苯基酰胺类化合物在制备抗HIV1病毒药物中的应用.pdf

《苯基酰胺类化合物在制备抗HIV1病毒药物中的应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《苯基酰胺类化合物在制备抗HIV1病毒药物中的应用.pdf（9页完整版）》请在专利查询网上搜索。

1、(10)申请公布号 CN 104000807 A (43)申请公布日 2014.08.27 CN 104000807 A (21)申请号 201410231868.2 (22)申请日 2014.05.28 A61K 31/165(2006.01) A61P 31/18(2006.01) (71)申请人 中山大学 地址 510275 广东省广州市海珠区新港西路 135 号 (72)发明人 张辉 潘婷 罗海华 张旭 何欣 (74)专利代理机构 广州嘉权专利商标事务所有 限公司 44205 代理人 郑莹 (54) 发明名称 苯基 - 酰胺类化合物在制备抗 HIV-1 病毒药 物中的应用 (57) 摘。

2、要 本 发 明 公 开 了 苯 基 - 酰 胺 类 化 合 物 在 制 备 抗 HIV-1 病 毒 药 物 中 的 应 用。 使 用 的 苯 基 - 酰 胺 类 化 合 物 具 有 如 下 通 式 ： 。 发明人运用 HIV-1Vif蛋白可以通过泛素化降解A3G蛋白的功 能特性， 证实上述通式的苯基 - 酰胺类化合物能 够抑制 Vif 蛋白降解 A3G 的活性， 导致筛选系统 中绿色荧光蛋白的表达量将回升。通过在人的原 代CD4+T淋巴细胞以及H9、 SupT1等CD4+T淋巴细 胞系中进行野生型 HIV-1 病毒的感染实验证实， N-（2- 乙酰氨基乙基） -2-（4- 碘苯基） 乙酰胺在 。

3、H9 细胞中的 IC50 为 2M， 具有较好的抗病毒作 用， 为进一步的抗病毒药物研发提供的强有力的 理论基础和实践基础， 具有重要的研发价值和开 发意义。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 附图3页 (10)申请公布号 CN 104000807 A CN 104000807 A 1/1 页 2 1. 苯基 - 酰胺类化合物在制备抗 HIV-1 病毒药物中的应用， 所述苯基 - 酰胺类化合物 具有如下通式 ： 式中， X 为卤素， 位于苯环上 1 3 号位中任一个上。

4、， R 为 C1 C4 的链烃基， n1、 n2 独 立为 1 3 的整数。 2. 根据权利要求 1 所述的应用， 其特征在于 ： R 为 C1 C3 的链烷烃基。 3. 根据权利要求 1 或 2 所述的应用， 其特征在于 ： X 为 I、 Cl。 4. 根据权利要求 1 或 2 所述的应用， 其特征在于 ： X 位于苯环的 2 号位上。 5. 根据权利要求 1 所述的应用， 其特征在于 ： X 为 I， 位于苯环的 2 号位上 ； n1、 n2 为 1， R 为甲基。 权 利 要 求 书 CN 104000807 A 2 1/4 页 3 苯基 - 酰胺类化合物在制备抗 HIV-1 病毒药物中。

5、的应用 技术领域 0001 本发明涉及一种化合物的新应用， 特别涉及苯基 - 酰胺类化合物在制备抗 HIV-1 病毒药物中的应用。 背景技术 0002 HIV-1 病毒最初发现于 1981 年在美国发现， 由一系列不明原因的， 以细胞免疫缺 陷为特征的综合征出现以后， 研究人员开始了对其致病源的寻找。1983 年法国研究小组从 一淋巴肿大综合征病人的淋巴结中， 分离出 HIV-1 病毒。它是一种感染人类免疫系统细胞 的慢病毒， 该病毒破坏人体的免疫力， 导致免疫系统失去抵抗力， 而导致各种疾病以及癌症 得以在人体内生存， 从而导致获得性免疫缺陷综合症艾滋病。 目前， 由于对艾滋病教育 的普及不。

6、充分， 全球的 HIV 感染仍呈上升趋势， 尤其在中国更是进入了快速增长期。尽快 阻止艾滋病在我国的流行已成了一件刻不容缓的大事。因此， 继续扩大我们对 HIV-1 致病 机制的认识， 开发出更有效， 更经济， 更少副作用的抗病毒药物以完全清除残余的 HIV-1 复 制， 以及开发出强有力而又长效的抗 HIV-1 的疫苗以保护易感人群， 仍将是我们能否最终 战胜艾滋病的关键。 0003 具有如下通式的苯基 - 酰胺类化合物 ： 式 中， X 为 卤 素，位 于 苯环上 1 3 号位中任一个上， R 为 C1 C4 的链烃基， n1、 n2 独立为 1 3 的整数， 如（N-（2- 乙 酰 氨 。

7、基 乙 基） -2-（4- 碘苯基） 乙酰胺， N-(2-acetamidoethyl)-2-(4-iodophenoxy)acetamide） 可购 自 Enamine 公司或在其基础上进行人工合成， 目前没有报道该类化合物用于抗病毒实验或 其他可能的功效。 发明内容 0004 本发明的目的在于提供苯基 - 酰胺类化合物在制备抗 HIV-1 病毒药物中应用。 0005 本发明所使用的苯基 - 酰胺类化合物具有如下通式 ： 说 明 书 CN 104000807 A 3 2/4 页 4 式中， X 为卤素， 位于苯环上 1 3 号位中任一个上， R 为 C1 C4 的链烃基， n1、 n2 独 。

8、立为 1 3 的整数。 0006 作为本发明的进一步改进， 上述化合物中的 R 为 C1 C3 的链烷烃基。 0007 作为本发明的进一步改进， 上述化合物中的 X 为 I、 Cl。 0008 作为本发明的进一步改进， 上述化合物中的 X 位于苯环的 2 号位上。 0009 作为本发明的进一步改进， 上述化合物中的X为I， 位于苯环的2号位上 ； n1、 n2为 1， R 为甲基。 0010 发明人运用 HIV-1 Vif 蛋白可以通过泛素化降解 A3G 蛋白的功能特性， 证实上述 通式的苯基 - 酰胺类化合物， 特别是 N-（2- 乙酰氨基乙基） -2-（4- 碘苯基） 乙酰胺能够抑 制 V。

9、if 蛋白降解 A3G 的活性， 导致筛选系统中绿色荧光蛋白的表达量将回升。通过在人的 原代 CD4+ T 淋巴细胞以及 H9、 SupT 1 等 CD4+ T 淋巴细胞系中进行野生型 HIV-1 病毒的感 染实验证实， N-（2- 乙酰氨基乙基） -2-（4- 碘苯基） 乙酰胺具有较好的抗病毒作用， 为进 一步的抗病毒药物研发提供的强有力的理论基础和实践基础， 具有重要的研发价值和开发 意义。 附图说明 0011 图 1: 细胞筛选模型的构建原理图 ； 图 2 ： N-（2- 乙酰氨基乙基） -2-（4- 碘苯基） 乙酰胺具有抑制 Vif 活性的作用 ； 图 3 ： N-（2- 乙酰氨基乙基。

10、） -2-（4- 碘苯基） 乙酰胺在表达 A3G 蛋白的 H9 细胞和不表 达 A3G 蛋白的 SupT1 细胞中抑制野生型 HIV-1 的复制效果 ； 图 4 ： N-（2- 乙酰氨基乙基） -2-（4- 碘苯基） 乙酰胺在 H9 细胞中抑制野生型 HIV-1 的 复制的 IC50 的滴定。 具体实施方式 0012 Vif 是 HIV 的必需蛋白之一， 其主要功能是拮抗宿主中天然的抗病毒因子 APOBEC3G。APOBEC3G 是 H IV-1 病毒的一大威胁， 它存在于 HIV-1 天然的宿主细胞 （如 CD4+ T 细胞和巨噬细胞） 中， 能被包裹入 HIV-1 病毒颗粒， 在 HIV-。

11、1 逆转录过程中发挥其极强的 抗病毒作用。为此， HIV-1 自身编码了 Vif 蛋白来特异性对抗 APOBEC3G 的抗病毒活性， 它 可将 APOBEC3G 导入泛素系统并将其降解 （图 1A） 。因此， 如何灭活 Vif， 是研发抗 HIV-1 病 毒药物的一个十分重要的靶标。 0013 根据 Vif 拮抗 APOBEC3G 的分子机理， 筛选出若干可让 HIV 的 Vif 无法降解 APOBEC3G 的小分子药物。为此我们将建立一种简便的活细胞筛选系统， 如图 1 B 所示， 将表 达APOBEC3G-GFP融合蛋白和表达Vif的 质粒共转染到细胞中。 以APOBEC3G-GFP融合蛋。

12、白 说 明 书 CN 104000807 A 4 3/4 页 5 是否被降解为指标。只要某种化合物在 Vif 存在的情况下还能使 APOBEC3G-GFP 融合蛋白 不被降解 （即 GFP 荧光还在） ， 该化合物就是 Vif 的抑制剂。通过对 Vif 靶标的进一步鉴定， 确认化合物是作用于宿主细胞还是作用在病毒蛋白的 Vif 上。 0014 为了更好地理解本发明的实质， 下面结合实验和结果来说明 N-（2- 乙酰氨基乙 基） -2-（4- 碘苯基） 乙酰胺在制备抗 HIV-1 病毒药物中应用。 0015 实验一 1) 取生长良好的人肾上细胞株 239t 细胞， 接种于 96 孔透明平底板中，。

13、 每孔 5104细 胞。使用的培养基是完全培养基 ： 高糖 DMEM， 10% 胎牛血清以及 1% 双抗， 培养条件是 5% 二 氧化碳、 37 ； 2)24h 贴壁后， 共转染 PEGFP-A3G 和 pcDNA3.1-Vif 两种质粒。转染采用脂质体包裹转 染， 试剂使用 lipo2000， 转染液 20l ； 3) 转染 4h 后， 加入待筛选的化合物， 每孔 2l， 终浓度为 50M ； 4) 培养 48h 后， 检测绿色荧光蛋白 GFP 的表达情况。如果出现绿色荧光蛋白 GFP 表达 上升的情形， 该化合物可能成为抗病毒候选药物。 0016 实验结果如图 2 所示， 从实验结果可以看。

14、出， N-（2- 乙酰氨基乙基） -2-（4- 碘苯 基） 乙酰胺均具有抑制 Vif 活性的作用。 0017 实验二 Vif 蛋白在 HIV-1 病毒复制过程中具有重要作用， vif 缺陷的 HIV 病毒不能在 CD4+T 细 胞、 巨噬细胞内复制， 即不能在上述 “非允许” 细胞内复制 ； 而含有 vif 基因的野生株病毒可 在上述细胞内复制。Vif 缺失株病毒进入某些靶细胞后可进行反转录， 但不能合成前病毒 DNA。研究显示 HIV 复制处决于一种细胞抑制因子的出现或缺失， 这种内源性的抑制因子是 APOBEC3G， 它属于细胞内 RNA 编辑酶， 能使 mRNA 中的胞嘧啶脱氨基形成尿嘧。

15、啶， 导致 G 和 A 突变体的累积， 进而是病毒 DNA 降解， vif 通过与 APOBEC3G 结合形成复合物阻断 APOBEC3G 的抑制活性。在 APOBEC3G 存在的细胞系如 H9 细胞中， APOBEC3G 与 vif 蛋白结合通过泛素 化系统降解， 如果化合物能够抑制 APOBEC3G 被 vif 蛋白降解， 宿主细胞将不能够被 HIV-1 感染 ； 而在 APOBEC3G 不存在的情细胞系如 SupT1 细胞中， HIV-1 蛋白可以正常感染该宿主 细胞 ； 那么这个化合物将有可能成为抗 HIV-1 Vif 蛋白的化合物。 0018 APOBEC3G 是细胞的自我保护机制，。

16、 但 vif 是 HIV-1 病毒对抗 APOBEC3G 功能的蛋 白， 导致HIV-1病毒逃避细胞内自我清除过程。 利用HIV-1的允许细胞和不允许细胞中的抗 病毒实验的效果比较， 从而能进一步在野生型病毒实验中确定靶标化合物可以拮抗 HIV-1 的 Vif 蛋白， 抑制 HIV-1 病毒的复制。 0019 1) 取生长良好的淋巴细胞系 H9 和 Supt 1， 细胞用量为 2105/ 孔， 分别感染包装 好的 HIV-1 病毒上清， 病毒用量为 10ng/1106细胞 ；（感染时使用促感染试剂 polybrene） ； 2) 感染 3h 后换液， 使用 PBS 清洗三次， 弃上清， 使用 。

17、1640 培养基 （10% 胎牛血清， 1% 双 抗） 培养， 培养基每孔 200l， 化合物每孔 2l（终浓度 50M） ； 3) 使用 2%Triton X-100 处理收样的上清， 收培养了 4day 的细胞上清， 测 P24 Elisa。 0020 实验结果如图 3 所示。从实验结果可以看出， N-（2- 乙酰氨基乙基） -2-（4- 碘 苯基） 乙酰胺在 H9 细胞中具有良好的抗 HIV-1 病毒作用， 而在 SupT1 细胞中没有效果。 0021 实验三 说 明 书 CN 104000807 A 5 4/4 页 6 1) 取生长良好的淋巴细胞系 H9， 细胞用量为 2105/ 孔，。

18、 感染包装好的 HIV-1 病毒上 清， 病毒用量为 10ng/1106细胞 ；（感染时使用促感染试剂 polybrene） ； 2) 感染 3h 后换液， 使用 PBS 清洗三次， 弃上清， 使用 1640 培养基 （10% 胎牛血清， 1% 双 抗） 培养， 培养基每孔 200l， 加入化合物每孔 2l， 终浓度分别为 50M， 5M， 0.5M， 0.05M， 0.005M， 0.0005M， 0M ； 3) 使用 2%Triton X-100 处理收样的上清， 收样 4day， 测 P24 Elisa。 0022 实验结果如图 4 所示。从实验结果可以看出， N-（2- 乙酰氨基乙基） -2-（4- 碘 苯基） 乙酰胺在 H9 细胞中的 IC50为 2M， 具有较好的抑制病毒的效果。 说 明 书 CN 104000807 A 6 1/3 页 7 图 1 说 明 书 附 图 CN 104000807 A 7 2/3 页 8 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 104000807 A 8 3/3 页 9 图 4 说 明 书 附 图 CN 104000807 A 9 。