一种治疗II型糖尿病或代谢综合征的复方药物组合物.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 104001177 A (43)申请公布日 2014.08.27 CN 104001177 A (21)申请号 201410271356.9 (22)申请日 2014.06.17 A61K 45/00(2006.01) A61K 31/225(2006.01) A61P 3/10(2006.01) A61P 3/00(2006.01) A61K 31/198(2006.01) A61K 31/165(2006.01) (71)申请人 中国药科大学 地址 211198 江苏省南京市龙眠大道 639 号 (72)发明人 傅继华 李涛 郭可可 曲伟 李鑫 安闪闪 马少欣 (。

2、74)专利代理机构 南京苏科专利代理有限责任 公司 32102 代理人 孙立冰 (54) 发明名称 一种治疗 II 型糖尿病或代谢综合征的复方 药物组合物 (57) 摘要 本发明涉及医药领域， 具体涉及一种治疗 II 型糖尿病或代谢综合征的复方药物组合物， 更具 体地， 公开了一种 5- 羟色胺 2 受体拮抗剂沙格雷 酯和 5- 羟色胺合成抑制剂组合的复方药物组合 物， 本发明的复方药物组合物可用于改善胰岛素 抵抗从而治疗 II 型糖尿病和代谢综合征。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 10 页 附图 6 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要。

3、求书1页 说明书10页 附图6页 (10)申请公布号 CN 104001177 A CN 104001177 A 1/1 页 2 1. 一种复方药物组合物， 含有药物活性成分和药学上可接受的载体， 其中药物活性成 分由沙格雷酯和 5- 羟色胺合成抑制剂组成。 2. 权利要求 1 的复方药物组合物， 其中 5- 羟色胺合成抑制剂为对氯苯丙氨酸、 卡比多 巴或苄丝肼。 3. 权利要求 1 的复方药物组合物， 其中沙格雷酯和 5- 羟色胺合成抑制剂的重量比为 15:1 1:15。 4. 权利要求 2 的复方药物组合物， 其中沙格雷酯和对氯苯丙氨酸的重量比为 12:1 1:2。 5. 权利要求 4 的。

4、复方药物组合物， 其中沙格雷酯和对氯苯丙氨酸的重量比为 4:1。 6. 权利要求 2 的复方药物组合物， 其中沙格雷酯和卡比多巴的重量比为 9:1 1:2。 7. 权利要求 6 的复方药物组合物， 其中沙格雷酯和卡比多巴的重量比为 3:1。 8. 权利要求 2 的复方药物组合物， 其中沙格雷酯和苄丝肼的重量比为 8:1 1:3。 9. 权利要求 8 的复方药物组合物， 其中沙格雷酯和苄丝肼的重量比为 2:1。 10.权利要求1至9中任一项的复方药物组合物用于制备治疗II型糖尿病或代谢综合 征的药物的用途。 权 利 要 求 书 CN 104001177 A 2 1/10 页 3 一种治疗 II 。

5、型糖尿病或代谢综合征的复方药物组合物 技术领域 0001 本发明涉及医药领域， 具体涉及 5- 羟色胺 2 受体拮抗剂沙格雷酯和 5- 羟色胺合 成抑制剂组合的复方药物组合物， 本发明的复方药物组合物可用于改善胰岛素抵抗从而治 疗 II 型糖尿病和代谢综合征。 背景技术 0002 胰岛素抵抗 (Insulin resistance,IR) 是指 “各种原因使胰岛素促进细胞摄取 和利用葡萄糖的效率下降， 机体代偿性的分泌过多胰岛素产生高胰岛素血症， 以维持血糖 的稳定” 这种现象。一个具有正常代谢的人， 胰岛素是在进食后由胰腺内的胰岛 细胞 分泌的， 它传递信号给体内的胰岛素感应组织， 使细胞膜。

6、表面产生葡萄糖转运体 (Glucose transporter,GLUT) 吸收葡萄糖从而降低血糖浓度。IR 的主要发生组织为肝脏、 脂肪组织 和骨骼肌。细胞发生 IR 时， 正常水平的胰岛素无法诱导这些细胞产生足够的 GLUT， 从而完 成正常的葡萄糖吸收功能。 为了对此进行补偿， 胰岛需释放更多的胰岛素， 以使足够的细胞 GLUT 被激发来吸收葡萄糖。因此 IR 的主要原因是 “细胞对胰岛素的敏感性降低， 胰岛素诱 导细胞内 GLUT 转运到细胞膜上从而增加葡萄糖吸收的能力下降” 。其病变的本质是细胞内 的， 某种原因使细胞 GLUT 表达能力下降， GLUT 基因或蛋白表达下降， 从而降。

7、低了细胞在胰 岛素刺激下吸收利用葡萄糖的能力， 从而出现 IR。 0003 多种原因可导致 IR， 如肥胖、 长期高血糖、 高游离脂肪酸血症、 高糖皮质素血症、 妊娠和体内胰岛素拮抗激素增多等。但公认的， 肥胖是导致 IR 最主要的原因， 尤其是向中 性肥胖 ； 而高糖皮质素血症、 高游离脂肪酸血症可能是肥胖导致 IR 的直接原因。与 IR 直 接相关的疾病主要有两种 ： 2 型糖尿病 (Diabetes mellitus type2,DM-II) 和代谢综合征 metabolic syndrome,MS)。DM-II 占糖尿病患者 90以上， 病人的主要表现就是肥胖和 IR， 机体胰岛素相对。

8、缺乏， 只有病情恶化、 后期的 DM-II 病人才因为胰岛被破坏出现胰岛素的 绝对缺乏。 MS为多种代谢成分异常聚集的病理状态， 是一组复杂的代谢紊乱症候群， 是导致 糖尿病、 心脑血管疾病(动脉粥样硬化、 中风、 冠心病)的危险因素， 目前认为其集簇发生的 核心是 IR。临床上， 诊断 MS 的主要标准有 ： 腹型肥胖 ( 即向中性肥胖 )、 IR、 高脂血症 ( 高 甘油三酯血症、 高低密度脂蛋白及低高密度脂蛋白血症 )。因此， 改善机体对胰岛素的敏感 性， 降低 IR 成为治疗 DM-II、 MS 的首选。双胍类 ( 如二甲双胍 ) 和噻唑烷二酮类 ( 如罗格 列酮和吡格列酮 ) 是临床。

9、常用的增加胰岛素敏感性、 改善 IR 的药物。 0004 IR 检测的最常用方法 ： 0005 .HOMA-IR指数 HOMA-IR指数全称为 “稳态模型胰岛素抵抗指数” ， 这是衡量机体 IR 最常用的方法， 方法简单、 结论可靠。测量空腹血糖和空腹胰岛素浓度， 计算 HOMA-IR 指 数 (HOMA-IR 空腹血糖 空腹胰岛素 22.5)， 实验时通过与正常对照组比较来确定 IR ； 0006 . 尿糖量测定 如果血糖浓度足够高 ( 超过肾糖阈 )， 可在尿液中检测到葡萄糖 ( 这是糖尿病名称的来由 )。单位时间内人或动物排出的尿液中葡萄糖含量的多少， 可反映 IR 及糖尿病的严重程度，。

10、 尿糖量越高表明 IR 及糖尿病越严重。 说 明 书 CN 104001177 A 3 2/10 页 4 0007 IR 实际上是细胞代谢紊乱的一种表现。IR 时， 机体细胞的糖代谢、 脂代谢都出现 紊乱， 尤其在脂肪细胞、 肝细胞和骨骼肌细胞， 这种能量代谢的紊乱特别明显， 导致脂肪细 胞分泌一些激素样因子紊乱 ( 如瘦素、 抵抗素分泌增加， 脂联素分泌减少 )， 肝细胞脂质沉 积、 炎症因子产生增加等， 骨骼肌细胞对葡萄糖的利用效率降低等。但导致 IR 的本质原因 目前是不清楚的， 虽然发现糖皮质素、 游离脂肪酸、 一些炎症因子 ( 如肿瘤坏死因子 ) 可 直接导致细胞产生 IR、 抑制 。

11、GLUT 的细胞内表达， 但它们是通过什么途径、 怎样改变细胞内 的代谢通路及信号通路从而导致 IR 的？是否存在一种共同的作用特点？目前并未弄清。 我们的研究发现， 糖皮质素、 游离脂肪酸导致 IR 时存在共同的作用特点 ： 引起肝细胞、 脂肪 细胞及骨骼肌细胞 5- 羟色胺合成或受体表达发生改变 ； 通过逆转细胞的 5-HT 系统改变能 够阻断这些因素导致的 IR。 0008 5- 羟色胺 (5-hydroxy tryptamine,5-HT) 也叫血清素， 是一种存在于外周和中枢 的小分子物质， 5-HT 的生理功能复杂， 至今未完全弄清。 0009 .5-HT 的 合 成 分 两 步，。

12、 第 一 步 ： 色 氨 酸 在 色 氨 酸 羟 化 酶 (tryptophan hydroxylase,TPH) 的催化下转变为 5- 羟色氨酸 (TPH 可分为两个亚型 ： TPH1 和 TPH2， TPH1 存在于外周， TPH2 存在于中枢 ) ； 第二步 ： 5- 羟色氨酸在芳香族氨基酸脱羧酶 (aromatic aminoacid decarboxylase,AADC)的催化下转变为5-HT。 因此， 可分别通过抑制TPH或AADC 实现对 5-HT 合成的抑制。 0010 对氯苯丙氨酸 (parachlorophenylalanine 或 p-chlorophenylalanin。

13、e,pCPA)， 别 名:DL-4-氯苯丙氨酸、 DL-对氯苯丙氨酸等， 分子式 ： C9H10ClNO2， 是TPH抑制剂， 无临床应用 报导。 0011 卡比多巴 (Cabidoba,CDP)， 分子式 ： C10H14N2O4。 0012 苄丝肼 (Benserazide,BSA)， 别名 ： 三羟基丝氨酰肼、 色拉肼、 丝氯酰肼、 羟苄丝 肼， 分子式 ： C10H15N3O5。 0013 CDP和BSA都是AADC抑制剂， 临床用于帕金森氏病的辅助治疗， 它们的共同作用特 点是外周脱羧酶抑制剂， 不易进入中枢， 仅抑制外周左旋多巴转化为多巴胺， 使循环中左旋 多巴含量增加， 也可抑制。

14、 5- 羟色氨酸转化为 5-HT， 使合成 5-HT 的细胞产生 5-HT 减少。CDP 和 BSA 也没有用于改善 IR， 从而治疗 DM-II 或 MS 的研究报导。 0014 .5-HT 受体 5-HT 受体 (5-HT receptor,5-HTR) 存在于细胞膜上， 属于膜受体， 5-HT 受体亚型复杂， 现已发现有 7 大类受体存在， 即 5-HT1-7R， 5-HT1,4,5R 主要分布在中枢， 5-HT2,3,6,7R 主要分布在外周。这 7 类受体又被进一步分为若干个亚型。5-HT2R 可被分为 5-HT2AR、 5-HT2BR 和 5-HT2CR。外周和中枢均有分布的是 5。

15、-HT2A,2BR， 5-HT2CR 主要存在于中枢 神经系统， 肝脏、 骨骼肌、 内脏脂肪组织分布有 5-HT2A,2BR。具有选择性阻断 5-HT2R 的药物不 多， 已知沙格雷酯属于选择性 5-HT2R 拮抗剂。 0015 沙格雷酯 (Sarpogrelate,SAR) 是一种专一性 5-HT2R 阻断剂， 分子 ： C24H31NO6。临 床应用中， SAR 可抑制由 5-HT 增强的血小板凝集及抑制血管收缩作用等， 临床用于改善慢 性动脉闭塞症所引起的溃疡、 疼痛以及冷感等缺血性诸症状。虽然临床有 SAR 治疗糖尿病 性并发症下肢动脉硬化闭塞症的报导， 但没有可以改善 IR 的研究报。

16、导。 发明内容 说 明 书 CN 104001177 A 4 3/10 页 5 0016 本发明公开了一种 5- 羟色胺 2 受体拮抗剂沙格雷酯和 5- 羟色胺合成抑制剂组合 的复方药物组合物， 该组合物具有协同改善胰岛素抵抗从而可用于治疗 II 型糖尿病和代 谢综合征。 0017 所述的 5- 羟色胺合成抑制剂优选对氯苯丙氨酸、 卡比多巴或苄丝肼。 0018 沙格雷酯和 5- 羟色胺合成抑制剂的重量比优选 15:1 1:15。 0019 沙格雷酯和对氯苯丙氨酸的重量比更优选为 12:1 1:2。 0020 沙格雷酯和卡比多巴的重量比更优选为 9:1 1:2。 0021 沙格雷酯和苄丝肼的重量。

17、比更优选为 8:1 1:3。 0022 我们在研究中发现 ： 0023 . 肝细胞及脂肪细胞均存在 5-HT 合成系统 (TPH1,AADC)。糖皮质激素类药 物 - 地塞米松 (dexamethasone,DEX) 或脂肪酸 ( 油酸， oleic acid,OA) 刺激在导致肝细胞 产生 IR 时 (GLUT 受体表达被下调 )， 同时也存在 5-HT 合成系统被上调、 细胞内 5-HT 含量 增加 ； 在 DEX 导致大鼠发生 IR 的实验中， 同时观察到肝脏及内脏脂肪 TPH1、 AADC 表达被上 调、 5-HT 含量升高， 即两种组织中 5-HT 合成增加 ； 0024 .肝细胞、。

18、 脂肪细胞及骨骼肌细胞均存在5-HT2A,2BR表达， 体外培养肝细胞用DEX 或 OA 刺激， 或动物实验用 DEX 刺激建立 IR 动物模型时， 三种组织 5-HT2A,2B受体表达均被明 显上调， 并同步地出现 IR 症状。 0025 . 体外细胞培养实验时， 用 DEX 或 OA 刺激建立肝细胞 IR 模型， 5-HT 合成抑制 剂pCPA、 CDP、 BSA， 5-HT2R 阻断剂 -SAR 均可明显抑制 DEX 或 OA 导致的 GLUT 基因表达被 下调， 而 SAR 与 pCPA 或 CDP 或 BSA 联用， 则使 GLUT 被进一步上调， 显示出协同效应。 0026 . 动。

19、物实验研究时， 用 DEX 刺激建立 IR 动物模型， 用 SAR+pCPA、 SAR+CDP、 SAR+BSA 按两种药物不同的重量配比组成不同的复方对模型进行治疗。结果表明， DEX 导 致的 IR( 高血糖、 高血胰岛素浓度， HOMA-IR 指数升高， 明显的尿糖含量 ) 被明显逆转， 表现 为 ： 血糖、 血胰岛素浓度降低， HOMA-IR 指数减小， 尿液中葡萄糖含量减少。并且， SAR+pCPA、 SAR+CDP、 SAR+BSA 三种复方按药物一定的重量配比， 对治疗 IR 显示出明显的协同作用， 联 合用药能明显提高药物疗效。其中， SAR+pCPA 复方产生协同作用疗效的药。

20、物重量比为 ： 12:1 1:2 时效果更佳 ； SAR+CDP 复方产生协同作用疗效的药物重量比为 ： 9:1 1:2 时效 果更佳 ； SAR+BSA 复方产生协同作用疗效的药物重量比为 ： 8:1 1:3 时效果更佳。并且， 所选SAR+pCPA复方， 以重量配比为4:1的复方疗效最好 ； 所选SAR+CDP复方， 以重量配比为 3:1 的复方疗效最好 ； 所选 SAR+BSA 复方， 以重量配比为 2:1 的复方疗效最好。 0027 综上所述， 用沙格雷酯与 5- 羟色胺合成抑制剂如对氯苯丙氨酸或卡比多巴或苄 丝肼在一定的重量比范围内组成复方， 对改善胰岛素抵抗有明显的协同作用， 可用。

21、于因胰 岛素抵抗引起的 2 型糖尿病或代谢综合征的治疗。 0028 本发明的复方药物组合物通过添加药学上可接受的载体制备成适合临床使用的 剂型， 如片剂、 胶囊、 液体制剂等。 所述药学上可接受的载体如崩解剂、 稀释剂、 粘合剂、 润滑 剂等。 0029 下面通过实施例对本发明的复方药物组合物做进一步的药效学实验结果的阐述。 附图说明 说 明 书 CN 104001177 A 5 4/10 页 6 0030 图 1 是 DEX 或 OA 对体外培养肝细胞 TPH1、 AADC、 5-HT2AR、 5-HT2BR 基因表达的影响 (A) 及 DEX 或 OA 刺激对体外培养肝细胞 5-HT 含量。

22、的影响 (B)(N 3) 0031 图 2 是在 DEX 导致的体外培养肝细胞 GLUT2 基因表达下调模型， SAR、 pCPA、 CDP、 BSA 治疗可逆转这种下调， 而 SAR 与 pCPA、 CDP、 BSA 联合用药则进一步加大这种逆转效应 (A)， 在 OA 导致的肝细胞 GLUT2 基因表达下调模型， 这种效应也存在 (B)(N 3) 0032 图 3 是在 DEX 导致肝细胞 5-HT 含量升高时， 用 pCPA、 CDP、 BSA 治疗可明显抑制这 种效应， 而 SAR 没有抑制作用， 且 SAR 与 pCPA、 CDP、 BSA 联合给药也没有协同作用 (A)， 在 OA。

23、 导致肝细胞 5-HT 含量升高时， 也存在这种效应 (B)(N 3) 0033 图 4 是大鼠连续给 DEX15 天后肝脏、 脂肪组织 TPH1、 AADC 蛋白表达明显上调 ( 骨 骼肌未见 TPH1、 AADC 表达 )(A) 及大鼠连续给 DEX15 天后肝脏、 脂肪组织 5-HT 含量明显升 高， 而用 pCPA、 CDP、 BSA 治疗时则 5-HT 含量明显降低 (B)(N 6) 0034 图5是大鼠连续给DEX15天后肝脏、 脂肪组织、 骨骼肌5-HT2AR、 5-HT2BR基因表达明 显上调 0035 图6是大鼠连续给DEX15天后肝脏GLUT2、 脂肪组织及骨骼肌GLUT4。

24、基因表达明显 下调， 用 SAR、 pCPA、 CDP、 BSA 治疗明显上调 GLUT2、 GLUT4 基因表达 具体实施方式 0036 实施例 1 0037 肝细胞体外细胞培养研究 0038 “肝细胞 5-HT 合成系统、 5-HT2A,2B受体基因表达、 GLUT 基因表达， 在 DEX 或 OA 刺激 时的改变 ； 及抑制 5-HT 合成或阻断 5-HT2A,2B受体 (5-HT2A,2BR) 时对 DEX 或 OA 导致的 IR 的 改善作用” 研究结果。 0039 1.1 实验方法 0040 (1) 细胞培养 0041 大鼠 BRL-3A 肝细胞株体外培养， 实验在细胞传代之 10。

25、-20 代时完成。细胞培养 在 37、 含 5 CO2的培养箱中， 用含 10胎牛血清的 PRMI-1640 培养基培养， 并用青霉素 / 莲霉素联合抗菌。细胞接种浓度 5105个 / 瓶， 培养 24 小时后待细胞增殖达到 70-80 瓶底面积时可进行给药。分别用地塞米松 (DEX) 或油酸 (OA) 刺激建立 IR 细胞模型。DEX 刺激IR模型给药分组 ： 对照组正常培养基培养， DEX刺激模型组培养基中加入30M/L DEX， pCPA 组 - 培养基中加入 30M/L DEX 及 25M/L pCPA， CDP 组 - 培养基中加入 30M/ L DEX 及 25M/LCDP， BS。

26、A 组 - 培养基中加入 30M/L DEX 及 25M/L BSA， SAR 治疗组 - 培 养基中加入 30M/LDEX 及 25M/L SAR， SAR 与 pCPA 联合给药组 - 培养基中加入 30M/L DEX 及 25M/LSAR+25M/L pCPA， SAR 与 CDP 联合给药组 - 培养基中加入 30M/L DEX 及 25M/LSAR+25M/L CDP， SAR 与 BSA 联合给药组 - 培养基中加入 30M/L DEX 及 25M/ LSAR+25M/L BSA ； OA 刺激 IR 模型给药分组 ： 对照组正常培养基培养， OA 刺激模型组 培养基中加入 200。

27、M/L OA， pCPA 组 - 培养基中加入 200M/L OA 及 25M/L pCPA， CDP 组 - 培养基中加入 200M/L OA 及 25M/L CDP， BSA 组 - 培养基中加入 200M/L OA 及 25M/LBSA， SAR 治疗组 - 培养基中加入 200M/L OA 及 25M/L SAR， SAR 与 pCPA 联合 说 明 书 CN 104001177 A 6 5/10 页 7 给药组 - 培养基中加入 200M/L OA 及 25M/L SAR+25M/L pCPA， SAR 与 CDP 联合给药 组-培养基中加入200M/L OA及25M/L SAR+2。

28、5M/L CDP， SAR与BSA联合给药组-培 养基中加入 200M/L OA 及 25M/L SAR+25M/L BSA。所有实验组培养 48 小时后用裂解 液裂解细胞， 所得溶液可进行进一步实验， 用于细胞内物质含量检测及 PCR 试验。 0042 (2) 给药剂量 0043 地塞米松 (DEX)-30M/L 0044 对氯苯丙氨酸 (pCPA)-25M/L 0045 卡比多巴 (CDP)-25M/L 0046 苄丝肼 (BSA)-25M/L 0047 沙格雷酯 (SAR)-25M/L 0048 油酸 (OA)-200M/L 0049 1.2 实验指标检测方法 0050 (1) 细胞 5。

29、-HT 含量检测 0051 酶联免疫法 (ELISA) 检测 5-HT 含量。 0052 (2)TPH1、 AADC、 5-HT2A,2B受体、 GLUT2 基因表达检测 0053 肝细胞相关因子基因表达 ： 逆转录 PCR 技术检测 TPH1、 AADC、 5-HT2A,2B 受体 (5-HT2AR， 5-HT2BR)、 GLUT2 基因 (mRNA) 表达。其中， 肝细胞 GLUT 为 GLUT2。引物 ： 0054 THP1 上游引物 5ACTGCGACATCAACCGAGAA3 0055 下游引物 5GGCTAACCCTGACAGGAAAT3 0056 AADC 上游引物 5 AGAA。

30、CTGACCTAACCGAAGC3 0057 下游引物 5 CAGACCAACCCGAGGATGAC3 0058 5-HT2AR 上游引物 5GGATTTACCTGGATGTGC3 0059 下游引物 5TGGATGGACCGTTGGAAG3 0060 5-HT2BR 上游引物 5CAGCAGCAGAGGAAATGA3 0061 下游引物 5ATCCAGGGAAATGGCACA3 0062 GLUT2 上游引物 5GGTGTTGCTGGATAAGTTCA3 0063 下游引物 5AGGATTCGAGTTAAGAGGGA3 0064 内参 GAPDH 上游引物 5TATCGGACGCCTGGTT。

31、AC3 0065 下游引物 5TGCTGACAATCTTGAGGGA3 ； 0066 1.3 实验结果 0067 所有数据统计学检测用组间 Student-t 检测， p0.05 表示有明显统计学差异， p0.01 表示有非常明显统计学差异。下列所有图中数据用均值 标准差表示 ,N 3 ； *p0.05,*p0.01 与对照组比较 ； $p0.05,$p0.01 与 DEX 或 OA 刺激模型组比较 ； #p0.05,#p0.01联合用药与SAR单用药比较 ； &p0.05,&p0.01联合用药与pCPC或CDP 或 BSA 单用药比较。 0068 (1)DEX 刺激或 OA 刺激导致肝细胞 。

32、IR 时存在明显的 5-HT 合成增加及 5-HT2A,2BR 表达上调 0069 结果见图 1。可见， 正常肝细胞存在 5-HT 合成酶 TPH1、 AADC 基因表达， 并且检测 到5-HT含量， 还检测到5-HT2A,2BR基因表达 ； DEX刺激或OA刺激后， 肝细胞5-HT合成增加 说 明 书 CN 104001177 A 7 6/10 页 8 5-HT 含量增加、 TPH1、 AADC、 5-HT2A,2BR 基因表达被上调。提示肝细胞在 DEX 或 OA 刺激时， 5-HT 合成系统被激活、 5-HT2A,2BR 被上调。 0070 (2)SAR 与 pCPA、 CDP、 BSA。

33、 联用对改善 DEX 或 OA 导致的肝细胞 IR 具有协同作用 0071 SAR、 pCPA、 CDP、 BSA 单独给药均可明显逆转 DEX 或 OA 刺激导致的肝细胞 GLUT2 基 因表达下调 ； SAR 与 pCPA、 CDP、 BSA 联合用药的疗效更加明显， 显示出明显的协同增效作用， GLUT2 的基因表达相对量已接近对照组。结果见图 2。 0072 对 DEX 或 OA 导致的肝细胞 5-HT 含量升高， pCPA、 CDP、 BSA 均有抑制作用， 使肝细 胞内 5-HT 含量下降。SAR 没有这种作用， 且 SAR 与 pCPA、 CDP、 BSA 联合给药也没有协同作 。

34、用。结果见图 3。 0073 结果表明， 肝细胞5-HT合成增加及5-HT2A,2BR表达上调是DEX或OA导致肝细胞IR 时的共同特点， 可能是导致IR的共同原因 ； 通过抑制细胞的5-HT合成， 或通过阻断5-HT2A,2B 受体， 可独立地改善 DEX 或 OA 导致的肝细胞 IR ； 当同时抑制 5-HT 合成及阻断 -HT2A,2B受体 时， 则对 DEX 或 OA 导致的肝细胞 IR 的改善效应有协同作用。 0074 实施例 2 0075 动物实验研究DEX 导致的大鼠 IR 及糖尿病模型 0076 比较 SAR 与 pCPA、 CDP、 BSA 联合给药， 及各自单独给药对 DE。

35、X 致大鼠 IR 及糖尿病 模型的治疗作用， 从而验证 SAR 与 pCPA、 CDP、 BSA 联合给药对 IR 及糖尿病治疗的协同效应。 0077 2.1 实验方法 0078 (1) 动物处理 0079 108 只雄性 Wistar 大鼠随机分为 18 组 ( 每组 6 只 ) ： 对照组， IR 模型组， IR 模型 SAR 治疗组， IR 模型 SAR+pCPA 复方治疗组 (SAR:pCPA 按不同重量配比的 4 种复方 )， IR 模 型 pCPA 治疗组， IR 模型 SAR+CDP 复方治疗组 (SAR:CDP 按不同重量配比的 4 种复方 )， IR 模型 CDP 治疗组， 。

36、IR 模型 SAR+BSA 复方治疗组 (SAR:BSA 按不同重量配比的 4 种复方 )， IR 模型 BSA 治疗组。动物笼养于普通鼠笼， 保持室温 242、 光照控制保证 12h 明、 暗条件， 普通水喂养， 连续给药 15 天。 0080 实验中， SAR+pCPA 复方按不同重量配比的四种复方为 ： 0081 SAR+pCPA-1SAR:pCPA 12:1 ； SAR+pCPA-2SAR:pCPA 4:1 ； 0082 SAR+pCPA-3SAR:pCPA 1:1 ； SAR+pCPA-4SAR:pCPA 1:2。 0083 实验中， SAR+CDP 复方按不同重量配比的四种复方为 。

37、： 0084 SAR+CDP-1SAR:CDP 9:1 ； SAR+CDP-2SAR:CDP 3:1 ； 0085 SAR+CDP-3SAR:CDP 1:1 ； SAR+CDP-4SAR:CDP 1:2。 0086 实验中， SAR+BSA 复方按不同重量配比的四种复方为 ： 0087 SAR+BSA-1SAR:BSA 8:1 ； SAR+BSA-2SAR:BSA 2:1 ； 0088 SAR+BSA-3SAR:BSA 1:1 ； SAR+BSA-4SAR:BSA 1:3。 0089 (2) 给药剂量 0090 对照组皮下注射(s.c.)生理盐水0.50ml/kg/次， 并经口给药(p.o.)。

38、0.5羧甲 基纤维素钠 (CMC-Na) 溶液 5.0ml/kg/ 次 ； 0091 IR 模型组s.c.DEX0.75mg/kg/ 次， 并同时 p.o.CMC-Na5.0ml/kg/ 次 ； 0092 IR 模型药物治疗组s.c.DEX0.75mg/kg/ 次， 并同时 p.o. 各组药物， 所有给药组 说 明 书 CN 104001177 A 8 7/10 页 9 给药剂量均相同为 ： 20.0mg/kg/ 次。 0093 各药物用 0.5 CMC-Na 混悬， 浓度相同均为 ： 4.0mg/ml ； DEX s.c. 给药容积为 0.50ml/kg/ 次， 各组药物 p.o. 给药容积。

39、为 5.0ml/kg/ 次 ； 每天给药两次， 上下午各给药一 次。 0094 (3)HOMA-IR 指数计算 0095 连续给药第 15 天， 各组动物首先禁食 ( 不禁水 )12 小时， 然后取血， 测空腹血糖、 空腹胰岛素浓度， 计算 HOMA-IR 指数 (HOMA-IR 空腹血糖 空腹胰岛素 22.5)。 0096 (4) 尿糖含量检测 0097 连续给药第 15 天， 最后一次给药前禁食约 7 小时， 然后各组按要求分别给以 DEX 及相应药物， 给药后迅速将动物放入代谢笼中， 自由饮水， 收集给药后 5 小时内尿量， 测量 尿液中葡萄糖浓度， 计算 5 小时内尿液中葡萄糖含量。 。

40、0098 连续给药15天后动物禁食12小时， 麻醉， 取血、 取肝脏、 取内脏脂肪组织及取大腿 部骨骼肌， 以检测血清及组织相关生化指标。 0099 2.2 实验指标检测方法 0100 (1) 血清及组织生化指标检测 0101 ELISA法检测血清、 肝脏、 脂肪组织5-HT水平， ELISA法检测血清胰岛素浓度， 分光 光度法检测血糖浓度、 尿糖含量。 0102 (2)GLUT2、 GLUT4、 5-HT2A,2B 受体基因表达检测 0103 肝脏、 脂肪组织及骨骼肌相关因子基因表达 ： 逆转录 PCR 技术检测 GLUT2、 GLUT4 基因 (mRNA) 表达。其中， GLUT2 存在于。

41、肝细胞， GLUT4 存在于脂肪细胞及骨骼肌。5-HT2AR、 5-HT2BR、 GLUT2、 内参 GAPDH 引物物同细胞实验， GLUT4 引物如下 ： 0104 GLUT4 上游引物 5TCCAGGATGAAGGAAACAGC3 0105 下游引物 5GCGAGGCAAGGCTAGATTTT3。 0106 (3)TPH1、 AADC 蛋白表达检测 0107 肝脏、 脂肪组织及骨骼肌TPH1、 AADC蛋白表达检测 ： Western blot法。 采用细胞膜 蛋白抽提试剂盒提取细胞膜蛋白， 通过 SDS-PAGE 凝胶电泳对不同分子量大小的蛋白进行 分离后， 电转将所需分子量的蛋白转移。

42、到 PVDF 膜上， 转膜结束后对膜进行封闭 2 小时。取 出 PVDF 膜， 分别用 TPH1、 AADC、 ATP1A1 蛋白抗体 ( 一抗 ) 孵育 PVDF 膜， 于 4过夜 ； 再用对 应的辣根酶标记二抗对 PVDF 膜进行孵育 2 小时。加入化学发光液反应后， 将 PVDF 膜放入 Tanon5200 成像系统进行曝光显影检测。 0108 2.3 实验结果 0109 所有数据统计学检测用组间 Student-t 检测， p0.05 表示有明显统计学差异， p0.01 表示有非常明显统计学差异。下列所有图中数据用均值 标准差表 示 ,N 6 ； *p0.05,*p0.01 与 对 照。

43、 组 比 较 ； $p0.05,$p0.01 与 DEX 模 型 组 比 较 ； #p0.05,#p0.01联合用药与SAR单用药比较 ； &p0.05,&p0.01联合用药与pCPC或CDP 或 BSA 单用药比较。 0110 (1)DEX致大鼠IR模型中， 肝脏、 内脏脂肪及骨骼肌5-HT合成系统TPH1、 AADC蛋 白表达的改变 0111 结果见图4。 可见， 正常大鼠肝脏、 内脏脂肪存在TPH1、 AADC蛋白表达， 但骨骼肌未 说 明 书 CN 104001177 A 9 8/10 页 10 见表达 ； 在 DEX 导致大鼠 IR 及糖尿病时， 肝脏及脂肪组织两种酶的蛋白表达明显上。

44、调。相 应地检测到两种组织中 5-HT 含量明显升高， 用 pCPA 或 CDP 或 BSA 抑制 5-HT 合成后 5-HT 含量明显降低。 0112 (2)DEX 致大鼠 IR 模型中， 肝脏、 内脏脂肪及骨骼肌 5-HT2A,2BR 基因表达的改变 0113 结果见图5。 正常大鼠肝脏、 内脏脂肪及骨骼肌存在5-HT2A,2BR基因表达 ； 在DEX导 致大鼠 IR 时， 三种组织 5-HT2A,2BR 基因表达明显上调。 0114 (3) 抑制 5-HT 合成或阻断 5-HT2A,2BR， 对 DEX 致大鼠 IR 模型肝脏、 内脏脂肪及骨 骼肌 GLUT 基因表达的影响 0115 结。

45、果见图 6。在 DEX 致大鼠 IR 模型中， 肝脏 GLUT2， 内脏脂肪及骨骼肌 GLUT4 基因 表达明显下调 ； 用 SAR、 pCPA、 CDP、 BSA 治疗明显上调 GLUT2、 GLUT4。 0116 (4)SAR+pCPA 复方对 DEX 导致的 IR 的治疗作用研究结果 0117 结果见表1。 DEX致IR模型中， 动物空腹血糖浓度、 空腹血胰岛素浓度均明显升高， HOMA-IR 指数明显升高， 且收集 5 小时内排出的尿液可检测到大量葡萄糖含量， 提示出现严 重的 IR 及糖尿病症状。用相同给药剂量的 SAR， pCPA， SAR+pCPA 四种复方 ： SAR+pCPA。

46、-1、 SAR+pCPA-2、 SAR+pCPA-3、 SAR+pCPA-4 对 DEX 导致的 IR 进行治疗， 均能明显降低血糖浓度、 血胰岛素浓度及 HOMA-IR 指数， 并且明显减少 5 小时内排出的尿糖量 ； 复方 SAR+pCPA-2、 SAR+pCPA-3 治疗均显示其降血糖、 降血胰岛素、 减小 HOMA-IR 指数及减少尿糖量作用明显 好于 SAR 或 pCPA 单独治疗， 提示产生明显的协同效应 ； 复方 SAR+pCPA-1 治疗的降血糖、 降 血胰岛素、 减小 HOMA-IR 指数及减少尿糖量作用明显好于 pCPA 治疗， 与 SAR 治疗比较虽然 没有差异但也有更好。

47、的疗效趋势 ； 复方 SAR+pCPA-4 治疗的降血胰岛素及减少尿糖量作用 明显好于 pCPA 治疗， 降血糖、 减小 HOMA-IR 指数作用也显示出比 pCPA 治疗有更好的疗效趋 势， 且其疗效与 SAR 治疗相当。结果提示， SAR 与 pCPA 组成一定比例的复方， 对治疗 IR 有 明显的协同作用， 按重量配比， SAR:pCPA 的比例范围为 ： 12:1 1:2， 本实验中以 4:1 复方 (SAR+pCPA-2) 疗效最好。 0118 表 1 大鼠连续给 DEX15 天后， 以及用 SAR、 SAR+pCPA 四种复方、 pCPA 治疗后， 空腹 血糖浓度、 空腹胰岛素浓度。

48、、 HOMA-IR 指数及 5 小时内尿糖量检测结果 0119 说 明 书 CN 104001177 A 10 9/10 页 11 0120 0121 注 ： 各给药组给药剂量相同， 均为 20.0mg/kg. 次， 一天两次， 上下午各一次 0122 $:P0.01, 与对照组比较 ； *:P0.05,*:P0.01, 与模型组比较 ； 0123 #:P0.05,#:P0.01, 与 SAR 组比较 ； &:P0.05,&:P0.01, 与 pCPA 组比较 0124 (5)SAR+CDP 复方对 DEX 导致的 IR 的治疗作用研究结果 0125 结果见表 2。用相同给药剂量的 SAR， CDP， SAR+CDP 四种复方 ： SAR+CDP-1、 SAR+CDP-2、 SAR+CDP-3、 SAR+CDP-4 对 DEX 导致的 IR 进行治疗， 均能明显降低血糖浓度、 血胰岛素浓度及 HOMA-IR 指数， 并且明显减少 5 小时内排。