 10 1/1 页 11 图 1 说明书附图 CN 103305612 A 11 。

摘要
申请专利号：	CN201310218918.9	申请日：	2013.06.04
公开号：	CN103305612A	公开日：	2013.09.18
当前法律状态：	终止	有效性：	无权
法律详情：	未缴年费专利权终止IPC(主分类):C12Q 1/68申请日:20130604授权公告日:20150107终止日期:20170604\|\|\|授权\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):C12Q 1/68申请日:20130604\|\|\|公开
IPC分类号：	C12Q1/68; C12Q1/34	主分类号：	C12Q1/68
申请人：	西安交通大学; 中国烟草总公司陕西省公司
发明人：	赵永席; 张青; 袁慧; 王芳霞; 董绘阳; 白凯
地址：	710049 陕西省西安市咸宁西路28号
优先权：
专利代理机构：	西安通大专利代理有限责任公司 61200	代理人：	汪人和
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内容摘要

本发明公开了一种基于恒温级联核酸扩增的铅离子检测试剂盒及其检测方法，通过脱氧核酶识别铅离子，并结合链置换扩增与单链触发的DNA分子机器实现恒温级联核酸扩增，将铅离子浓度转化为显著放大的荧光检测信号，从而精确测定微量铅离子浓度。本发明相对于基于脱氧核酶的其他方法相比更加快速，灵敏度更高；且对设备的要求更低，操作更加简单。

权利要求书

权利要求书
1.   一种基于恒温级联核酸扩增的铅离子检测试剂盒，其特征在于，包括：
脱氧核酶‑底物连接体，包括通过连接序列连接的脱氧核酶和底物，在铅离子催化下脱氧核酶的底物断裂，产生可作为链置换扩增引物的寡聚脱氧核苷酸链；
扩增底物，包括dNTPs混合物；
DNA分子机器工具，包括具有链置换扩增活性的DNA聚合酶和核酸切口酶；
触发DNA分子机器工具的SDA模板，与脱氧核酶产生的寡聚核苷酸链杂交后被DNA聚合酶所扩增；
具有发卡结构的发卡分子H，能够与SDA模板产物相识别，在识别后杂交打开发卡结构；
具有茎环结构的分子信标探针，其两端分别标记有荧光基团和猝灭基团，分子信标探针具有能够与被打开的发卡分子H相互补的序列；
以及DNA分子机器扩增反应缓冲液。

2.   如权利要求1所述的基于恒温级联核酸扩增的铅离子检测试剂盒，其特征在于，铅离子检测试剂盒，包括10mM Tris‑HCl,50mM NaCl,10mM MgCl2,1mM dithiothreitol，20nM脱氧核酸，10nM SDA模板，50nM发卡分子H，250nM分子信标，2.5U Klenow fragment聚合酶，4U Nt.BbvCI核酸切口酶，以及0.2mM dNTPs。

3.   如权利要求1或2所述的基于恒温级联核酸扩增的铅离子检测试剂盒，其特征在于，所述的脱氧核酶‑底物连接体中，底物部分包括一个核糖核苷酸和能够与SDA模板相识别的寡聚脱氧核苷酸链；
所述的SDA模板包括识别寡聚脱氧核苷酸链的序列、核酸切口酶识别位点和扩增与发卡分子H相识别产物的序列；
所述的发卡分子H包括与SDA模板产物相识别的序列、核酸切口酶识别位点的双链中不被切割的序列和与分子信标相识别的序列；发卡分子H的5’端突出有多个碱基序列，3’端修饰有磷酸基团；
所述的分子信标包括Nt.BbvCI酶的识别位点为5’‑CCTCAGC‑3’；
所述的DNA分子机器工具由KF聚合酶和Nt.BbvCI核酸切口酶组成。

4.   如权利要求1或2所述的基于恒温级联核酸扩增的铅离子检测试剂盒，其特征在于，所述的SDA模板的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示；
发卡分子H的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示；
分子信标探针的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示，其两端分别标记有荧光基团FAM和淬灭基团DABCYL。

5.   一种基于恒温级联核酸扩增的铅离子检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）将待检测的溶液超滤去除悬浮颗粒；
2）将待检测的溶液与脱氧核酶‑底物连接体、扩增底物、DNA分子机器工具、具有发卡结构的发卡分子H、分子信标探针以及DNA分子机器扩增反应缓冲液混合；
3）脱氧核酶在铅离子存在的情况下，脱氧核酶‑底物连接体断裂，产生链置换扩增的寡聚核苷酸链，该寡聚核苷酸链与SDA模板杂交，寡聚核苷酸链3‘端在DNA聚合酶的作用下进行扩增，待扩增至一定长度后，扩增产物中的核酸切口酶识别位点被识别并在扩增链的相应位点发生切割，产生SDA产物，而寡聚核苷酸链与SDA模板的杂交物继续进行扩增；
4）扩增所获得的SDA产物触发打开发卡分子H构成杂交体，发卡结构H被打开后，暴露出的与分子信标互补的区域，从而破坏分子信标的茎环结构，分子信标与杂交体构成双链结构，其荧光恢复；而分子信标参与形成的双链互补结构中还含有核酸切口酶识别位点，在形成双链结构后该位点被识别，并在分子信标序列上进行切割；被切割的分子信标从双链结构上脱落产生荧光信号，而SDA产物与发卡分子H构成的杂交体再打开新的分子信标，以产生更多的荧光信号；
5）待达到规定的反应时间后，检测荧光信号，对荧光信号分析得到待测溶液中铅离子的含量，在一定范围内，铅离子浓度越高，则荧光信号越强。

6.   如权利要求5所述的基于恒温级联核酸扩增的铅离子检测方法，其特征在于，脱氧核酶底物断裂点3’端的序列与SDA模板5’端的DNA序列完全互补。

7.   如权利要求5所述的基于恒温级联核酸扩增的铅离子检测方法，其特征在于，SDA产物与发卡结构有18个bp的互补序列，可以在37℃相互杂交从而打开发卡结构。

8.   如权利要求5所述的基于恒温级联核酸扩增的铅离子检测方法，其特征在于，链置换扩增模板中含有Nt.BbvCI识别双链中不被切割的单链序列3’‑GGAGTCG‑5’；为了防止发卡自身3’端的非特异性扩增影响单链触发的效率，发卡分子H的3’端修饰有磷酸基团。

9.   如权利要求5所述的基于恒温级联核酸扩增的铅离子检测方法，其特征在于，发卡分子H的序列含有Nt.BbvCI识别双链中不被切割的单链序列3’‑GGAGTCG‑5’，发卡分子H没有被打开时，发卡分子H和分子信标均是茎环结构不发生作用；当发卡被打开后有12个nt与分子信标互补形成双链并且被Nt.BbvCI识别切断，切断的两段分子信标均不能够在37℃下和发卡分子H形成稳定的双链结构而和发卡分子H分开，被打开的发卡分子H能够循环的打开多个分子信标，使荧光信号放大。

10.   如权利要求5所述的基于恒温级联核酸扩增的铅离子检测方法，其特征在于，检测中的反应温度为37℃，反应时间为45分钟。

说明书

说明书一种基于恒温级联核酸扩增的铅离子检测试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明属于铅离子的检测技术领域，涉及一种基于恒温级联核酸扩增的铅离子检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
铅离子是一种常见的高毒性污染物，会对水生生态系统中的植物和动物产生不良影响。铅污染的主要来源可能是汽油和铅基油漆。对于人类来说，铅离子会带来许多健康问题，如贫血，肾功能故障和肌肉麻痹。即使在低浓度下，铅中毒也会是对儿童大脑和中枢神经系统产生严重的损害。因此发展一种超灵敏和高选择性的铅离子检测方法对临床检测，工业和环境监测都是非常重要。
传统的检测铅离子等重金属的主要方法是色谱法、原子吸收/发射光谱法、电感耦合等离子体质谱法等，但是这些方法存在很多弊端，比如依赖大型仪器设备，样品预处理过程复杂，需要专业人员操作，以及检测成本较高。近年来，基于脱氧核酶（DNAzyme）的新型铅离子传感检测方法得到了发展，如电化学法，比色法和荧光法。然而比色法虽然结果肉眼可见但是灵敏度不够高，并且纳米金的合成与准备过程也较为繁琐。而电化学法的灵敏度高但是操作复杂，时间较长，需要配备价格较为昂贵的电化学相关仪器，同时，核酶相关的荧光法由于没有进行放大虽然更加快速和简便，但是比较难以获得令人满意的灵敏度和检测范围。
基于链置换扩增（Strand displacement amplification，SDA）的DNA分子机器（DNA‑machine）技术利用具有链置换活性的DNA聚合酶的延伸反应与核酸切口酶（nicking enzyme）识别并切割特定双链中单链的性质，能够在恒温条件下迅速扩增出多条寡核苷酸单链。相比于传统扩增技术如PCR，SDA不仅具有较高的扩增效率，而且不需要精确地热循环设备，只需要简易的恒温装置即可。此外，具有链置换活性的DNA聚合酶如KF聚合酶（Klenow fragment polymerase，KF polymerase）等相对于Taq DNA聚合酶受复杂体系影响较小。因此近年来，这类DNA分子机器受到国内外研究学者的广泛关注，被越来越多地用于DNA,microRNA,以及其它生物活性分子的检测信号的放大。
发明内容
本发明解决的问题在于提供一种基于恒温级联核酸扩增的铅离子检测试剂盒及其检测方法，通过基于DNA分子机器的恒温级联核酸扩增方法进行铅离子含量的检测，灵敏度高同时操作简便，成本较低。
本发明是通过以下技术方案来实现：
一种基于恒温级联核酸扩增的铅离子检测试剂盒，包括：
脱氧核酶‑底物连接体，包括通过连接序列连接的脱氧核酶和底物，在铅离子催化下脱氧核酶的底物断裂，产生可作为链置换扩增引物的寡聚脱氧核苷酸链；
扩增底物，包括dNTPs混合物；
DNA分子机器工具，包括具有链置换扩增活性的DNA聚合酶和核酸切口酶；
触发DNA分子机器工具的SDA模板，与脱氧核酶产生的寡聚核苷酸链杂交后被DNA聚合酶所扩增；
具有发卡结构的发卡分子H，能够与SDA模板产物相识别，在识别后杂交打开发卡结构；
具有茎环结构的分子信标探针，其两端分别标记有荧光基团和猝灭基团，分子信标探针具有能够与被打开的发卡分子H相互补的序列；
以及DNA分子机器扩增反应缓冲液。
所述的铅离子检测试剂盒，包括10mM Tris‑HCl,50mM NaCl,10mM MgCl2,1mM dithiothreitol，20nM脱氧核酸，10nM SDA模板，50nM发卡分子H，250nM分子信标，2.5U Klenow fragment聚合酶，4U Nt.BbvCI核酸切口酶，以及0.2mM dNTPs。
所述的脱氧核酶‑底物连接体中，底物部分包括一个核糖核苷酸和能够与SDA模板相识别的寡聚脱氧核苷酸链；
所述的SDA模板包括识别寡聚脱氧核苷酸链的序列、核酸切口酶识别位点和扩增与发卡分子H相识别产物的序列；
所述的发卡分子H包括与SDA模板产物相识别的序列、核酸切口酶识别位点的双链中不被发生切割的序列和与分子信标相识别的序列；发卡分子H的5’端突出有多个碱基序列，3’端修饰有磷酸基团；
所述的分子信标包括Nt.BbvCI酶的识别位点为5’‑CCTCAGC‑3’；
所述的DNA分子机器工具由KF聚合酶和Nt.BbvCI核酸切口酶组成。
所述的SDA模板的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示；
发卡分子H的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示；
分子信标探针的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示，其两端分别标记有荧光基团FAM和淬灭基团DABCYL。
一种基于恒温级联核酸扩增的铅离子检测方法，包括以下步骤：
1）将待检测的溶液超滤去除悬浮颗粒；
2）将待检测的溶液与脱氧核酶‑底物连接体、扩增底物、DNA分子机器工具、具有发卡结构的发卡分子H、分子信标探针以及DNA分子机器扩增反应缓冲液混合；
3）脱氧核酶在铅离子存在的情况下，脱氧核酶‑底物连接体断裂，产生链置换扩增的寡聚核苷酸链，该寡聚核苷酸链与SDA模板杂交，寡聚核苷酸链3‘端在DNA聚合酶的作用下进行扩增，待扩增至一定长度后，扩增产物中的核酸切口酶识别位点被识别并在扩增链的相应位点发生切割，产生SDA产物，而寡聚核苷酸链与SDA模板的杂交物继续进行扩增；
4）扩增所获得的SDA产物触发打开发卡分子H构成杂交体，发卡结构H被打开后，暴露出的与分子信标互补的区域，从而破坏分子信标的茎环结构，分子信标与杂交体构成双链结构，其荧光恢复；而分子信标参与形成的双链互补结构中还含有核酸切口酶识别位点，在形成双链结构后该位点被识别，并在分子信标序列上进行切割；被切割的分子信标从双链结构上脱落产生荧光信号，而SDA产物与发卡分子H构成的杂交体再打开新的分子信标，以产生更多的荧光信号；
5）待达到规定的反应时间后，检测荧光信号，对荧光信号分析得到待测溶液中铅离子的含量，在一定范围内，铅离子浓度越高，则荧光信号越强。
所述的脱氧核酶底物断裂点3’端的序列（即SDA过程的引物）与SDA模板5’端的DNA序列完全互补。
所述的SDA产物与发卡结构有18个bp的互补序列，可以在37度相互杂交从而打开发卡结构。
所述的链置换扩增模板中含有Nt.BbvCI识别双链中不被切割的单链序列3’‑GGAGTCG‑5’；为了防止发卡自身3’端的非特异性扩增影响单链触发的效率，发卡分子H的3’端修饰有磷酸基团。
所述的发卡分子H的序列含有Nt.BbvCI识别双链中不被切割的单链序列3’‑GGAGTCG‑5’，发卡分子H没有被打开时，发卡分子H和分子信标均是茎环结构不发生作用；当发卡被打开后有12个nt与分子信标互补形成双链并且被Nt.BbvCI识别切断，切断的两段分子信标均不能够在37℃下和发卡分子H形成稳定的双链结构而和发卡分子H分开，被打开的发卡分子H能够循环的打开多个分子信标，使荧光信号放大。
所述的反应温度为37度，反应时间为45分钟。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
1、本发明提供的基于恒温级联核酸扩增的铅离子检测试剂盒及其检测方法，通过脱氧核酶识别铅离子，并结合链置换扩增与单链触发的DNA分子机器实现恒温级联核酸扩增，将铅离子浓度转化为显著放大的荧光检测信号，从而精确测定微量铅离子浓度。由于通过荧光信号来表征铅离子浓度，具有很高的灵敏度与检测范围。
2、本发明提供的基于恒温级联核酸扩增的铅离子检测试剂盒及其检测方法，相对于基于脱氧核酶的其他方法相比更加快速，灵敏度更高；且对设备的要求更低，操作更加简单。
3、本发明提供的基于恒温级联核酸扩增的铅离子检测试剂盒及其检测方法，利用的基于DNA分子机器的核酸扩增技术不容易受到复杂体系的干扰，由于用了GR‑5脱氧核酶，对其他金属离子（尤其是锌离子）的抗干扰能力也更强。
4、本发明提供的基于恒温级联核酸扩增的铅离子检测试剂盒及其检测方法，其所设计的链置换扩增技术和单链触发的DNA分子机器可以循环利用发卡结构来打开更多的分子信标，显著提高了信号放大的效率。
5、本发明提供的基于恒温级联核酸扩增的铅离子检测试剂盒及其检测方法，将脱氧核酶，链置换扩增技术和单链触发的发卡结构进行串联，构建了一种新型的恒温级联核酸扩增信号放大系统。
6、本发明提供的基于恒温级联核酸扩增的铅离子检测试剂盒及其检测方法，对铅离子具有较好的选择性，可以显著反映铅离子和其他金属离子的差异。
7、本发明提供的基于恒温级联核酸扩增的铅离子检测试剂盒及其检测方法，可应用于河水中的铅离子的检测，为水体监测提供了一种新的监测手段。附图说明
图1是本发明的检测方法原理示意图；
图2‑1～2‑2是不同浓度的铅离子溶液的定量检测结果。
具体实施方式
下面结合具体的附图和具体实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
参见图1，其中a为核酶在铅离子存在的时候从底物RNA碱基的3’端切断底物，b是底物和SDA模板杂交在聚合酶和切口酶存在下进行连置换扩增（SDA），c是连置换扩增产物触发切口酶放大信号的过程。整个过程使用了4种寡核苷酸探针，具体的探针序列如下所示（5’‑3’）:
脱氧核酶:AATCATCTCTGAAGTAGCGCCGCCGTATAGTGAGTTT；
TTTTTTTCTCACTATrAGGAAGAGATGATT；
SDA模板:AAGTGTGTGTGTCCTCGCTGAGGTTAATCATCTCTTCC；
发卡结构:AAGTGTGTGTGTCCTCGCTGCGCTGAGGACACAC；
分子信标:FAM‑CCACGAGTCAGTGTCCTCAGCGTGG‑DABCYL；
其中，脱氧核酶及其底物通过十个T来连接，形成的核酶‑底物体的两臂分别为10bps和9bps（靠近十个T的一臂），红色的碱基rA是RNA碱基，即核糖核苷酸，其他均为脱氧核糖核苷酸；
SDA模板由3个部分组成，SDA模板3’端的13个碱基和脱氧核酶rA3’端的13个碱基互补，中间的5’‑GGAGTCG‑3’是切口酶Nt.BbvCI的识别序列，5’端的18个碱基和发卡结构5‘端的18个碱基序列一样，这样可以保证SDA扩增出来的DNA序列能够和发卡结构5’端互补从而打开发卡结构；
发卡结构是一个杆有10bps，环有8nts的结构，5’端有6个突出的碱基序列，3’端修饰了磷酸基团为了防止在体系中有Klenow fragment聚合酶存在下进行扩增，发卡结构中也含有切口酶Nt.BbvCI的识别位点3’‑GGAGTCG‑5’（杆上有4个nts，环上有3nts）,打开的发卡结构和分子信标有12bps互补，并且包含切口酶Nt.BbvCI的识别位点。分子信标的序列是5’‑FAM‑CCACGAGTCAGTGTCCTCAGCGTGG‑DABCYL‑3’。
具体的上述方法是个一步反应（one‑step），所有的探针同时放在一个体系内进行反应。首先，脱氧核酶形成如图所示的结构，在铅离子存在的条件下底物链从rA3’端断裂，底物3’端部分由于只和核酶有10bps互补，在37℃下不足以稳定形成双链结构，所以和核酶分开，形成一段13nts的短的寡核苷酸链。这条寡核苷酸链恰好作为引物和SDA模板的3’端互补，在Klenow fragment聚合酶以及dNTP燃料存在的作用下，引物沿着模板聚合，形成一条和模板互补的序列，这条序列和模板形成的双链DNA序列中有一段Nt.BbvCI核酸切口酶识别位点，Nt.BbvCI核酸切口酶切割新产生的那段DNA单链，暴露出一个‑OH集团，又可以进行新一轮的聚合过程，同时将原来产生的那条单链置换下来，经过一段时间，就会产生出许多SDA产物（18nts）。
发卡结构虽然和分子信标有互补区域，但是由于互补区域分别位于这两个分子的杆和环结构中，因此他们不能够相互杂交形成部分双链结构。而SDA产物与发卡结构的3’端有18个互补，比原来发卡结构本身的杆（10bps）长，具有竞争优势，因此可以打开发卡结构，同时暴露出的与分子信标互补的区域，从而破坏分子信标的茎环结构，荧光恢复，同时形成的双链互补结构中还含有Nt.BbvCI核酸切口酶识别位点，切割位点在分子信标序列上。切成两部分的分子信标都只和发卡结构有6个碱基的互补，不能再形成稳定双链结构从而解链，而未打开的分子信标又能进一步和发卡结构杂交使得荧光信号被放大。该恒温级联核酸扩增过程在37度下进行，反应时间为45分钟。之后利用荧光仪检测反应产物的荧光信号。
图2‑1～2‑2是不同浓度的铅离子溶液的定量检测结果，其中图2‑1反应了不同浓度的铅离子溶液对应的荧光发射光谱，其中从a到o曲线代表的铅离子浓度分别是a)0pM,b)1pM,c)5pM,d)10pM,e)50pM,f)100pM,g)500pM，h)1nM,i)5nM,j)10nM,k)20nM,l)50nM,m)100nM,n)200nM,o)500nM；图2‑2反应了518nm处荧光增强倍数与铅离子浓度的关系。
实施例1基于脱氧核酶，链置换扩增和切口酶放大荧光信号的河水中铅离子浓度检测方法，对复杂体系中铅离子浓度进行检测，具体操作为：
1）处理待测溶液
将收集到的河水溶液静置，用0.2μm孔径的微膜过滤出去悬浮颗粒，分别加入1×10‑11mol,10×10‑11mol,100×10‑11mol标准铅离子溶液待用。
2）利用溶液中的铅离子触发恒温级联核酸扩增放大荧光信号
分别将2μL上述铅离子溶液加入到含有20nM脱氧核酸，10nM SDA模板，50nM发卡分子H，250nM分子信标，2.5U/μL Klenow fragment聚合酶,4U Nt.BbvCI核酸切口酶,以及0.2mM dNTPs的1×NEB buffer2(10mM Tris‑HCl,50mM NaCl,10mM MgCl2,1mM dithiothreitol,pH=7.9)中，总反应体积为20μL，在37度下反应45分钟后进行荧光检测。
图2‑1中各条曲线从下到上分别代表的铅离子浓度是0pM,1pM,5pM,10pM,50pM,100pM,500pM，1nM,5nM,10nM,20nM,50nM,100nM,200nM,50nM。如图2‑2所示随着铅浓度的增加，荧光强度也相应增加。线性范围在1pM‑1nM,符合线性方程Y=1.05C+7.71，其中C是铅离子浓度，Y=10‑5F(cps)，然后根据相应的荧光强度就可以得到铅离子浓度。