一种中药刺激性评价的检测方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 104107439 A (43)申请公布日 2014.10.22 CN 104107439 A (21)申请号 201410363961.9 (22)申请日 2014.07.28 A61K 49/00(2006.01) (71)申请人 南京中医药大学 地址 210046 江苏省南京市栖霞区仙林大道 138 号 (72)发明人 马宏跃 段金廒 龚艳 曹琴 钱大玮 王子月 (74)专利代理机构 南京经纬专利商标代理有限 公司 32200 代理人 杨海军 (54) 发明名称 一种中药刺激性评价的检测方法 (57) 摘要 本发明提供了一种中药刺激性评价的检测方 法， 该方法是。

2、将中药原液或提取液， 皮下注射到实 验动物的足趾， 以动物的提足次数反应药物刺激 所导致的疼痛， 以肿胀度反应药物刺激所引导的 炎症， 结合疼痛和炎症， 综合评价药物的刺激性。 经过对蟾酥、 斑蝥、 华蟾素注射液、 得力生注射液 等2种生药和2种注射液的检验， 表明该方法可有 效地评价药物刺激性的强弱。方法具有灵敏、 直 观、 简便、 快捷的优势， 可广泛用于各种中药刺激 性的评价和检验。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书6页 (10)申请公布号 CN 104107439 A CN 1。

3、04107439 A 1/1 页 2 1. 一种中药刺激性评价的检测方法， 其特征在于， 将药物原液或将药物原液浓缩富集 后， 皮下注入实验动物足趾， 计算提足次数和测量足趾肿胀度来评价中药刺激性。 2. 根据权利要求 1 所述的中药刺激性评价的检测方法， 其特征在于， 药物原液浓缩富 集的方法包括超滤浓缩、 干燥浓缩或离心浓缩。 3. 根据权利要求 1 所述的中药刺激性评价的检测方法， 其特征在于， 药物原液浓缩富 集的倍数为 0.01-100 倍。 4. 根据权利要求 3 所述的中药刺激性评价的检测方法， 其特征在于， 药物原液浓缩富 集的倍数为 10 倍。 5. 根据权利要求 1 所述的。

4、中药刺激性评价的检测方法， 其特征在于， 药物原液的浓度 为 0.01-1000mg/ml。 6. 根据权利要求 5 所述的中药刺激性评价的检测方法， 其特征在于， 药物原液的浓度 为 20mg/ml。 7.根据权利要求1至6任一项所述的中药刺激性评价的检测方法， 其特征在于， 实验动 物为大鼠， 药物注入体积为 0.01-2ml。 8. 根据权利要求 7 所述的中药刺激性评价的检测方法， 其特征在于， 皮下注入药物后， 记录提足反应的产生时间， 并计数首次提足后 10min-30min 内的提足次数。 9. 根据权利要求 8 所述的中药刺激性评价的检测方法， 其特征在于， 所述的药物原液 为。

5、中药、 中成药或中药注射液的原液。 权 利 要 求 书 CN 104107439 A 2 1/6 页 3 一种中药刺激性评价的检测方法 技术领域 0001 本发明涉及一种检测方法， 具体设计一种广泛适用于中药刺激性评价的检测方 法。 背景技术 0002 中药作为有效防治疾病的手段， 其对疾病的治疗理念顺应了二十一世纪医药学发 展的新趋势， 展示出了强大的生命力和广阔的发展前景。中药在当前中西医院临床中的使 用也在明显增加， 特别是中药在西医院临床创新药物中的排名已大大提高。中药的销售额 近年来不断加大， 如文山市的三七， 年销售额近 50 亿。 0003 但是中药在临床使用时经常有不良反应发生。

6、， 具有安全隐患。 不良反应类型多样， 最常发生的是药物刺激性。例如， 华蟾素注射液具有抗肿瘤的作用， 但是对血管有刺激性 ； 六神丸成分较多， 对机体产生一定的刺激性。溶血反应也是药物刺激性反应的一种表现形 式， 例如鱼腥草注射液中吐温 -80 超标容易引起溶血。此外， 还涉及心血管系统、 消化系统、 神经系统、 泌尿系统、 感觉器官、 皮肤及其附件等多个系统的不良反应。一定程度上限制了 中药的用药安全和新药开发。 0004 对于中药刺激性， 有效的检验和检测方法至关重要。近年来关于刺激性评价的动 物模型研究较多， 一般为局部刺激实验， 如兔眼刺激试验等。 但是这些模型缺乏明显直观且 可定量。

7、化的疼痛与炎症指标， 需要发展新的药物刺激性评价方法。本发明利用药物刺激大 鼠足趾模型， 以提足次数 ( 疼痛 ) 和肿胀度 ( 炎症 ) 两个指标来评价药物的刺激性， 建立一 种直观、 简单和实用的中药刺激性评价方法。 发明内容 0005 发明目的 ： 本发明所要解决的技术问题是克服现有技术不能有效检测中药刺激性 的不足， 提供一种具有普适性， 且直观、 方便、 快捷的中药刺激性评价方法。 0006 技术方案 ： 为了实现以上目的， 本发明采取的技术方案为 ： 0007 一种中药刺激性评价的检测方法， 将药物原液或将药物原液浓缩富集后， 皮下注 入实验动物足趾， 计算提足次数， 测量足趾肿胀。

8、度和记录注射药液前后的足趾体积来评价 中药刺激性。 0008 作为优选方案， 以上所述的中药刺激性评价的检测方法， 药物原液浓缩富集的方 法包括超滤浓缩、 干燥浓缩、 离心浓缩。 0009 作为优选方案， 以上所述的中药刺激性评价的检测方法， 药物原液浓缩富集的倍 数为 1-100 倍。更加优选将药物原液浓缩富集 10 倍。 0010 作为优选方案， 以上所述的中药刺激性评价的检测方法， 药物原液的浓度为 0.1-1000mg/ml。特别优选的药物原液的浓度为 20mg/ml。 0011 作为优选方案， 以上所述的中药刺激性评价的检测方法， 实验动物优选大鼠， 注入 体积为 0.01-2ml，。

9、 更加优选的注入体积为 0.1ml。 说 明 书 CN 104107439 A 3 2/6 页 4 0012 作为优选方案， 以上所述的中药刺激性评价的检测方法， 皮下注入药物后， 记 录提足反应的产生时间， 并计数产生提足后 5min-8h 的提足次数， 更加优并首次提足后 10min-30min 内的提足次数。 0013 作为优选方案， 以上所述的中药刺激性评价的检测方法， 所述的药物原液为中药、 中成药或中药注射液的原液。当然本发明也可以用于西药的刺激性评价。 0014 作为优选方案， 以上所述的中药刺激性评价的检测方法， 所述的足趾肿胀胀度可 用足趾肿胀仪来检测。 0015 中药制剂在。

10、生产和存放过程中可能产生微量的刺激性物质， 研究需要高浓度的刺 激性物质。超滤、 冷冻、 离心等方法可以达到浓缩药物的作用， 而超滤是一种有效排除小分 子干扰的技术， 而且 3KD 的超滤管可截留并富集到高浓度刺激物 ； 冷冻干燥是一种把低浓 度水提液干燥至粉末的技术， 可由粉末配制成高浓度刺激物 ； 离心浓缩是一种挥去提取液， 直接浓缩药液的技术。这些浓缩方法具有损耗小、 效率高、 操作便捷的优点， 使药物刺激性 更加明显， 可增加刺激性检测方法的灵敏性。 0016 有益效果 ： 本发明提供的中药刺激性评价的检测方法和现有技术相比具有以下优 点 ： 0017 传统的药物刺激性评价模型为家兔眼。

11、球刺激法， 该方法主观定性观测药物的刺激 性， 无法客观的定量评价药物因此的疼痛和炎症反应。为了实现上述目的， 本发明创新性 采用了药物刺激大鼠足趾模型， 皮下注射药物后， 大鼠出现提足反应， 并且足趾出现明显的 红肿现象。以计数提足次数反应药物刺激的疼痛， 以药物注射前后足部体积的变化反应药 物诱导的炎症， 并总体评估药物的刺激性， 建立一种直观、 准确和广泛的中药刺激性评价方 法。 具体实施方式 0018 下面结合具体实施例， 进一步阐明本发明， 应理解这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围， 在阅读了本发明之后， 本领域技术人员对本发明的各种等价 形式的修改均落于本申请所附。

12、权利要求所限定的范围。 0019 实施例 1 蟾酥生药的刺激性检测 0020 一、 方法 0021 1、 蟾酥生药的提取和配制 0022 称取蟾酥生药粉末 0.3492g 置于玻璃试管中， 加 8ml0.5 DMSO 超纯水超声提 取两次， 20min/ 次， 过滤， 合并滤液。将滤液冷冻干燥至粉末状态， 重 0.1211g， 即得率为 34.68。取冷冻干燥后的粉末 0.0419g， 溶于 0.419ml0.5 DMSO 的水中， 即得浓度为 100mg/ml 的母液， 过滤， 分别配成浓度为 10mg/ml、 20mg/ml、 50mg/ml 的溶液即可。 0023 2、 大鼠足部刺激性试。

13、验 0024 选取雄性 SD 大鼠 40 只， 随机分成 4 组， 即正常组 ( 生理盐水 )、 给药组 (10mg/ml、 20mg/ml、 50mg/ml)， 每组 10 只。 0025 在各组大鼠右后肢踝关节处作一标记， 用排水法测量其右后爪体积。给大鼠右后 足足垫处注射以上四组不同的药物， 每只大鼠注射 0.1ml， 观察大鼠的提足反应， 记录大鼠 开始提足后10min内的提足次数， 测定药物注射30min后大鼠右后足的体积， 并计算大鼠右 说 明 书 CN 104107439 A 4 3/6 页 5 后足实验前后的体积差， 即肿胀度。 0026 肿胀度注射药物后足趾体积注射药物前足趾。

14、体积 0027 二、 结果 0028 配制不同浓度蟾酥生药水提液， 采用上述建立的大鼠足部刺激性检测方法检测。 0029 结果表明， 与生理盐水组相比， 不同浓度蟾酥水提液 (10mg/ml、 20mg/ml、 50mg/ ml)10min 内提足次数显著增加， 分别从不提足增加至 (145、 419、 998) 次 /10min(P 0.01)， 表明大鼠足部疼痛。 0030 并 且 蟾 酥 不 同 浓 度 给 药 组 30min 后 肿 胀 度 也 显 著 增 加， 从 生 理 盐 水 组 (0.0710.009)ml 分别增加至 (0.7020.093、 0.7880.096、 1.02。

15、70.11)ml(P 0.01)， 表明大鼠足部出现炎症现象。 0031 综合提足次数 ( 疼痛 ) 和肿胀度 ( 炎症 ) 两个指标， 反应了蟾酥生药具有较明显 的刺激性。 0032 表 1 不同浓度蟾酥水提液对大鼠刺激性的影响 0033 组别浓度 (mg/ml)提足次数 ( 次 /10min)肿胀度 (ml) 正常组 00.0710.009 蟾酥10145*0.7020.093* 20419*0.7880.096* 50998*1.0270.11* 0034 xs， n 10。*P0.01， 与正常对照组比较。 0035 实施例 2 斑蝥的刺激性检测 0036 一、 方法 0037 1、 。

16、斑蝥生药提供 0038 斑蝥生药浓度为 0.03g/ml， 北京正邦制药有限公司提供。 0039 2、 大鼠足部刺激性试验 0040 雄性 SD 大鼠 20 只， 随机分成 2 组， 即正常组 ( 生理盐水 )、 给药组 (0.03g/ml)， 每 组 10 只。 0041 在各组大鼠右后肢踝关节处作一标记， 用排水法测量其右后爪体积。给大鼠右后 足足垫处注射以上两组不同的药物， 每只大鼠注射 0.1ml， 观察大鼠的提足反应， 记录大鼠 30min 内的提足次数， 测定药物注射 30min 后大鼠右后足的体积， 并计算大鼠右后足实验前 后的体积差， 即肿胀度。 0042 肿胀度注射药物后足趾。

17、体积注射药物前足趾体积 0043 二、 结果 0044 配制浓度为 0.03g/ml 的斑蝥生药， 采用上述建立的大鼠足部刺激性检测方法检 测。 0045 结果表明， 与生理盐水组相比， 斑蝥生药 (0.03g/ml)30min 内提足次数显著增加， 说 明 书 CN 104107439 A 5 4/6 页 6 从不提足增加至 (256152) 次 /30min(P 0.01)， 表明大鼠足部疼痛。 0046 斑蝥给药组30min后肿胀度也显著增加， 从生理盐水组(0.0710.009)ml增加至 (0.1760.051)ml(P 0.01)， 表明大鼠足部出现炎症现象。 0047 综合提足次。

18、数 ( 疼痛 ) 和肿胀度 ( 炎症 ) 两个指标， 反应了斑蝥生药具有较明显 的刺激性。 0048 表 2 斑蝥生药 (0.03g/ml) 对大鼠刺激性的影响 0049 组别提足次数 /30min肿胀度 (ml) 生理盐水组00.0710.009 斑蝥 0.03g/ml 组 256152*0.1760.051* 0050 xs， n 10。*P0.01， 与正常对照组比较。 0051 实施例 3 华蟾素注射液的刺激性检测 0052 一、 方法 0053 1、 中药注射液刺激性部位收集 0054 取华蟾素注射液 20ml， 加入 3KD 超滤管， 3500 转离心 40min， 经反复超滤， 。

19、获得 10 倍浓缩富集的大分子和超滤下层液， 4 度保存。 0055 取华蟾素注射液 5ml， 稀释 1 倍， 4 度保存。 0056 2、 大鼠足部刺激性试验 0057 雄性 SD 大鼠 50 只， 随机分成 5 组， 即正常组 ( 生理盐水 )、 给药组 ( 华蟾素注射液 原液、 华蟾素注射液 0.5 倍浓缩液、 10 倍浓缩液、 10 倍浓缩液下层 )， 每组 10 只。 0058 在各组大鼠右后肢踝关节处作一标记， 用排水法测量其右后爪体积。给大鼠右后 足足垫处注射以上五组不同的药物， 每只大鼠注射 0.1ml， 观察大鼠的提足反应， 记录大鼠 开始提足后10min内的提足次数， 测定。

20、药物注射30min后大鼠右后足的体积， 并计算大鼠右 后足实验前后的体积差， 即肿胀度。 0059 肿胀度注射药物后足趾体积注射药物前足趾体积 0060 二、 结果 0061 配制不同浓度华蟾素注射液， 采用上述建立的大鼠足部刺激性检测方法检测。 0062 结果表明， 与生理盐水组相比， 不同浓度华蟾素注射液 ( 原液、 0.5 倍浓缩液、 10 倍浓缩液、 10 倍浓缩液下层 )10min 内提足次数显著增加， 从不提足分别增加至 (7913、 4313、 8322、 3015) 次 /10min(P 0.01)， 表明大鼠足部疼痛。 0063 不同浓度华蟾素注射液给药组 30min 后肿胀。

21、度也显著增加， 从生理盐水 组 (0.0710.009)ml 分别增加至 (0.5640.051、 0.2670.054、 0.5240.058、 0.4000.031)ml(P 0.01)， 表明大鼠足部出现炎症现象。 0064 综合提足次数 ( 疼痛 ) 和肿胀度 ( 炎症 ) 两个指标， 反应了华蟾素注射液具有较 明显的刺激性。 0065 表 3 不同浓度华蟾素注射液对大鼠刺激性的影响 0066 说 明 书 CN 104107439 A 6 5/6 页 7 组别提足次数 ( 次 /10min)肿胀度 (ml) 生理盐水组00.0710.009 华蟾素注射液原液7913*0.5640.05。

22、1* 0.5 倍浓缩4313*0.2670.054* 10 倍浓缩液8322*0.5240.058* 10 倍浓缩液下层液3015*0.4000.031* 0067 xs， n 10。*P0.01， 与正常对照组比较。 0068 实施例 4 得力生注射液的刺激性检测 0069 一、 方法 0070 1、 得力生注射液配制 0071 将得力生注射液旋转蒸发浓缩成原液的 15 倍。 0072 2、 大鼠足部刺激性试验 0073 雄性SD大鼠20只， 随机分成2组， 即正常组(生理盐水)、 给药组(15倍浓缩液)， 每组 5 只。 0074 在各组大鼠右后肢踝关节处作一标记， 用排水法测量其右后爪体。

23、积。给大鼠右后 足足垫处注射以上两组不同的药物， 每只大鼠注射 0.1ml， 观察大鼠的提足反应， 记录大鼠 30min 内的提足次数， 测定药物注射 30min 后大鼠右后足的体积， 并计算大鼠右后足实验前 后的体积差， 即肿胀度。 0075 肿胀度注射药物后足趾体积注射药物前足趾体积 0076 二、 结果 0077 配制得力生注射液 15 倍浓缩液， 采用上述建立的大鼠足部刺激性检测方法检测。 0078 结果表明， 与生理盐水组相比， 得力生注射液 15 倍浓缩液组 30min 内提足次数显 著增加， 从不提足增加至 (435123) 次 /30min(P 0.01)， 表明大鼠足部疼痛。。

24、 0079 给药组 30min 后肿胀度也显著增加， 从生理盐水组 (0.0710.009)ml 增加至 (0.4580.023)ml(P 0.01)， 表明大鼠足部出现炎症现象。 0080 综合提足次数 ( 疼痛 ) 和肿胀度 ( 炎症 ) 两个指标， 反应了得力生注射液具有明 显的刺激性。 0081 表 4 得力生注射液对大鼠刺激性的影响 0082 组别提足次数 /30min肿胀度 (ml) 生理盐水组00.0710.009 15 倍浓缩液组435123*0.4580.023* 0083 xs， n 10。*P0.01， 与正常对照组比较。 说 明 书 CN 104107439 A 7 6/6 页 8 0084 通过以上实验结果表明， 本发明提供的中药刺激性评价方法， 以提足次数 ( 疼痛 ) 和肿胀度(炎症)两个指标来客观评价药物的刺激性， 是一种直观、 简单和实用的中药刺激 性评价方法， 和现有技术的刺激性评价方法， 更加科学， 客观， 准确。 说 明 书 CN 104107439 A 8 。