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基于DNA自组装的非酶离子检测方法.pdf

  • 上传人：三**
  • 文档编号：5401551
  • 上传时间：2019-01-09
  • 格式：PDF
  • 页数：12
  • 大小：1.10MB
    • 摘要
    申请专利号：

    CN201310176158.X

    		 申请日：

    2013.05.13
    公开号：

    CN103305605A

    		 公开日：

    2013.09.18
    当前法律状态：

    授权

    		 有效性：

    有权
    法律详情：

    授权|||实质审查的生效IPC(主分类):C12Q 1/68申请日:20130513|||公开
    IPC分类号：

    C12Q1/68; G01N21/64

    		 主分类号：

    C12Q1/68
    申请人：

    中国科学院广州生物医药与健康研究院
    发明人：

    曾令文; 葛晨晨; 陈俊华
    地址：

    510530 广东省广州市萝岗区科学城开源大道190号
    优先权：

    专利代理机构：

    广州嘉权专利商标事务所有限公司 44205

    		 代理人：

    谭英强
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    内容摘要

    本发明公开了基于DNA自组装的非酶离子检测方法，使用捕获探针捕获被离子特异性酶切反应中生成的单链核酸，之后与自组装探针反应生成长DNA双链，通过确定DNA双链的量来确定离子浓度。具有操作简单，检出限低，线性范围大，特异性好，反应迅速，检测结果准确可靠的优点。

    权利要求书

    权利要求书
    1.   基于DNA自组装的非酶离子检测的方法，包括如下步骤：
    1)  设计捕获探针CP、自组装探针SP1和SP2，CP的一端连接有分离标记，另一端与底物DNA链的一端MP互补；探针SP1的5’端和3’端可分别和SP2的3’端和5’端互补，自组装形成双链DNA，SP1和SP2的5’端和3’端中至少部分序列、探针CP和MP共互补形成双链复合体；
    2)  将底物DNA链、待测离子依赖型DNA酶和样本加入反应液中，混匀，反应完全；
    3)  在上述反应液中加入CP，充分反应使其与底物DNA链被切断而形成的MP链杂交，得到CP‑MP杂交链；
    4)  将CP‑MP杂交链分离，清洗去除其他游离DNA链；
    5)  将纯化的CP‑MP杂交链、SP1、SP2加入反应液，反应完全以形成自组装双链，得到CP‑MP‑SP1‑SP2双链复合体；
    6)  将CP‑MP‑SP1‑SP2双链复合体，清洗去除其他游离DNA链；
    7)  通过检测清洗后的DNA链中双链DNA的量，确定待测离子的量。

    2.   根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在步骤3），同时加入CP和封闭DNA，封闭DNA与底物DNA链被切割后的另一段序列完全互补。

    3.   根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：CP中核酸序列的长度为15～30 bp。

    4.   根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：SP1和和SP2的长度独立为20～50 bp。

    5.   根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：分离标记为亲合基团、固相载体。

    6.   根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：将清洗后的DNA链与特异性嵌入双链DNA中的荧光染料反应，之后检测其荧光值确定双链DNA的量。

    7.   实现权利要求1～6任意一项权利要求所述方法的检测试剂盒。

    说明书

    说明书基于DNA自组装的非酶离子检测方法
    技术领域
    本发明一种离子检测方法，特别涉及一种基于DNA自组装的非酶离子检测方法。
    背景技术
    环境中离子的浓度直接影响人们的健康，过高或过低都会影响人们的健康。在众多的离子中，重金属离子的危害性更大，更有必要对其含量进行精确的测定。
    传统的用于检测重金属离子的方法主要有石墨烯原子吸收光谱法(AAS:graphite furnace atomic absorption spectrometry)和电感耦合等离子原子发射光谱法(ICP‑AES：inductive coupled plasma atomic emission spectroscopy)。这两种方法对于重金属离子的检测准确可靠，但使用的仪器价格昂贵，需要经验丰富的技术人员来操作，因而限制了其在基层实验室的广泛应用。近年来，各种检测重金属离子的生物传感器不断出现，其检测的原理都是依赖于重金属离子能够切割其DNA酶结合的底物链的特定位点，然后使用一系列的方法来检测释放的底物链，检测方法包括：荧光法，比色法，动力学光散射法和胶体金试纸条法等。虽然与传统的检测方法相比，这些方法操作简便，检测灵敏度高，但是需要用到蛋白酶或者荧光标记DNA，增加了检测的成本和反应体系的复杂性。胶体金试纸条提供了一种定性的方法检测重金属离子，但是不能够准确定量。因此发明一种简单、便宜、灵敏的和可定量的方法来检测重金属离子具有重要的意义。
    发明内容
    本发明的目的在于提供一种基于DNA自组装的非酶离子检测方法，本发明方法不应用于疾病的诊断及治疗。
    本发明的另一个目的在于提供实现上述检测方法的试剂盒。
    本发明所采取的技术方案是：
    基于DNA自组装的非酶离子检测的方法，包括如下步骤：
    1)设计捕获探针CP、自组装探针SP1和SP2，CP的一端连接有分离标记，另一端与底物DNA链的一端MP互补；探针SP1的5’端和3’端可分别和SP2的3’端和5’端互补，自组装形成双链DNA，SP1和SP2的5’端和3’端中至少部分序列、探针CP和MP共互补形成双链复合体；
    2)将底物DNA链、待测离子依赖型DNA酶和样本加入反应液中，混匀，反应完全；
    3)在上述反应液中加入CP，充分反应使其与底物DNA链被切断而形成的MP链杂交，得到CP‑MP杂交链；
    4)将CP‑MP杂交链分离，清洗去除其他游离DNA链；
    5)将纯化的CP‑MP杂交链、SP1、SP2加入反应液，反应完全以形成自组装双链，得到CP‑MP‑SP1‑SP2双链复合体；
    6)将CP‑MP‑SP1‑SP2双链复合体，清洗去除其他游离DNA链；
    7)通过检测清洗后的DNA链中双链DNA的量，确定待测离子的量。
    优选的，在步骤3），同时加入CP和封闭DNA，封闭DNA与底物DNA链被切割后的另一段序列完全互补。
    优选的，CP中核酸序列的长度为15～30bp。
    优选的，SP1和和SP2的长度独立为20～50bp。
    该方法中，分离标记为亲合基团、固相载体。
    优选的，将清洗后的DNA链与特异性嵌入双链DNA中的荧光染料反应，之后检测其荧光值确定双链DNA的量。
    实现上述检测方法的试剂盒，该试剂盒中含有CP、离子依赖型DNA酶链、SP1和SP2。
    本发明的有益效果是：
    （1）在检测体系中，检测信号的放大不需要使用任何蛋白酶，降低了实验过程中对温度的要求。
    （2）本发明体系对样本的要求低，可以用于实际样品的定量检测。
    （3）本发明中用DNA自组装形成的双链作为信号放大方式，反应快速方便，缩短了操作时间。用于实现信号放大的DNA纳米管的核酸序列不需要荧光标记，降低了检测成本。并且随着检测的靶核酸序列的不同，SP1和SP2的序列可以随意改变。
    （4）本发明所述的DNA自组装非酶检测方法具有很高的灵敏度，对铜离子的检测限为12.8pM，比FDA规定的检测限(20μM)提高了1000多倍。检测迅速方便，用普通的荧光分光光度计读数，不需要昂贵的仪器，节约了检测成本。
    （5）本发明所述的DNA自组装非酶检测方法具有很高的特异性，其他离子对检测不产生明显的干扰。
    附图说明
    图1为本发明方法的检测原理图；
    图2为验证SP1与SP2是否能组装成长双链DNA的电泳图谱；
    图3为本发明方法的检测结果曲线；
    图4为本发明方法的灵敏度实验结果图。
    具体实施方式
    DNA纳米管是由两种首尾互补的核酸序列通过级联的杂交反应而形成的一个长链结构，这个长的双链DNA被SYBR GreenⅠ染色后，就可以作为一个信号探针用于核酸的检测。因此，使用DNA纳米管作为信号放大装置用来检测铜离子具有明显的优势。检测中避免使用蛋白酶、荧光标记DNA和复杂昂贵的仪器，适合在基层实验室使用。
    离子依赖型DNA酶可与其底物DNA链形成酶‑底物复合体。已经发现的离子依赖型DNA酶有铜离子、铅离子、汞离子、铀离子。
    基于DNA自组装的非酶离子检测的方法，包括如下步骤：
    1)设计捕获探针CP、自组装探针SP1和SP2，CP的一端连接有分离标记，另一端与底物DNA链的一端MP互补；探针SP1的5’端和3’端可分别和SP2的3’端和5’端互补，自组装形成双链DNA，SP1和SP2的5’端和3’端中至少部分序列、探针CP和MP共互补形成双链复合体；
    2)将底物DNA链、待测离子依赖型DNA酶和样本加入反应液中，混匀，反应完全；
    3)在上述反应液中加入CP，充分反应使其与底物DNA链被切断而形成的MP链杂交，得到CP‑MP杂交链；
    4)将CP‑MP杂交链分离，清洗去除其他游离DNA链；
    5)将纯化的CP‑MP杂交链、SP1、SP2加入反应液，反应完全以形成自组装双链，得到CP‑MP‑SP1‑SP2双链复合体；
    6)将CP‑MP‑SP1‑SP2双链复合体，清洗去除其他游离DNA链；
    7)通过检测清洗后的DNA链中双链DNA的量，确定待测离子的量。
    优选的，在步骤3），同时加入CP和封闭DNA，封闭DNA与底物DNA链被切割后的另一段序列完全互补。这样，当反应物不含有待测离子时，CP、封闭DNA和底物DNA链通过碱基互补，形成与底物DNA链完全互补的双链，该双链不具有粘性末端，无法与SP1或SP2互补，可以进一步减少假阳性结果出现的可能性。
    DNA酶‑底物复合体在正常条件可以稳定存在，其底物DNA链不易脱落，但是在对应离子存在的情况下，底物DNA链会在特异位点被切断，如铜离子能够特异性地识别并切断与铜离子依赖型DNA酶链杂交的底物链，切断后的底物链与DNA酶链的亲和力降低，无法与DNA酶链形成杂交复合体，释放出两条单链核酸，这些单链核酸可与捕获探针CP杂交。方便起见，将切割后形成的单链核酸中的一条记为MP。MP的一端与CP杂交，另一端与SP1或SP2的一端杂交，这样就可以将CP、MP、SP1和SP2连接在一起。
    综合考虑合成的难度和所需的碱基互补配对力，探针SP1和SP2的长度独立优选为20～50bp。当然，本领域技术人员可以根据需要，通过有限次实验确定核酸序列的长度。这些核酸可以被进一步修饰，如使用LNA修饰，以提高其特异性、热稳定性等，以获得更佳的检测效果。
    该方法中，分离标记的用途在于简化后续的分离操作，分离标记可以是亲合基团、固相载体等。常见的分离标记有亲和分离标记、固相载体等。亲和分离标记包括但不限于生物素、抗原、核酸序列等，这些亲和分离标记可以通过亲和作用，如生物素‑链霉亲和素反应、抗原‑抗体反应、核酸互补作用等结合在一起，形成复合体，方便分离；固相载体包括但不限于磁珠、微球、酶标板等。
    最终双链DNA量的确定：可以通过加入特异性插入双链DNA的荧光染料，之后检测荧光强度以确定最终DNA双链的量，亦可以使用其他公知的方法确定双链DNA的量，如琼脂糖凝胶电泳，分光光度计测量ds‑DNA的OD值。
    优选的，将清洗后的DNA链与特异性嵌入双链DNA中的荧光染料反应，之后检测其荧光值确定双链DNA的量。这种荧光染料的实例有SYRB GreenI、Taqman探针、分子信标等。
    下面结合附图，示例性说明本发明检测方法的工作原理。
    参照图1，Cu依赖型DNA酶链与底物DNA链杂交形成稳定的复合体，当铜离子存在时，底物DNA链在酶切位点G处被特异性切断，形成两条单链核酸，将其中的一条核酸命名为MP，MP可与捕获探针CP杂交，形成CP‑MP复合体；反之，如样本中不存在Cu，则底物DNA链不会切断，CP会与底物链形成复合体，记为CP‑Cu复合体；
    通过Biotin‑SA的亲和作用将CP‑MP复合体或CP‑Cu复合体分离；
    在加入自组装探针SP1和SP2后，SP1和SP2中的一条与CP‑MP复合体的粘性末端杂交，形成另一粘性末端，SP1和SP2自组装形成长双链DNA，记为CP‑MP‑SP1‑SP2复合体；而CP‑Cu复合体因为底物DNA链含有无法SP1与SP2互补的额外序列，无法进一步形成具有长双链DNA复合体，反应至此结束；
    同样的，通过Biotin‑SA的亲和作用将CP‑MP‑SP1‑SP2复合体清洗分离，去除多余的游离核酸，之后加入SYBR GreenⅠ，通过检测其荧光确定铜离子的量。
    下面结合实施例，进一步说明本发明。
    引物设计：设计合成CP、Cu依赖DNA酶链底物DNA链、Cu依赖DNA酶链、封闭DNA、SP1和SP2，具体的核酸序列如下：

    其中，Cu底物DNA链中下划线标记的G即为酶切位点，靶序列MP为Cu底物DNA链经酶切后的较长序列；MP中下划线标记的部分与CP互补，其余部分与SP1的5’端互补，也可与封闭DNA互补；SP1和SP2中，下划线标记的核酸互补，其余部分亦互补。
    SP1和SP2的自组装：
    用DNA琼脂糖凝胶电泳验证SP1和SP2是否可以自组装形成长双链。从左至右，第一个泳道为DNA的marker，第二，三个泳道中分别加入5μL的1μM SP1和1μM SP2，第四泳道加入5μL（SP1+SP2）混合液，100V恒定电压30min进行电泳，最后结果用成像系统观察。
    实验结果如图2所示。从图中可以清楚地看出，SP1和SP2自组装形成双链DNA。
    铜离子浓度检测方法：
    1)在94μL的10×SSC中，分别加入5μL的DNA酶链(100μM)与1μL的底物链(100μM)，90℃加热变性2分钟，然后室温缓慢冷却1小时，使DNA酶链和底物DNA链充分杂交，得到反应液1；
    2)向一系列不同浓度的铜离子中加入溶液(1)，再分别加入50μM的抗坏血酸钠，得到铜离子的终浓度分别为（10μM,1μM,200nM,50nM,2nM,100pM,20pM,0pM）,室温反应1小时，使铜离子充分的切割底物链，从而释放出靶核酸MP，得到反应液2；
    3)在100μL2mg/ml的链霉亲和素修饰的磁珠（SA‑MBs）中加入捕获探针CP，使其终浓度为1μM；通过磁珠分离去上清，MBs‑CP重悬于100μLTris缓冲液中(50mM，pH7.4，含有0.01%的Tween‑20和0.5%BSA)，得到反应液3；
    4)向反应液2中分别加入10μL的反应液3，室温振荡反应30分钟。磁性分离洗去多余的核酸，用4×SSC重悬后，分别加入1μM的SP1和SP2，室温振荡反应45分钟，磁性清洗，加入SYBR GreenⅠ染色，使用荧光分光光度计检测溶液的荧光信号。
    对不同浓度的铜离子的检测：
    配制一系列不同浓度的铜离子溶液，浓度分别为10μM，1μM，200nM，50nM，2nM，100pM，20pM，0pM，按上述的铜离子浓度检测方法进行铜离子浓度检测，检测结果如图2所示。
    由图3可知，随着铜离子浓度的增加，溶液的荧光强度也随着增加，并且铜离子浓度的对数（logC）与溶液的荧光强度有很好的线性关系。检测铜离子的线性范围是20pM‑1μM，检测限为12.8pM，比美国环境保护局(FDA)规定的检测限(20μM)提高了1000多倍。
    特异性实验：
    按照上述的铜离子浓度检测方法，分别配制10μM不同重金属离子的标准溶液，这些重金属离子分别是Mn2+，Mg2+，Ni2+，Cd2+，Ca2+，Hg2+，Zn2+，Pb2+，Co2+并检测其荧光值。实验结果如图4所示。
    实验结果显示，与空白(blank)的荧光强度比较，除了Pb2+和Co2+会产生稍高的荧光信号，其他金属离子的溶液荧光强度与空白基本一致。而使用1μM的铜离子检测可以产生很高的荧光信号，说明该传感器选择性好，不容易受其他物质的干扰，特异性很好。
    类似的，参照上述方法，也可以使用其他的离子依赖型DNA酶链，配合相应的底物链及自组装探针，同样可以适用于其他离子的浓度检测。

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