罗哌卡因纳米粒及其制备方法以及其效果的优化实验方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 104146972 A (43)申请公布日 2014.11.19 CN 104146972 A (21)申请号 201410427391.5 (22)申请日 2014.08.27 A61K 9/19(2006.01) A61K 31/445(2006.01) A61K 47/34(2006.01) A61P 23/02(2006.01) (71)申请人 王丽萍 地址 350000 福建省福州市鼓楼区西二环北 路 156 号南京军区福州总医院 (72)发明人 王丽萍 陈国忠 黄爱文 宋洪涛 杨建藤 (74)专利代理机构 北京超凡志成知识产权代理 事务所 ( 普通合伙 )。

2、 11371 代理人 吴开磊 (54) 发明名称 罗哌卡因纳米粒及其制备方法以及其效果的 优化实验方法 (57) 摘要 本发明涉及药物制备领域， 具体而言， 涉及罗 哌卡因纳米粒及其制备方法以及其效果优化实验 方法。该罗哌卡因纳米粒的制备方法， 包括如下 步骤 ： (A) 将罗哌卡因游离碱与聚乳酸聚羟乙酸 嵌段共聚物溶解于二氯甲烷中作为有机相， 聚乙 烯醇溶液作为水相 ； (B) 将白色乳液在 30-40条 件下蒸发除去有机相后得到淡蓝色乳光悬浮液 ； (C) 将淡蓝色乳光悬浮液离心分离得到沉淀， 并 将沉淀洗涤、 超声分散、 真空冷冻干燥后即得罗哌 卡因纳米粒。本发明提供的该罗哌卡因纳米粒的。

3、 制备方法， 体外释放研究发现通过这种方法制得 的罗哌卡因纳米粒 96h 内的释放率为 73左右， 缓释效果非常好， 一次给药就能满足术后疼痛等 急性疼痛的镇痛要求。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 8 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书8页 附图1页 (10)申请公布号 CN 104146972 A CN 104146972 A 1/2 页 2 1. 一种罗哌卡因纳米粒的制备方法， 其特征在于， 包括如下步骤 ： (A) 将罗哌卡因游离碱与聚乳酸聚羟乙酸嵌段共聚物溶解于二氯甲烷中作为有机相， 质量百分比浓度。

4、为 1-1.5的聚乙烯醇溶液作为水相， 并将所述有机相缓慢滴加入所述水 相之中在 0-5条件下超声处理得到白色乳液， 其中所述有机相中的聚乳酸聚羟乙酸嵌段 共聚物的质量浓度为 35-75mg/ml， 罗哌卡因的质量浓度为 5-17mg/ml， 所述有机相与所述 水相的油水体积比为 0.05-0.1 ； (B) 将所述白色乳液在 30-40条件下蒸发除去有机相后得到淡蓝色乳光悬浮液 ； (C) 将所述淡蓝色乳光悬浮液离心分离得到沉淀， 并将所述沉淀洗涤、 超声分散、 真空 冷冻干燥后即得罗哌卡因纳米粒。 2.根据权利要求1所述的一种罗哌卡因纳米粒的制备方法， 其特征在于， 所述步骤(A) 中的罗。

5、哌卡因游离碱的具体制备方法为 ： 将罗哌卡因盐酸盐溶于水制成饱和水溶液， 加入 氨水得到沉淀物， 将所述沉淀物洗涤后干燥即得罗哌卡因游离碱。 3.根据权利要求1所述的一种罗哌卡因纳米粒的制备方法， 其特征在于， 所述步骤(A) 中， 其中所述有机相中的聚乳酸聚羟乙酸嵌段共聚物的质量浓度为 35-65mg/ml， 罗哌卡因 的质量浓度为 5-15mg/ml， 所述有机相与所述水相的油水体积比为 0.08-0.1。 4.根据权利要求1所述的一种罗哌卡因纳米粒的制备方法， 其特征在于， 所述步骤(B) 中， 白色乳液进行蒸发操作时采用旋转蒸发仪， 操作时间为 1-1.5h。 5.根据权利要求1所述的。

6、一种罗哌卡因纳米粒的制备方法， 其特征在于， 所述步骤(C) 中， 超声分散时加质量百分比浓度为 15-17的甘露醇溶液。 6.根据权利要求1所述的一种罗哌卡因纳米粒的制备方法， 其特征在于， 所述步骤(C) 中， 真空冷冻干燥的时间为 10-15h。 7. 权利要求 1-4 任一项罗哌卡因纳米粒的制备方法制备出的罗哌卡因纳米粒。 8. 一种罗哌卡因纳米粒的效果优化实验方法， 其特征在于， 包括如下步骤 ： (A)采用Design Expert8.05软件进行星点-效应面优化设计， 将聚乳酸聚羟乙酸嵌段 共聚物的质量浓度(X1)、 罗哌卡因的质量浓度(X2)与油水体积比(X3)经过单因素实验后。

7、的 最优值填入星点设计因素水平表的相应处 ； (B) 然后由上述软件自动安排出实验次数以及每次罗哌卡因的质量浓度、 聚乳酸聚羟 乙酸嵌段共聚物的质量浓度与油水体积比的数值， 完成上述实验并计算出每次实验的载药 量、 包封率以及罗哌卡因纳米粒的粒径 ； (C) 根据以下公式对上述每次实验数据进行非线性拟合， 计算考察指标 OD 的数值， OD b0+b1X1+b2X2+b3X3+b12X1X2+b23X2X3+b13X1X3+b11X12+b22X22+b33X32， 其中 X1-X3代表影响因子， b0 代表截距， b 代表各影响因子的系数 ； (D) 将每次实验计算得出的载药量、 包封率、 。

8、罗哌卡因纳米粒的粒径以及考察指标这四 个数值填入软件中的实验结果表格中， 所述软件根据效应面优化设计自动分析结果得出载 药量、 包封率、 罗哌卡因纳米粒的粒径以及 OD 值这四个指标最优条件下的罗哌卡因的质量 浓度、 聚乳酸聚羟乙酸嵌段共聚物的质量浓度与油水体积比的具体数值 ； (E) 将用优化后的罗哌卡因的质量浓度、 聚乳酸聚羟乙酸嵌段共聚物的质量浓度与油 水体积比的具体数值制备出的罗哌卡因纳米粒进行形态学研究以及体外释放分析实验。 9. 根据权利要求 8 所述的一种罗哌卡因纳米粒的效果优化实验方法， 其特征在于， 在 权 利 要 求 书 CN 104146972 A 2 2/2 页 3 所。

9、述步骤 (E) 之后还包括如下步骤 ： 将用优化后的罗哌卡因的质量浓度、 聚乳酸聚羟乙酸 嵌段共聚物的质量浓度与油水体积比的数值实验做出的罗哌卡因纳米粒的载药量、 包封 率、 罗哌卡因纳米粒的粒径以及 OD 值与所述软件模拟出的结果进行对比以验证软件模拟 的准确性。 10. 根据权利要求 9 所述的一种罗哌卡因纳米粒的效果优化实验方法， 其特征在于， 用 优化后的罗哌卡因的质量浓度、 聚乳酸聚羟乙酸嵌段共聚物的质量浓度与油水体积比的数 值实验做出罗哌卡因纳米粒的平行实验次数为 3-4 次。 权 利 要 求 书 CN 104146972 A 3 1/8 页 4 罗哌卡因纳米粒及其制备方法以及其效。

10、果的优化实验方法 技术领域 0001 本发明涉及药物制备领域， 具体而言， 涉及罗哌卡因纳米粒及其制备方法以及其 效果优化实验方法。 背景技术 0002 术后疼痛是围手术期治疗过程中的一个重要问题。 由于局部麻醉药能可逆性地阻 滞注射部位的神经传导， 使机体某个特定区域产生暂时性的感觉丧失， 因而注射局部麻醉 药是治疗术后疼痛最直接、 有效的镇痛方法。 罗哌卡因属于临床上常用的局麻药， 与其他局 麻药相比具有高度的感觉 - 运动神经分离阻滞特性， 非常适合术后镇痛治疗。 0003 但目前临床上所用的罗哌卡因原药注射剂型半衰期短， 一般一次给药后仅能维持 4-6h 疗效， 难以满足长期镇痛需要。。

11、如采用多次给药或体内导管植入持续给药的方式以满 足长时间的镇痛要求， 由于给药次数过多又会引起药物蓄积和呼吸、 循环的抑制， 引起局麻 药中毒 ； 长时间留置导管容易引起感染或导管移位、 打折， 因此这些方法也并不是解决长时 间镇痛的最好途径。最终如何能研制出一种缓释效果好、 镇痛时间长的新型局麻药剂型才 是当前临床亟待解决的难题。 发明内容 0004 本发明的目的在于提供罗哌卡因纳米粒及其制备方法以及其效果的优化实验方 法， 以解决上述的问题。 0005 本发明实施例提供了罗哌卡因纳米粒的制备方法， 包括如下步骤 ： 0006 (A) 将罗哌卡因游离碱与聚乳酸聚羟乙酸嵌段共聚物溶解于二氯甲烷。

12、中作为有机 相， 质量百分比浓度为 1-1.5的聚乙烯醇溶液作为水相， 并将所述有机相缓慢滴加入所述 水相之中在 0-5条件下超声处理得到白色乳液， 其中所述有机相中的聚乳酸聚羟乙酸嵌 段共聚物 (PLGA) 的质量浓度为 35-75mg/ml， 罗哌卡因 (RVC) 的质量浓度为 5-17mg/ml， 所 述有机相与所述水相的油水体积比为 0.05-0.1 ； 0007 (B) 将所述白色乳液在 30-40条件下蒸发除去有机相后得到淡蓝色乳光悬浮 液 ； 0008 (C) 将所述淡蓝色乳光悬浮液离心分离得到沉淀， 并将所述沉淀洗涤、 超声分散、 真空冷冻干燥后即得罗哌卡因纳米粒。 0009 。

13、本发明实施例提供的罗哌卡因纳米粒的制备方法， 其采用 O/W 乳化 - 溶剂挥发法 制备罗哌卡因纳米粒， 由于这种方法比较适合于亲脂性药物， 那么罗哌卡因盐酸盐原料药 为水溶性药 , 为提高包封率及载药量， 在纳米粒制备中将其还原为罗哌卡因游离碱以后再 进行制备， 而且油水混合时需要控制在 0-5以防止超声设备运转放热损坏纳米粒， 体外释 放研究发现通过这种方法制得的罗哌卡因纳米粒 96h 内的释放率为 73左右， 缓释效果非 常好， 一次给药就能满足术后疼痛等急性疼痛的镇痛要求。 0010 优选地， 所述步骤 (A) 中的罗哌卡因游离碱的具体制备方法为 ： 将罗哌卡因盐酸 说 明 书 CN 。

14、104146972 A 4 2/8 页 5 盐溶于水制成饱和水溶液， 加入氨水得到沉淀物， 将所述沉淀物洗涤后干燥即得罗哌卡因 游离碱， 为提高包封率及载药量使得 RVC 制备纳米粒时更易被包裹， 在纳米粒制备中将其 还原为亲脂性的罗哌卡因游离碱。 0011 优选地， 所述步骤 (A) 中， 其中所述有机相中的聚乳酸聚羟乙酸嵌段共聚物的质 量浓度为 35-65mg/ml， 罗哌卡因的质量浓度为 5-15mg/ml， 所述有机相与所述水相的油水 体积比为0.08-0.1， 这三个因素通过考察发现为对RVC-PLGA-NPS的性质影响较为显著的3 个因素， 因此其具体控制上述的范围内能使得制备出的。

15、纳米粒具有非常高的包封率和载药 量， 以及纳米粒的形态较好。 0012 优选地， 所述步骤 (B) 中， 白色乳液进行蒸发操作时采用旋转蒸发仪， 操作时间为 1-1.5h， 为了使有机相充分蒸发操作时间为一个小时左右。 0013 优选地， 所述步骤 (C) 中， 超声分散时加质量百分比浓度为 15-17的甘露 醇溶液， 甘露醇溶液不仅能在超声分散时提供良好的分散性能， 并且是非常适合于 RVC-PLGA-NPS 纳米粒的冻干支撑剂， 冻干后的纳米粒外观疏松、 饱满。 0014 优选地， 所述步骤 (C) 中， 真空冷冻干燥的时间为 10-15h， 为了便于保存将溶液进 行冷冻干燥成粉末。 00。

16、15 本发明实施例提供的罗哌卡因纳米粒的制备方法制备出的罗哌卡因纳米粒， 其粒 径在 300nm 左右已经达到纳米颗粒级别， 纳米粒外观光滑平整、 表面很多呈蜂窝状的圆孔， 相比于现在一些只能达到微球药物颗粒的产品， 其缓释时间更长， 释放更稳定， 临床使用时 即使用药总量达到正常的 2-3 倍， 也不会引起毒性反应， 危及到病人的生命， 而且其包封率 在 60-80、 载药量在 8-15之间， 性能比较好。 0016 本发明实施例还提供了一种罗哌卡因纳米粒的效果优化实验方法， 包括如下步 骤 ： 0017 (A)采用Design Expert8.05软件进行星点-效应面优化设计， 将聚乳酸聚。

17、羟乙酸 嵌段共聚物的质量浓度(X1)、 罗哌卡因的质量浓度(X2)与油水体积比(X3)经过单因素实验 后的最优值填入星点设计因素水平表的相应处 ； 0018 (B) 然后由上述软件自动安排出实验次数以及每次罗哌卡因的质量浓度、 聚乳酸 聚羟乙酸嵌段共聚物的质量浓度与油水体积比的数值， 完成上述实验并计算出每次实验的 载药量、 包封率以及罗哌卡因纳米粒的粒径 ； 0019 (C) 根据以下公式对上述每次实验数据进行非线性拟合， 计算考察指标 OD 的数 值， OD b0+b1X1+b2X2+b3X3+b12X1X2+b23X2X3+b13X1X3+b11X12+b22X22+b33X32， 其中。

18、 X1-X3代表影响因 子， b0代表截距， b 代表各影响因子的系数 ； 0020 (D) 将每次实验计算得出的载药量、 包封率、 罗哌卡因纳米粒的粒径以及考察指标 这四个数值填入软件中的实验结果表格中， 所述软件根据效应面优化设计自动分析结果得 出载药量、 包封率、 罗哌卡因纳米粒的粒径以及 OD 值这四个指标最优条件下的罗哌卡因的 质量浓度、 聚乳酸聚羟乙酸嵌段共聚物的质量浓度与油水体积比的具体数值 ； 0021 (E) 将用优化后的罗哌卡因的质量浓度、 聚乳酸聚羟乙酸嵌段共聚物的质量浓度 与油水体积比的具体数值制备出的罗哌卡因纳米粒进行形态学研究以及体外释放分析实 验。 0022 本发。

19、明实施例提供的罗哌卡因纳米粒效果的优化实验方法， 采用 Design 说 明 书 CN 104146972 A 5 3/8 页 6 Expert8.05 软件进行星点 - 效应面优化设计实验， 通过优化得出最佳包封率、 载药量、 纳米 粒的粒径条件下的实验条件， 以及通过验证这种优化实验方法准确度高、 误差小， 这种优化 后的实验条件下做出的罗哌卡因纳米粒具有很好的形态特征以及体外释放效果， 为罗哌卡 因纳米粒的优化实验方法提供了可靠、 科学与有效的方法。 0023 优选地， 在所述步骤 (E) 之后还包括如下步骤 ： 将用优化后的罗哌卡因的质量浓 度、 聚乳酸聚羟乙酸嵌段共聚物的质量浓度与油。

20、水体积比的数值实验做出的罗哌卡因纳米 粒的载药量、 包封率、 罗哌卡因纳米粒的粒径以及 OD 值与所述软件模拟出的结果进行对比 以验证软件模拟的准确性。 0024 优选地， 用优化后的罗哌卡因的质量浓度、 聚乳酸聚羟乙酸嵌段共聚物的质量浓 度与油水体积比的数值实验做出罗哌卡因纳米粒的平行实验次数为 3-4 次， 单次实验验证 并不能说明其普遍性， 因此多做几次平行实验以更好的说明软件模拟的准确程度。 附图说明 0025 图 1 示出了本发明实施例罗哌卡因纳米粒的扫描电镜图 ； 0026 图 2 示出了本发明实施例罗哌卡因纳米粒的体外药物释放曲线图。 具体实施方式 0027 下面通过具体的实施例。

21、子并结合附图对本发明做进一步的详细描述。 0028 实施例 1 0029 罗哌卡因纳米粒的制备方法如下 ： 0030 (A) 将罗哌卡因游离碱与聚乳酸聚羟乙酸嵌段共聚物溶解于二氯甲烷中作为有机 相， 聚乙烯醇溶液作为水相， 并将有机相缓慢滴加入水相之中在 0条件下超声处理得到白 色乳液， 其中有机相中的 PLGA 的质量浓度为 35mg/ml， RVC 的质量浓度为 5mg/ml， 有机相与 水相的油水体积比为 0.05。 0031 (B) 将所述白色乳液在 30条件下蒸发除去有机相后得到淡蓝色乳光悬浮液 ； 0032 (C) 将淡蓝色乳光悬浮液离心分离得到沉淀， 并将沉淀洗涤、 超声分散、 。

22、真空冷冻 干燥后即得罗哌卡因纳米粒 RVC-PLGA-NPS。 0033 实施例 2 0034 罗哌卡因纳米粒的制备方法如下 ： 0035 (A) 将罗哌卡因盐酸盐溶于水制成饱和水溶液， 加入氨水得到沉淀物， 将所述沉淀 物洗涤后干燥即得罗哌卡因游离碱 ； 0036 (B) 将罗哌卡因游离碱与聚乳酸聚羟乙酸嵌段共聚物溶解于二氯甲烷中作为有机 相， 质量百分比浓度为 1的聚乙烯醇溶液作为水相， 并将有机相缓慢滴加入水相之中在 5条件下超声处理得到白色乳液， 其中有机相中的 PLGA 的质量浓度为 75mg/ml， RVC 的质 量浓度为 17mg/ml， 有机相与水相的油水体积比为 0.1。 0。

23、037 (C) 将所述白色乳液在 40条件下采用旋转蒸发仪蒸发除去有机相后得到淡蓝 色乳光悬浮液， 旋转蒸发时间为 1.5h ； 0038 (D) 将淡蓝色乳光悬浮液离心分离得到沉淀， 并将沉淀洗涤、 质量百分比浓度为 15的甘露醇溶液超声分散、 真空冷冻干燥 15h 后即得罗哌卡因纳米粒 RVC-PLGA-NPS。 说 明 书 CN 104146972 A 6 4/8 页 7 0039 实施例 3 0040 罗哌卡因纳米粒的制备方法如下 ： 0041 (A) 将罗哌卡因盐酸盐溶于水制成饱和水溶液， 加入质量浓度为 0.9g/ml 的氨水 使其完全沉淀得到沉淀物， 将沉淀物洗涤至中性后在 42。

24、条件下干燥至恒重即得罗哌卡因 游离碱 ； 0042 (B) 将罗哌卡因游离碱与聚乳酸聚羟乙酸嵌段共聚物溶解于二氯甲烷中作为有机 相， 质量百分比浓度为 1.5的聚乙烯醇溶液作为水相， 并将有机相缓慢滴加入水相之中在 2条件下超声处理得到白色乳液， 其中有机相中的 PLGA 的质量浓度为 65mg/ml， RVC 的质 量浓度为 15mg/ml， 有机相与水相的油水体积比为 0.08。 0043 (C) 将所述白色乳液在 37条件下采用旋转蒸发仪蒸发除去有机相后得到淡蓝 色乳光悬浮液， 旋转蒸发时间为 1.5h ； 0044 (D) 将淡蓝色乳光悬浮液离心分离得到沉淀， 并将沉淀洗涤、 质量百分。

25、比浓度为 17的甘露醇溶液超声分散、 真空冷冻干燥 10h 后即得罗哌卡因纳米粒 RVC-PLGA-NPS。 0045 实施例 4 0046 罗哌卡因纳米粒的制备方法如下 ： 0047 (A) 将罗哌卡因盐酸盐溶于水制成饱和水溶液， 加入质量浓度为 0.9g/ml 的氨水 使其完全沉淀得到沉淀物， 将沉淀物洗涤至中性后在 42条件下干燥至恒重即得罗哌卡因 游离碱 ； 0048 (B) 将罗哌卡因游离碱与聚乳酸聚羟乙酸嵌段共聚物溶解于二氯甲烷中作为有机 相， 质量百分比浓度为 1的聚乙烯醇溶液作为水相， 并将有机相缓慢滴加入水相之中在 2条件下超声处理得到白色乳液， 其中有机相中的 PLGA 的。

26、质量浓度为 50mg/ml， RVC 的质 量浓度为 12.5mg/ml， 有机相与水相的油水体积比为 0.08。 0049 (C) 将所述白色乳液在 37条件下采用旋转蒸发仪蒸发除去有机相后得到淡蓝 色乳光悬浮液， 旋转蒸发时间为 1h ； 0050 (D) 将淡蓝色乳光悬浮液离心分离得到沉淀， 并将沉淀洗涤、 质量百分比浓度为 15的甘露醇溶液超声分散、 真空冷冻干燥 10h 后即得罗哌卡因纳米粒 RVC-PLGA-NPS。 0051 实施例 5 0052 罗哌卡因纳米粒的制备方法如下 ： 0053 (A) 将罗哌卡因盐酸盐溶于水制成饱和水溶液， 加入质量浓度为 0.9g/ml 的氨水 使。

27、其完全沉淀得到沉淀物， 将沉淀物洗涤至中性后在 42条件下干燥至恒重即得罗哌卡因 游离碱 ； 0054 (B) 将罗哌卡因游离碱与聚乳酸聚羟乙酸嵌段共聚物溶解于二氯甲烷中作为有机 相， 质量百分比浓度为 1的聚乙烯醇溶液作为水相， 并将有机相缓慢滴加入水相之中在 2条件下超声处理得到白色乳液， 其中有机相中的PLGA的质量浓度为52.82mg/ml， RVC的 质量浓度为 8.04mg/ml， 有机相与水相的油水体积比为 0.1。 0055 (C) 将所述白色乳液在 37条件下采用旋转蒸发仪蒸发除去有机相后得到淡蓝 色乳光悬浮液， 旋转蒸发时间为 1h ； 0056 (D) 将淡蓝色乳光悬浮液。

28、离心分离得到沉淀， 并将沉淀洗涤、 质量百分比浓度为 15的甘露醇溶液超声分散、 真空冷冻干燥 10h 后即得罗哌卡因纳米粒 RVC-PLGA-NPS。 说 明 书 CN 104146972 A 7 5/8 页 8 0057 实施例 6 0058 罗哌卡因纳米粒的效果优化实验方法如下 ： 0059 (A) 将实施例 4 的 PLGA 的质量浓度 (X1)、 RVC 的质量浓度 (X2) 与油水体积比 (X3) 的具体数值填于星点设计因素水平表中的 0 水平的对应行， 然后 Design Expert8.05 软件 设计出实验次数， 以及每次实验的具体实验条件参数， 具体数值见下表 1 前三列，。

29、 软件一共 设计出了20次实验， 而且每次实验的X1-X3值也显示在表中， 只需要对照数据做实验得到相 应的罗哌卡因纳米粒， 并进行计算载药量、 包封率以及罗哌卡因纳米粒的粒径， 也填入相应 的表 1 中的对应列， 为了考察 X1-X3值的相关性以及准确性， 因此软件还会根据 OD b0+b1 X1+b2X2+b3X3+b12X1X2+b23X2X3+b13X1X3+b11X12+b22X22+b33X32进行非线性拟合， ( 其中 X1-X3代表影 响因子， b0代表截距， b 代表各影响因子的系数 )， 所以计算出来的 OD 值也要作为优化实验 的一个优化标准填入表 1 的相应列中， 具体。

30、见下表 1 ： 0060 表 1 星点设计的实验安排和结果 0061 0062 表 2 模型拟合的结果 0063 说 明 书 CN 104146972 A 8 6/8 页 9 0064 从表 1-2 中可以看出， 随着 RVC 和 PLGA 浓度的增加， 纳米粒的包封率和载药量逐 渐增加， 到一定数值时反而随着浓度的增加而下降 ； 而粒径则呈现相反的情况， 即随着浓度 的增加先下降后升高， 主要原因可能是， 随着有机相 PLGA 浓度的增加， 产生了黏滞度大和 内部结构更紧密的有机相， 均质时剪切力相对减小， 同时外水相对其乳化作用相对减弱， 从 而形成较大乳滴， 最终产生粒径较大纳米粒。 0。

31、065 其中， 包封率与载药量的计算方法如下 ： 0066 (1) 检测波长的确定 0067 精密称取 25mg RVC 游离碱， 置 50ml 容量瓶中， 以二氯甲烷 (CH2Cl2) 定容， 得 500ugml-1贮备液， 用移液枪精密量取 1.0ml 贮备液， 置 50ml 容量瓶中， 定容为 10ugml-1RVC 的 CH2Cl2溶液， 作为对照品溶液。分别精密称取 10mg RVC-PLGA-NPS 和空白 纳米粒， 分别置于100ml容量瓶， 并以CH2Cl2定容， 作为样品溶液和辅料溶液。 于200-400nm 波长内进行扫描， 发现 RVC 最大吸收波长为 232nm， 且所。

32、有辅料在该波长处的紫外吸收对测 定结果无干扰， 故选 232nm 为检测波长 ； 0068 (2) 标准曲线的绘制 0069 用移液枪分别精密取 1.0、 1.5、 2.0、 2.5、 3.0ml 步骤 (1) 中制备的 RVC 游离碱贮备 液， 加至50ml容量瓶中， 定容， 配成浓度为10、 15、 20、 25、 30ug ml-1的CH2Cl2溶液。 于232nm 处测定其吸收度A， 以A对质量浓度C进行线性回归， 得回归方程C46.087A+0.745(R2 0.9992)， RVC 检测浓度的线性范围为 10-30ugml-1； 0070 (3) 罗哌卡因纳米粒包封率和载药量的测定。

33、 0071 精密称取适量 RVC-PLGA-NPS， 溶于适量蒸馏水中， 再把该溶液加入五倍 CH2Cl2中， 振荡、 涡旋 10min， 静置后用分液漏斗取下层液， 在 232nm 波长处扫描测得 A， 代入 (2) 中的 标准方程得到纳米粒中 RVC 的含量， 根据测得的一定质量纳米粒中的药物量按照下式计算 载药量和包封率 ： 0072 载药量纳米粒中所含药物量 / 纳米粒的总重量 100。 0073 包封率系统中包封的药量 / 系统中包封与未包封的总药量 100 ； 0074 (4) 包封率和载药量的测定方法的验证性实验 0075 分别精密称取 4、 5、 6mg 的 RVC 游离碱于三。

34、个 10ml 的 EP 管中， 均加入 1ml 空白纳 说 明 书 CN 104146972 A 9 7/8 页 10 米粒再分散液和 5ml 的 CH2Cl2， 振荡、 涡旋 10min， 静置后用分液漏斗取 1ml 下层液于 50ml 容量瓶， 用 CH2Cl2定容， 得浓度为 15、 20、 25ugml-1的样品溶液， 在 232nm 波长处扫描测 得吸光度， 3 种溶液分别测定 3 次， 代入标准方程 , 计算回收率， 分别为 98.44， 99.35， 94.71。 0076 将上述配制的高、 中、 低质量浓度的样品溶液， 用紫外分光光度法于波长 232nm 处 测定吸收度， 分别。

35、于 1 天内测定 5 次及每天测定 1 次， 共测定 5 天， 其高、 中、 低质量浓度溶 液的日内精密度分别为 0.1、 0.2、 0.14， 日间精密度分别为 0.2、 0.3、 0.13。 0077 从回收率与精密度的具体数据可以看出， 本发明所用的如何测定包封率与载药量 的方法是精确度很高的。 0078 (B) 软件会自动模拟出将这 20 次实验的载药量、 包封率、 罗哌卡因纳米粒的粒径 以及OD值这四个指标最优条件下的RVC的质量浓度、 PLGA的质量浓度与油水体积比的具体 数值， 一般软件都会给出 10 个左右最优的对应数值， 其中第一个为最佳值， 具体如下 ： PLGA 的质量浓。

36、度为 52.82mg/ml， RVC 为 8.04mg/ml， 油水体积比为 1:10 ； 0079 (C) 用优化后的 RVC 的质量浓度、 PLGA 的质量浓度与油水体积比的具体数值制备 出的罗哌卡因纳米粒进行形态学研究以及体外释放分析实验 : 0080 纳米粒进行形态学研究结果 ： 取实施例 5 制备的 RVC-PLGA-NPS 适量， 以双蒸水稀 释后， 用 Malvem Zetasizer nano_Zs90 纳米粒度测定仪测定纳米粒的平均粒径及粒径分 布， 纳米粒平均粒径为 (331.22.1)nm， 粒径分布较窄， 多分散系数 (PI) 为 0.045， Zeta 电 位为 8.。

37、341.32， 扫面电镜下观察结果如图 1 所示。 0081 本发明中， 对实施例1-4制备的RVC-PLGA-NPS纳米粒参照上面的方法也进行了形 态学研究， 扫描电镜观察结果和实施例 5 的扫描电镜观察结果很像。 0082 体外释放分析实验过程及结果 ： 0083 实验过程 ： 精密称取实施例 5 制备的 RVC-PLGA-NPS25mg， 装入预先处理好的透析 袋中， 加入 4ml pH7.4 磷酸盐缓冲溶液， 两端扎紧， 放入装有适量体积 pH7.4 磷酸盐缓冲溶 液的具塞玻璃瓶中， 于 37， 气浴恒温振荡 80rpm， 定时取样， 同时补加等温、 同体积的释药 介质 ； 样品溶液以。

38、紫外分光光度法测定光密度， 每个样品重复测定 3 次， 并绘制纳米粒的体 外释放曲线， 同样的实验方法绘制出罗哌卡因盐酸盐的释放曲线。 0084 实验结果 ： 如图 2 所示， 横坐标代表释放时间， 纵坐标代表释放率， 从图中可以看 出， 纳米粒体外释药曲线分为突释、 缓释两个阶段。在突释阶段， RVC 释放几乎呈线性， 8h 累 积释放量达 31.21。这部分 RVC 释放较快， 可能是因为药物吸附在纳米粒表面， 或者以较 弱的作用力结合在纳米粒表层， 从而较易脱落。另外， 溶液内外的浓度差起始较大， 也可能 促使 RVC 的加快释放。随后 96h 内， RVC 体外释药进入缓释阶段， 累积。

39、释放量为 73.4， 这 可能是随着时间的延长， PLGA 出现了生物降解， 而在降解过程中纳米粒表面也不断形成孔 隙， 从而使包裹内部的 RVC 以扩散方式逐渐释放， 从而起到了缓释的效果。 0085 比较两个曲线发现， 96h 内纳米粒的累积释放率达到 73， 而盐酸罗哌卡因在 8h 内的释放率为 82.5， 进一步说明 RVC-PLGA-NPS 具有明显的缓释作用， 同时体外释放曲线 拟合结果为Higuchi释放模型， Higuchi方程为Q23.86+5.05t1/2(R20.9756,t1/2 26.22h)。 0086 本发明中， 对实施例1-4制备的RVC-PLGA-NPS纳米粒。

40、参照上面的方法也测定了其 说 明 书 CN 104146972 A 10 8/8 页 11 体外释放曲线， 所绘制的体外释放曲线和实施例 5 的产品的的体外释放曲线基本一致。 0087 (D) 将实验条件为 ： PLGA 的质量浓度为 52.82mg/ml， RVC 为 8.04mg/ml， 油水体积 比为 1:10 时做出罗哌卡因纳米粒， 平行实验做 3 次后， 测定其载药量、 包封率、 罗哌卡因纳 米粒的粒径与软件模拟出的预测值进行对比， 以验证其选出的最优条件的准确度， 具体结 果见下表 3 ： 0088 表 3 模型准确度验证 0089 指标预测值实测值偏差 ( ) 包封率79.287。

41、4.822.535.06 载药量14.8413.811.356.73 粒径332.1331.212.110.31 OD1.020.980.213.9 0090 注 ： 偏差 ( 预测值 - 测定值 )/ 预测值 100 0091 从上表 3 中可以看出， 优化工艺制备的纳米粒包封率、 载药量和粒径的预测值和 实测值吻合良好且符合设计要求， 说明该方法运用星点设计， 对非线性模式进行设计和研 究， 充分考虑到各影响因素间的交互作用， 同时在中心点进行重复实验， 提高了实验准确 性， 可信度较好， 值得应用和推广。 0092 本发明实施例通过还原罗哌卡因游离碱， 经过星点设计 - 效应面优化法优化。

42、 纳米粒的具体性能参数， 制得纳米粒外观光滑圆整， 表面多孔， 呈蜂窝状， 平均粒径为 (331.212.11)nm， 粒径在 300-350nm 之间的纳米粒占 80， 载药量 (13.811.35)， 包 封率 (74.822.53)。同时体外释放研究发现制得的纳米粒在 96h 内的释放率为 73， 有明显的缓释效果， 为 RVC-PLGA-NPS 的注射缓释剂型等研究奠定基础。 0093 本发明实施例中所用到的药品与设备来源如下 ： 0094 TU-1901双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)， 超声波细胞 粉碎机 ( 宁波新芝生物科技股份有限公司 )， Nicomp38。

43、0 纳米激光粒度及电位仪 ( 美国库尔 特电子仪器公司 )。 0095 盐酸罗哌卡因(批号110502， 纯度99.6)， PLGA(50/50， 深圳绿宝生物有限公司， MW ： 600000， 批号 ： 20130411)， 聚乙烯醇 (PVA， 广州医药化学试剂公司分装， 批号 ： 870827， MW ： 22000， 纯度 ： 88 ) ； 二氯甲烷、 氢氧化钠、 磷酸二氢钾等均为分析纯。 0096 以上所述仅为本发明的优选实施例而已， 并不用于限制本发明， 对于本领域的技 术人员来说， 本发明可以有各种更改和变化。 凡在本发明的精神和原则之内， 所作的任何修 改、 等同替换、 改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。 说 明 书 CN 104146972 A 11 1/1 页 12 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 104146972 A 12 。