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1、(10)申请公布号 CN 104027372 A (43)申请公布日 2014.09.10 CN 104027372 A (21)申请号 201410302096.7 (22)申请日 2014.06.30 A61K 36/23(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61K 36/13(2006.01) (71)申请人 牛兆颖 地址 250014 山东省济南市历下区经十东路 3366 号林景山庄 14 号楼西单元 402 室 (72)发明人 牛兆颖 牛赡光 (74)专利代理机构 济南诚智商标专利事务所有 限公司 37105 代理人 韩百翠 (54) 发明名称 一种具有抗肿瘤。
2、活性的植物粗提物组合物 (57) 摘要 本发明公开了一种具有抗肿瘤活性的植物粗 提物组合物。它是由红豆杉粗提物及北沙参粗提 物复配而成， 二者的质量比为 3 ： 1 1 ： 4 ； 所述红 豆杉粗提物和北沙参粗提物均为采用 80乙醇 提取得到的提取物。本发明通过试验证明 ： 红豆 杉粗提物及北沙参粗提物的混合物在 40g/mL 对肺癌细胞株(L329)和肝癌细胞株(HCC21)的抑 制率明显高于两者单剂各浓度的效果， 协同增效 明显。 同时对肺癌细胞株(L329)抑制效果以红豆 杉粗提物和北沙参粗提物比例 1 ： 2， 对肝癌细胞 株 (HCC21) 以 1 ： 3 为最好。 (51)Int.。
3、Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 (10)申请公布号 CN 104027372 A CN 104027372 A 1/1 页 2 1. 一种具有抗肿瘤活性的植物粗提物组合物， 其特征是， 它是由红豆杉粗提物及北沙 参粗提物复配而成， 二者的质量比为 3 ： 1 1 ： 4 ； 所述红豆杉粗提物和北沙参粗提物均为 采用 80乙醇提取得到的提取物。 2. 如权利要求 1 所述的一种具有抗肿瘤活性的植物粗提物组合物， 其特征是， 所述红 豆杉粗提物和北沙参粗提物的质量比为 1 ： 2 4。 3. 如权利。
4、要求 2 所述的一种具有抗肿瘤活性的植物粗提物组合物， 其特征是， 所述红 豆杉粗提物和北沙参粗提物的质量比为 1 ： 2。 4. 如权利要求 2 所述的一种具有抗肿瘤活性的植物粗提物组合物， 其特征是， 所述红 豆杉粗提物和北沙参粗提物的质量比为 1 ： 3。 5. 权利要求 1 所述的植物粗提物组合物在制备抗肝癌或抗肺癌的药物方面的应用。 6. 权利要求 3 所述的植物粗提物组合物在制备抗肺癌的药物方面的应用。 7. 权利要求 4 所述的植物粗提物组合物在制备抗肝癌的药物方面的应用。 权 利 要 求 书 CN 104027372 A 2 1/4 页 3 一种具有抗肿瘤活性的植物粗提物组合物。
5、 技术领域 0001 本发明涉及一种抗癌药物， 具体是一种具有抗肿瘤活性的植物粗提物组合物， 属 于医药技术领域。 背景技术 0002 随着科学技术的进步， 许多以前被认为是严重疾病的传染病已经不再是危害人类 的重要疾病， 而环境污染等因素导致的恶性肿瘤疾病死亡人数却不断增加， 已经成为仅次 于心血管病的第二杀手。对恶性肿瘤的治疗药物很多， 但天然化合物中以红豆杉中的紫杉 醇疗效最好。但该化合物并不是对所有恶性肿瘤效果都很突出， 且价格昂贵。目前， 紫杉醇 主要适用于卵巢癌和乳腺癌的治疗， 虽然对肺癌、 大肠癌、 黑色素瘤、 头颈部癌、 淋巴瘤、 脑 瘤也都有一定疗效， 但效果不甚理想。 00。
6、03 红豆杉 ( 东北红豆杉 Taxus cuspidata ； 俗称紫杉， yew) 植物分类归于裸子植物亚 门， 松杉纲， 红豆杉目， 红豆杉科中红豆杉族下的红豆杉属。 红豆杉科共5属22种， 我国有4 属 ( 红豆杉属、 白豆杉属、 穗花杉属、 榧树属 )12 种 1 变种及 1 栽培种。目前所见报道只在 红豆杉属植物中含有紫杉醇， 本属共 11 种， 我国有 4 种 1 变种， 分别为西藏红豆杉、 云南红 豆杉型、 红豆杉、 东北红豆杉及南方红豆杉。 在这些植物中紫杉醇的含量依种属、 植物部位、 生长环境、 生长年限， 采收季节、 贮藏及加工方法的不同而有显著差异。在目前发现的所有 含。
7、紫杉醉的红豆杉属植物中仍以欧洲短叶红豆一中含量最高 (0.069 )， 而最低含量只有 0.003， 约从 38000 棵紫杉树中方可分离提纯得到 99纯度的紫杉醇约 25kg， 对于成树 ： 树皮 树叶 树根 树干 种子 心材。 0004 北沙参 (Glehnia littoralis) 为伞形科 (Umbelliferae) 北沙参属 (Glehnia) 的 多年生草本植物， 其干燥根为传统中药， 俗称北沙参， 有养阴清肺、 益胃生津之功效， 用于肺 热燥咳， 劳嗽痰血， 热病津伤口渴 ( 国家药典委员会， 2005) ； 北沙参的根及幼嫩的茎叶均可 食用， 已成为人们日常生活中常用的蔬菜。
8、和保健食品之一， 在日本、 美国及东南亚地区备受 青睐， 是一种创汇农产品 ； 北沙参原为海滩沙生植物群落的建群种之一， 海滩的滥用开发和 对该植物的过度采挖， 使其数量日趋减少， 已经处于濒临灭绝的境地， 被列为中国珍稀濒危 保护植物。 发明内容 0005 本发明针对我国因空气污染加重而不断攀升的肺癌进行红豆杉等研究， 发现红豆 杉与北沙参粗提物混合制剂对肺癌和肝癌的抑制活性都比较高。 0006 本发明的技术方案是 ： 一种具有抗肿瘤活性的植物粗提物组合物， 其特征是， 它是 由红豆杉粗提物及北沙参粗提物复配而成， 二者的质量比为 3 ： 1 1 ： 4 ； 所述红豆杉粗提 物和北沙参粗提物。
9、均为采用 80乙醇提取得到的提取物。 0007 制备方法 ： 取红豆杉加入 2-5 倍质量的 80乙醇在索氏提取器中提取 5-8h， 提取 液蒸干后备用 ； 北沙参粗提物的制备方法同现有技术 ； 二者按上述比例复配后使用。 说 明 书 CN 104027372 A 3 2/4 页 4 0008 本发明可以加入辅料制成不同的制剂如颗粒剂、 片剂等使用。 0009 优选地， 红豆杉粗提物和北沙参粗提物的质量比为 1 ： 2 4。 0010 优选地， 对肺癌细胞株 (L329) 抑制效果以红豆杉粗提物和北沙参粗提物的质量 比为 1 ： 2 最佳。 0011 优选地， 对肝癌细胞株 (HCC21) 抑。
10、制效果以红豆杉粗提物和北沙参粗提物的质量 比 1 ： 3 最佳。 0012 本发明采用 MTT 法观察红豆杉粗提物和北沙参粗提物， 及二者的复配混合物， 对 肺癌细胞株 (L329)、 肝癌细胞株 (HCC21) 的体外抗肿瘤作用。结果表明 ： 红豆杉与北沙参 的粗提物单品或二者的复配混合物对肺癌细胞株 (L329) 和肝癌细胞株 (HCC21) 在不同浓 度时亦均有抑制效果， 各浓度间差异显著， 浓度为在 25-50ug/mL 时， 其抑制率明显高于其 它浓度。两者混合制剂在 40g/mL 对肺癌细胞株 (L329) 和肝癌细胞株 (HCC21) 的抑制率 明显高于两者单剂各浓度的效果， 协。
11、同增效明显。同时对肺癌细胞株 (L329) 抑制效果以红 豆杉粗提物和北沙参粗提物比例 1 ： 2， 对肝癌细胞株 (HCC21)1 ： 3 为最好。 具体实施方式 0013 实施例 1 0014 本发明采用 MTT 法观察红豆杉粗提物和北沙参粗提物， 及二者的复配混合物， 对 肺癌细胞株 (L329)、 肝癌细胞株 (HCC21) 的体外抗肿瘤活性的药理作用， 试验过程及结果 如下所示。 0015 1 材料及方法 0016 1.1 材料及细胞 0017 东北红豆杉 (Taxus cuspidata) 干叶由邹平县南洋红豆杉产业发展有限公司提 供， 北沙参干品由山东省莱阳市高格庄乡胡城村提供。。
12、获得的样品粉碎后待用 ； 肿瘤细胞 ： 肺癌细胞株和肝癌细胞株来自于青岛农业大学。 0018 1.2 仪器与试剂 0019 1.2.1 仪器 0020 高速万能粉碎机 ( 天津市泰斯特仪器有限公司 ) ； 高压灭菌锅 ( 日本三洋 SANYO MLS-3780) ； 低速大容量离心机 LXJ- B 型离心机 ( 飞鸽牌系列 ： 上海金鹏分析仪器有限 公司 ) ； CO2培养箱 ( 美国 Forma 公司 ) ； 电热鼓风干燥箱 101A-2 型 ( 江苏东台市电器厂 ) ； 酶联免疫检测仪 ( 美国 BIO-RAD 公司产品， Version4.0)。 0021 1.2.2 试剂 0022 R。
13、PMI-1640培养液(Gibco产品)， 0.25胰蛋白酶(Amresco公司)， 四甲基偶氮唑 盐 (MTT， Amresco 公司 )， D-Hanks 液无 Ca2+、 Mg2+新生小牛血清 ( 北京元亨圣马生物技术有 限公司 )， 10,000 单位 /ml 青链霉素溶液 ( 市售药品 )， 无支原体胎牛血清 ( 杭州四季青生 物工程有限公司 )， 二甲基亚砜。 0023 1.3 实验方法 0024 1.3.1 红豆杉和北沙参提取物的提取 0025 称取红豆杉 ( 东北红豆杉 Taxus cuspidata) 和北沙参粉末各 150g， 用 500ml 的 80乙醇在索氏提取器中各提。
14、取 6h， 醇溶的液体在 55用旋转蒸发仪蒸发， 干燥后备用。 说 明 书 CN 104027372 A 4 3/4 页 5 0026 1.3.2 体外实验细胞的培养 0027 L329 细胞在 5 CO2， 37条件下， 用含 10小牛血清、 青霉素 (100g/mL) 和链 霉素 (100g/mL) 的 RMPI1640 培养液传代培养， 实验用细胞均处于对数生长期。HCC21 细 胞的体外培养方法同上。 0028 1.3.3 北沙参提取物对肺癌细胞株 (L329) 和肝癌细胞株 (HCC21) 细胞毒性实验 0029 红豆杉和北沙参粉末分别经乙醇索氏提取器处理后， 各粗提物先用二甲基亚砜。
15、 溶解， 再用水配成各级浓度， 分别设 6 个浓度， 它们是 200g/mL、 100g/mL、 50g/mL、 25g/mL、 12.5g/mL、 6.25g/mL， 并以水为对照。取对数生长期的 L329 细胞或 HCC21 细 胞， 胰蛋白酶消化后以1105个/mL密度埋96孔板， 每孔150L， 埋板24h后各加药50L。 给药 48h 后， 小心吸弃孔内培养液， 每孔加培养液 150L， MTT 液 20L， 37， 5 CO2饱湿 继续孵育 4h 后中止培养， 小心吸弃孔内培养液。每孔加入 150L 的 DMSO， 振荡 10min。用 酶标仪在 570nm 处测吸光值 ( 方法采。
16、用徐淑云，药理实验方法 ， 2002 年出版 )。各提取物 对肿瘤细胞的生长抑制率按下列公式计算 ： 0030 抑制率 ( ) (A A1)/A100 0031 A 为对照组的吸光值， A1 为供试样品的吸光值。 0032 2 观察结果 0033 红豆杉和北沙参粗提物对两种肿瘤细胞作用后的吸光值分别见表 1 和表 2， 对肿 瘤细胞的生长抑制率见表 3。 0034 表 1 不同浓度的醇溶物对肺癌肿瘤细胞作用后的吸光值 0035 0036 表 2 不同浓度的醇溶物对肝癌肿瘤细胞作用后的吸光值 0037 0038 表 3 提取物及不同混剂对肿瘤的抑制效果 0039 说 明 书 CN 1040273。
17、72 A 5 4/4 页 6 0040 根据上述实验结果， 将总浓度确定在 40g/mL 进行混配试验， 结果见表 4 和表 5。 0041 表 4 相同浓度 (40g/mL) 的醇溶物对肝癌肿瘤细胞作用后的吸光值 0042 0043 表 5 相同浓度 (40g/mL) 提取物混和物及不同混剂对肿瘤的抑制率 ( ) 0044 0045 从表 4 和表 5 可以看出， 红豆杉与北沙参的粗提物单品或二者的复配混合物对 肺癌细胞株 (L329) 和肝癌细胞株 (HCC21) 在不同浓度时亦均有抑制效果， 各浓度间差异 显著， 浓度为在 25-50ug/mL 时， 其抑制率明显高于其它浓度。两者混合制剂在 40g/mL 对肺癌细胞株 (L329) 和肝癌细胞株 (HCC21) 的抑制率明显高于两者单剂各浓度的效果， 对肺癌细胞株 (L329) 抑制效果以红豆杉粗提物和北沙参粗提物比例 1 ： 2， 对肝癌细胞株 (HCC21)1 ： 3 为最好。 说 明 书 CN 104027372 A 6 。