作为体内造血刺激剂的 TAT-HOXB4H 重组蛋白质及其医疗 组成物 【技术领域】
本发明涉及一种 C- 端含有组胺酸标记的 HOXB4 重组蛋白质， 特别涉及一种 C 端含 有六个组胺酸残基 (residue) 的重组蛋白质。背景技术
在 再 生 医 学 发 展 蓬 勃 的 今 日， 各种关于寻找器官特异干细胞或可自我更生 (self-renewing) 细胞的研究不断。 所述可自我更生细胞中最常被研究的是造血干细胞， 因 为从癌症、 新陈代谢疾病到免疫不全， 造血干细胞皆是较好的治疗选择。
“造血” 是指血液细胞生成的过程， 可通过位于骨髓中的造血干细胞的分裂而取代 红血球及白血球。造血干细胞 (HSCs) 是一群具有自我更新能力与分化为所有血球或免疫 细胞能力的细胞。然而， 控制造血干细胞自我更新与分化的基因机转多半仍属未知。
目前， 自成人骨髓、 动员后周边血液以及脐带血移植的人类造血干细胞， 已在临 床上用于治疗血癌 ( 白血病与淋巴瘤 )， 以及用于帮助免疫系统由非血癌的高剂量化疗复 原。然而有效的移植需要大量的不同来源的造血干细胞， 并且可能需要进行干细胞增生 (expansion)。
造血干细胞可来自骨髓、 周边血液以及脐带血。取出骨髓细胞需要进行手术以及 相当痛苦的步骤， 因而成为较差的手段。 使用周边血液细胞也有缺陷， 因为很难由造血机能 受损的罹病或化疗患者取得合适与足量的造血干细胞。 脐带血相对容易取得并且造血干细 胞的质量也较好， 然而此法所能取得的造血干细胞数量仍有限。每次取得的细胞数量足够 用于小孩， 但要用于成人就可能不足。 为解决上述问题， 就必须干扰干细胞自我更生过程来 加速造血干细胞体外增生。
新近的证据指出转录调控因子在调控干细胞的基因表现、 与干细胞的发育过程 扮演重要角色 (Orkin、 S.H.Nat.Rev.Genet 1， 57-64、 2000)。转录调控因子可通过与目标 基因的结合与否或是本身浓度来构成复杂的细胞生理调控机制。一群称为 DNA binding homebox(HOX) 的转录因子被发现在胚胎发育扮演重要角色， 并且在近年来发现 HOX 转录 因子家族在造血干细胞发育也扮演了重要角色 (Buske、 C.et.al.J.Hematol.71， 301-308、 2000)。蒙特娄大学 (University of Montreal) 的盖· 萨瓦格 (Guy Sauvageau) 博士曾经 探讨骨髓中造血干细胞的 HOX 转录因子调控造血干细胞更新的现象， 它的研究显示同位序 列基因 (homeobox gene)HOXB4 对于造血干细胞自我更新的调控十分重要， 可维持造血干细 胞在骨髓中的群集大小。最早证明 HOX 基因会在血球细胞表现， 是利用人类及老鼠的细胞 株 (cell line) 而证实的。有些 HOX 基因在不同的细胞形态有明显广泛的表现， 有些 HOX 基因则只活化表现于特定细胞中。 例如 ： 人类的 HOXB 串群中的八个成员会在红血球细胞发 育之初表现， 有些 HOXB 基因包括 HOXB4 及 HOXB7 也会在 T 细胞及 B 细胞表现。Sauvageau 等人证实有九个 HOXA 基因、 八个 HOXB 基因及四个 HOXC 基因会在 CD34+ 骨髓细胞内表现， 其中又以 HOXB2、 HOXB9 及 HOXA10 在 CD34+ 的细胞族群内的红血球原始细胞表现最多。另外， 实验结果也检测出在 CD34- 的细胞群中， 没有 HOX 基因表现。因此， “HOXB4” 蛋白已最常 被用于做为活体外造血干细胞 (HSC) 增生之有效刺激剂。近来已证实人类， “HOXB4” 基因 可以病毒或重组蛋白质形式来有效增生造血干细胞。TAT-HOXB4H 重组蛋白质， 在实验室等 级， 已被用于增生干细胞而不会有反转录病毒插入之风险或与骨髓基质细胞共培养之风险 ( 参见 Krosl、 J.et al.、 Nature Medicine 9、 1428-1432、 2003)。因此， “HOXB4” 蛋白已常 用于做为促进活体外造血干细胞增生的刺激剂。
最近已有证据指出在 HOXB4 的 N 端加上一 TAT 蛋白质序列后， 外源的 HOXB4 即可被 运送至细胞内。此 TAT 序列系可导引 HOXB4 由细胞外至细胞内的运输。一旦进入细胞质， HOXB4 可藉由护卫蛋白 (Chaperon)HSP90 而重新折迭成其原始的构形。TAT-HOXB4 能够促 进造血干细胞增生达 2-6 倍 (Amsellem、 S. 等人， Nature Medicine 9、 1423-1427， 2003 ； 及 Krosl、 J. 等人， Nature Medicine 9、 1428-1432， 2003)。然而， 该 TAT-HOXB4 重组蛋白质自 大肠杆菌宿主的纯化回收产率偏低， 且多为不可溶形式。
为了增加该 TAT-HOXB4 重组蛋白质的产率， 已发展出 C- 端另具有一段 6 个组胺酸 残基 (His-6) 标记的 TAT-HOXB4H 重组蛋白质制造方法， 其产率较原始蛋白质的纯化效率高 出 3-5 倍。此制造方法已详细描述于 PCT/CN2006/000646。
上述 TAT-HOXB4H 重组蛋白质可用于人类周边血液或脐带血干细胞增生， 并且所 增生的干细胞仍保有其多能性 (pluripotency)。此外， 将上述 TAT-HOXB4H 重组蛋白质处 理过的干细胞加入在非肥胖型糖尿病合并重度联合免疫缺陷小鼠 (NOD/SCID) 的骨髓内之 后， 可以在其周边白血球中发现人类白血球， 由此可知小鼠免疫与造血机能已成功重建。
然而， TAT-HOXB4H 重组蛋白质从未被用于做为体内造血的刺激剂， 特别是， 从未被 用于增进造血机能重建、 扩增、 骨髓重生 (re-population) 以及增加周边循环干细胞的数 目， 特别是在化疗或放射线治疗之后。Krosl 等人 (2003) 以及 Amsellem 等人 (2003) 无法 获得扩增造血干细胞临床研究所需的大量高纯度且高度安定的 HOXB4 蛋白质。 使用现有技术由一公升培养液纯化而得的 TAT-HOXB4H 重组蛋白质总量约为 1-2 毫克， 产率较低。使用现有技术方法表现 TAT-HOXB4H 蛋白质的 pTAT-HA-HOXB4 质体， 是加 拿大蒙特娄大学 (University of Montreal) 的盖·萨瓦格 (Guy Sauvageau) 博士所赠， Krosl 等人 (2003) 曾报告说， 在血清培养 4 小时后， 其纯化的 TAT-HOXB4H 蛋白质会丧失大 部分。
发明内容
本发明基于后述研究结果 ： 当 TAT-HOXB4H 重组蛋白质给予一有需要的使用者之 后， 其可增加骨髓内以及周边血液内的造血干细胞的数目。
本发明一方面提供了一种 TAT-HOXB4H 蛋白质制造方法。该方法包含 ：
(a) 提供一宿主细胞， 其包含一具有上述蛋白质编码的载体 ；
(b) 在该宿主细胞内表现该蛋白质 ；
(c) 收取该表现蛋白质的一不纯溶液 ；
(d) 以下列步骤由该溶液纯化该蛋白质 ： (i) 将该溶液通入一 HisTrap 管柱 ； (ii) 冲洗该 HisTrap 管柱 ； (iii) 将该部分纯化的蛋白质由该 HisTrap 管柱溶离出， 而形成一 部分纯化的蛋白质溶液 ； (iv) 将该部分纯化的蛋白质溶液通入一 MonoSP 管柱 ； (v) 冲洗该MonoSP 管柱 ； (vi) 将纯化的蛋白质， 呈变性形式， 由该 MonoSP 管柱溶离出 ；
(e) 利用疏水性化合物将溶离出的变性蛋白质以下列步骤再折迭 ： (i) 将该溶离 出的变性蛋白质与一疏水性化合物溶液混合形成一蛋白质与疏水性化合物溶液 ； (ii) 将 该蛋白质与疏水性化合物溶液去盐而得一蛋白质与疏水性化合物去盐溶液 ； (iii) 利用超 过滤制程将该疏水性化合物由该蛋白质与疏水性化合物去盐溶液中移除。
本发明另一方面提供了一种促进造血干细胞由骨髓动员至周边血液的方法。 该方 法包含 ：
a) 给予一有需要的使用者一有效量的以上述方法制造的 TAT-HOXB4H 重组蛋白 质；
b) 允许该 TAT-HOXB4H 重组蛋白质增加该使用者骨髓内造血干细胞的绝对数目， 由此促进造血干细胞动员至该使用者的周边血液。
本发明再一方面向提供了一种用以改善造血干细胞移植患者、 放射线治疗患者或 化疗患者的恢复时间的方法。该方法包含 ：
a) 给予一有需要的使用者一有效量的以上述方法制造的 TAT-HOXB4H 重组蛋白 质； b) 允许该 TAT-HOXB4H 重组蛋白质增加该使用者骨髓内造血干细胞的绝对数目。
本发明再一方面提供了一种用以促进造血干细胞由一有需要的使用者的骨髓动 员至周边血液的医疗组成物。本发明的医疗组成物包含一有效量的以上述方法制造的 TAT-HOXB4H 重组蛋白质， 其足以增加该使用者骨髓内造血干细胞的绝对数目， 由此促进造 血干细胞动员至该使用者的周边血液。
本发明所述医疗组成物可给予进行自体造血干细胞移植的患者， 用以改善其造血 干细胞移植后的恢复时间。
本发明所述医疗组成物， 可作为颗粒球细胞生长因子 (G-CSF) 的替代物， 给予 G-CSF 不敏感患者， 用以动员造血干细胞至周边血液。
本发明所述医疗组成物可给予造血干细胞捐赠者， 由此可以由捐赠者之外围血液 以较不具侵略性的方式取得足量的造血干细胞以供移植， 而不须由其骨髓取得。
本发明再一方面提供了治疗先天性造血干细胞缺乏而造成的疾病， 其通过全身性 给药方式， 给予上述疾病患者一有效量的以上述方法制造的 TAT-HOXB4H 重组蛋白质或其 医疗组成物。所给予的 TAT-HOXB4H 重组蛋白质会增加该使用者骨髓内造血干细胞的绝对 数目。
本发明再一方面提供了一种用以改善造血干细胞移植患者的恢复时间的方法， 其 通过全身性给药方式， 给予一有需要的使用者一有效量的以上述方法制造的 TAT-HOXB4H 重组蛋白质或其医疗组成物。
本发明再一方面提供了一种用以改善放射线治疗患者或化疗患者的造血干细胞 回复的方法， 其通过全身性给药方式， 给予一有需要的使用者一有效量的以上述方法制造 的 TAT-HOXB4H 重组蛋白质或其医疗组成物。
附图说明
图 1 为本发明中造血干细胞 (HSC) 从体内扩增动员至外围血液 (PB) 的示意图 ；图 2 为本发明中 pTAT-HOXB4H 的选殖与构筑在修改过的 pET21b 质体内的示意图 ；
图 3 为本发明中 pTAT-HOXB4H 的 DNA 序列图 ； (pTAT-HOXB4HN- 端及 C- 端额外的 六个组胺酸残基加底线标示， 并且标上 TAT)
图 4 为本发明中 pTAT-HOXB4H 的蛋白质序列图 ；
图 5 为本发明中以 10％ SDS-polyacrylamide 凝胶 (1.5mm) 证明 TAT-HOXB4H 蛋白 质的纯化， 其以 coomassie blue 染色分析图示 pTAT-HOXB4H 的蛋白质序列 ；
其中 ： M： 分子量标记 (M)， 0.3μg ；
lane 1 ： 来自未诱导 BL21(DE3)pLysS TAT-HOXB4H 蛋白质表现细胞的细胞溶解产 物， 1μg 蛋白质 ；
lane 2 ： 来自诱导后 BL21(DE3)pLysS TAT-HOXB4H 蛋白质表现细胞的细胞溶解产 物， 1μg 蛋白质 ；
lane 3 ： 纯化的 TAT-HOXB4H， 0.7μg 蛋白质 ；
lane 4 ： 纯化的 TAT-HOXB4(0.2μg 蛋白质 ) ； 用以表现 TAT-HOXB4 蛋白质 (lane 5) 的 pTAT-HA-HOXB4 质体， 是加拿大蒙特娄大学 (University of Montreal) 的盖· 萨瓦格 (Guy Sauvageau) 博士所赠。
lane 3 及 lane 4 是加入相同体积的由 MonoSP 管柱收集的流份 (fraction)。
图 6 为本发明中以 SDS-polyacrylamide 凝胶分析纯化后 TAT-HOXB4H 蛋白质的安 定性图 ； ( 其储存在 PBS， 4℃， 0 小时 (A) 与 16 小时 (B)， 其中 ： M 代表分子量标记， 0 代表在 4℃ 0 小时， 16 代表在 4℃ 16 小时 )
图 7 为 本 发 明 中 以 SDS-polyacrylamide 凝 胶 以 及 coomassie 染 色 分 析 TAT-HOXB4H 蛋白质储存在 -4℃以及 -20℃， PBS 以及 IMDM 缓冲液的安定性图 ； ( 箭头指示 TAT-HOXB4H 蛋白质 band)
图 8A 为本发明中以流式细胞仪分析 G-CSF 对于小鼠骨髓中 CD34+ 干细胞数目的 刺激效果图 ；
图 8B 为本发明中以流式细胞仪分析 PBS 对于小鼠骨髓中 CD34+ 干细胞数目的刺 激效果图 ；
图 8C 为本发明中以流式细胞仪分析 TAT-HOXB4H 蛋白质对于小鼠骨髓中 CD34+ 干 细胞数目的刺激效果图 ；
图 9A 为本发明中以流式细胞仪分析 G-CSF 对于恒河猴骨髓中 CD34+ 干细胞数目 的刺激效果图 ； 。
图 9B 为本发明中以流式细胞仪分析 TAT-HOXB4H 蛋白质加上 G-CSF 对于恒河猴骨 髓中 CD34+ 干细胞数目的刺激效果图 ；
图 9C 为本发明中以流式细胞仪分析 TAT-HOXB4H 蛋白质对于恒河猴骨髓中 CD34+ 干细胞数目的刺激效果图 ；
图 9D 为本发明中以流式细胞仪分析 PBS 对于恒河猴骨髓中 CD34+ 干细胞数目的 刺激效果图 ；
图 10 为本发明中 TAT-HOXB4H 蛋白质对于 NOD-SCID 小鼠的造血回复影响图 ；
图 11 为本发明中 TAT-HOXB4H 蛋白质对于接受 Cisplatin 化疗后 Balb/c 小鼠的 造血回复影响图。具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明的实施例作进一步的详细说明。
I.TAT-HOXB4H 蛋白质
本发明由一公升培养液纯化而得的 TAT-HOXB4H 重组蛋白质总量约为 6-10 毫 克， 而本发明的 TAT-HOXB4H 蛋白质纯化方法具有体内给予蛋白质所需提升的产率。本发 明的 TAT-HOXB4H 蛋白质， 即使在血清培养 4 星期后， 仍显出明显较佳的安定性， 此处将 TAT-HOXB4H 蛋白质用于临床研究的关键。
本发明所提供的 TAT-HOXB4H 蛋白质的制造方法， 具有能够提高产率以及安定性 的优点， 使得上述蛋白质可用于体内给药。此 TAT-HOXB4H 蛋白质为包含三个基因片段 (element)(TAT、 HOXB4 以及组胺酸标记 ) 的构体 (construct)。HOXB4 是转录调控因子 HOX 家族的一员， 其可促进造血干细胞增生。TAT 使得 HOXB4 部分得以被输送至细胞核内。组 胺酸标记可使重组表现源的初始纯化产率增加， 本发明的制造方法可进一步增加蛋白质产 率。pTAT-HOXB4H 的构筑如图 2 所示， DNA 序列系如图 3 所示。TAT-HOXB4H 重组蛋白质系 指 C 端含有六个组胺酸残基 (residue) 标记 ( 参见图 4) 的 TAT-HOXB4 融合蛋白质。 除非另外指明， 蛋白质的氨基酸序列 ( 或称 “初级结构” 或 “初级序列” ) 是由氨基 端至羧基端。在非生物系统 ( 例如使用固态合成者 )， 蛋白质 ( 包含双硫 ( 半胱氨酸 ) 键位 置 ) 的初级结构可由使用者自订。
“删除 (deletion)” 是指氨基酸 ( 或核苷酸 ) 序列由于缺失一个或一个以上的氨基 酸残基 ( 或核苷酸 ) 所造成的改变。 “插入 (insertion) 或增加” 是指氨基酸 ( 或核苷酸 ) 序列的改变造成在一分子或其表现物， 相较于一参照序列 ( 例如自然存在分子所发现的序 列 )， 增加一个或一个以上的氨基酸残基 ( 或核苷酸 )。 “取代” 是指一个或一个以上的氨基 酸 ( 或核苷酸 ) 被不同的氨基酸 ( 或核苷酸 ) 取代。
与本发明序列相似或同源 ( 例如序列有 70％相同 ) 的序列也是本发明的一部分。 在某些实施例中， 序列相同度可以是 90％、 、 91％、 92％、 93％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％、 99％或更高。此外， 实质相同也存在于当核酸片段可以与其互补股杂交 ( 例如在高度严格 的条件下 ) 时。核酸可出现在全细胞、 细胞溶解物或呈半纯化或纯化形式。
两序列间 “同源性” 或 “序列相同性” ( 两者在此处可交换使用 ) 的计算方法如下 所示。先将序列以最适合比较的方式对齐 ( 例如可在第一或第二氨基酸 ( 或核酸 ) 序列加 上缺口 (gap) 以最适合比较， 并且比较时可去掉不同源的片段 )。 在本发明的一个优选实施 例中， 参照序列用于对齐比较的长度可以是参照序列长度的至少 30％、 较佳至少 40％、 更 佳至少 50％、 更佳至少 60％、 更佳至少 70％、 80％、 90％、 100％。然后比较对应位置上的氨 基酸残基 ( 或核苷酸 )。当第一序列以及第二序列相对应位置相同的氨基酸残基 ( 或核苷 酸 ) 时， 则在该位置相同 ( 在此氨基酸 ( 或核酸 )“相同” 指等同于氨基酸 ( 或核酸 )“同 源” )。两序列之间的相同度百分比指两序列间共同拥有相同位置的数目的函数， 其需考虑 为了最佳化对齐所加入的缺口的数目与每一缺口的长度。
两序列之间的序列比较与相同百分比可以利用一数学算法达成。 在本发明的一个 优选实施利中， 两氨基酸序列之间的相同百分比可以利用已并入 GCG 软件包 (http://www. gcg.com)GAP 程序的 Needleman and Wunsch(1970)(J.Mol.Biol.48 ： 444-453) 算法决定，
使用 Blossum 62matrix 或 PAM250matrix 以及 16、 14、 12、 10、 8、 6 或 4 的缺口加权与 1、 2、 3、 4、 5 或 6 的长度加权。 在本发明的另一个优选实施利中， 两氨基酸序列之间的相同百分比可 以利用 GCG 软件包 (http://www.gcg.com) 决定， 使用 NWSgapdna.CMP matrix 以及 40、 50、 60、 70 或 80 的缺口加权与 1、 2、 3、 4、 5 或 6 的长度加权。一组优选的参数组 ( 当不确定哪 些参数可用以决定一分子是否为本发明相同或同源的序列时， 可使用此组参数 ) 为， 使用 Blossum 62scoring matrix 以及 12 的缺口罚分 (penalty)、 4 的缺口延伸罚分与 5 的框架 位移 (frame shift) 缺口罚分。两氨基酸 ( 或核苷酸 ) 序列之间的相同百分比也可以利用 已并入 ALIGN 程序 (2.0 版 ) 的 E.Meyers and W.Miller((1989)CABIOS、 4： 11-17) 算法决 定， 使用 PAM120 weight residue table 以及 12 的缺口长度罚分与 4 的缺口罚分。
II.TAT-HOXB4H 重组蛋白质制造方法
A. 选殖与表现
用于在各种宿主细胞中选殖与表现蛋白质的系统， 在本领域中已经广为人知。适 用于制造蛋白质的细胞， 例如 ： Fernandez et al.(1999)Gene Expression Systems。简而 言之， 适合的宿主细胞包含哺乳动物细胞、 昆虫细胞、 植物细胞、 酵母细胞或原核细胞 ( 例 如 E.coli)。本领域中用于异源蛋白质表现的哺乳动物细胞， 包含淋巴细胞株 ( 例如 NSO)、 HEK293cells、 中国仓鼠卵巢细胞 (CHO)、 COS cells、 HeLa cells、 幼仓鼠肾细胞、 卵母细胞 以及来自基因转殖动物的细胞， 例如 ： 乳腺上皮细胞。合适的载体可以构筑成含有适当的 调节序列， 包含启动子序列、 基因终止序列、 多聚腺苷化序列、 增强子序列、 标记基因以及其 它序列。载体可含有质体或病毒骨架。细节参见 Sambrook et al. ： Molecular Cloning ： A Laboratory Manual、 2nd ed.， Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)。 许多载体相 关技术， 包含操作、 制备、 形成突变、 序列解读以及 DNA 转染 (transfection) 描述于 Current Protocols in Molecular Biology， Second Edition， Ausubel et al.eds.， John Wiley & Sons(1992)。
本发明还提供了一种将核苷酸送入宿主细胞的方法。对于原核细胞， 适合的转染 技术包含磷酸钙、 DEAE-Dextran、 电穿孔、 脂小体中介转染以及利用反转录病毒或其它病 毒， 例如 ： 牛痘病毒 (vaccinia) 或杆状病毒 (baculovirus)。对于细菌细胞， 适合的技术包 含氯化钙转化 (transformation)、 电穿孔以及利用脂小体中介转染以及利用噬菌体转染。 DNA 送入之后， 可以接着以选择方法 ( 例如药物抵抗 ) 来选择含有核苷酸的细胞。
B. 纯化与在再折迭
TAT-HOXB4H 蛋白质可以利用本领域任何已知的适当手段由重组宿主细胞单离。 例 如： 当蛋白质可被分泌时， 其可以由细胞上清液中分离 ； 或者蛋白质可由细胞溶解产物中 分离。
TAT-HOXB4H 蛋白质可以利用层析法纯化， 其包含 ： (a) 将细胞溶解产物或细胞上 清液 ( 假如蛋白质可被分泌 ) 通入一 HisTrap 管柱 ； (b) 以一缓冲溶液冲洗该 HisTrap 管 柱； (c) 将该部分纯化的蛋白质由该 HisTrap 管柱溶离出 ； (d) 将由 HisTrap 管柱收到的部 分纯化的蛋白质通入一 MonoSP 管柱 ； (e) 以一缓冲溶液冲洗该 MonoSP 管柱 ； (f) 将纯化的 蛋白质由 MonoSP 管柱溶离出。
细胞溶解产物或细胞上清液 ( 假如蛋白质可被分泌 ) 可以在 4℃下以 20,000xg 离心 30 分钟使其澄清。将上清液调整至 10mM 咪唑并加入 HisTrap 螯合管柱 (AmershamPharmacia)。以 8M 尿素， 20mM HEPES， 0.5mM DTT， 100mM NaCl pH8.0 缓冲溶液以及 10mM 咪唑冲洗管柱， 以移除未结合蛋白质。部分纯化的蛋白质可利用高浓度的咪唑以及盐由该 HisTrap 管柱溶离。
进一步纯化指将由 HisTrap 管柱收到的部分纯化的蛋白质通入 MonoSP 管柱 (Amersham Pharmacia)。 以 4M 尿素， 20mM HEPES， 50mM NaCl pH6.5 缓冲溶液一缓冲溶液冲 洗管柱， 以移除未结合蛋白质。结合的 TAT-HOXB4H 可利用高浓度的盐溶离。此纯化步骤所 得的 TAT-HOXB4H 蛋白质系呈变性形式。
接着， 利用疏水性化合物将由 HisTrap 管柱溶离的呈变性的 TAT-HOXB4H 蛋白质以 下列步骤再折迭 ： (i) 将该溶离出的变性蛋白质与一疏水性化合物溶液混合形成一蛋白质 与疏水性化合物溶液 ； (ii) 将该蛋白质与疏水性化合物溶液去盐而得一蛋白质与疏水性 化合物去盐溶液 ； (iii) 利用超过滤制程将该疏水性化合物由该蛋白质与疏水性化合物去 盐溶液中移除。
本发明中， “疏水性化合物” 是指任何可以在变性去盐步骤中， 保护蛋白质使其不 产生不溶性沈积的疏水性化合物。适用于本发明的疏水性化合物系描述于 Oganesyan et al.、 Pharmagenomics(2004)71、 22-26。合适的疏水性化合物包括 Triton X-100、 tween-20 或多苯环化合物。该超过滤制程或缓冲溶液转换可藉由蛋白浓缩管柱 (centricon tube) 或蛋白超滤膜 (stir cell) 进行。该超过滤制程或缓冲溶液转换的条件视蛋白质的种类而 定。 在本发明的一个实施例中， 在含有 HOXB4H 蛋白质的去盐溶液中的疏水性化合物 系藉由 5-10 次的缓冲溶液转换 ( 每次以 1000-2500xg 离心 10 分钟 ) 来移除， 该缓冲溶液 转换系以由低至高浓度的大分子疏水性物质 ( 例如环糊精 (cyclodextrin)) 溶液进行， 藉 此使变性的 HOXB4H 蛋白质再折迭恢复成天然形式 (native form)。
在本发明又一实施例中， 纯化的 TAT-HOXB4H 蛋白质可储存在 IMDM(HyClone) 培养 基 ( 储存缓冲溶液 1) 中， 4℃或 -20℃。
在本发明又一实施例中， 纯化的 TAT-HOXB4H 蛋白质可储存在 DMEM(HyClone) 培养 基 ( 储存缓冲溶液 2) 中， 4℃或 -20℃。
在本发明又一实施例中， TAT-HOXB4H 蛋白质 C 端的组胺酸标记可以在进行体内给 药的前移除。
在本发明又一实施例中， TAT-HOXB4H 蛋白质 N 端的组胺酸标记可以在进行体内给 药的前移除。
在本发明又一实施例中， TAT-HOXB4H 蛋白质 N 端的及 C 端的组胺酸标记可以在进 行体内给药的前移除。
C. 制备医疗组成物
当与药学上可接受的载剂结合时， TAT-HOXB4H 可作为医疗组成物使用。除了 TAT-HOXB4H 蛋白质与载剂之外， 此医疗组成物可包含各式各样的稀释剂、 填充剂、 盐类、 缓 冲剂、 安定剂、 助溶剂以及本领域中其它已知的材料。 “药学上可接受” 是指不会干扰活性剂 生物活性的有效性的无毒材料。载剂的特性视给药途径而定。
由于剂量均一以及服用方便， 将组成物配方成剂量单元形式系较有利的。剂量单 元形式在此处指， 用于被治疗对象单元剂量的物理上可分开的单元。每一单元含有一预先
设定量的活性剂， 用以结合所要的医药载体， 产生所要的治疗效果。 本发明剂量单元形式的 规格系视活性剂的独特性质、 所要达成的特定治疗效果而定。
典 型 的 给 药 路 径， 包 含 口 服、 外 用、 非 肠 道 ( 例 如 舌 下 或 口 含 )、 舌 下、 直 肠、 阴 道 以 及 鼻 内。 “非 肠 道 (parenteral)”在 此 处 包 含 皮 下 的 (subcutaneous)、 皮内的 (intracutaneous)、 静 脉 内 的 (intravenous)、 肌 肉 注 射 (intramuscular)、 胸骨内的 (intrasternal)、 阴茎海绵体内注射、 鞘内的 (intrathecal)、 耳道内 (intrameata)、 尿道 内 (intraurethral) 注射以及任何适当的注入技术。医疗组成物指配方成容许其所含有的 活性剂在给予患者时具有生物可利用性。 医疗组成物可以一个或一个以上的剂量单元给予 患者， 例如一个锭剂可以是单一剂量单元， 而以喷雾剂形式的容器可含有复数个剂量单元。
当以口服给予治疗有效量的 TAT-HOXB4H 蛋白质时， 结合剂可以是以锭剂、 胶囊、 药粉、 溶液或酏剂 (elixir) 的形式。当以锭剂形式给药时， 本发明的医疗组成物可另包 含固体载剂例如明胶， 或佐剂。锭剂、 胶囊、 药粉可含有 5 ％至 95 ％的结合剂 (binding agent)， 优选为含有 25％至 90％的结合剂。也可加入显色剂或调味剂。可使用膜衣层。当 以液体形式给药时， 可加入液体载剂例如水、 石油 (petroleum)、 动物油或植物油 ( 例如花 生油、 矿物油、 大豆油、 芝麻油 ) 或合成油。以液体形式的医疗组成物可另包含生理食盐水、 葡萄糖或其它醣类溶液或二醇例如乙二醇、 丙二醇或聚乙二醇。 当以液体形式给药， 医疗组 成物可含有 0.5％至 90％的结合剂， 优选为含有 1％至 50％的结合剂。
当以静脉、 皮肤或皮下注射给予一治疗有效量的 TAT-HOXB4H 蛋白质时， 可以是无 致热原的非肠道 (parenterally) 可接受的水溶液的形式。制备具有应有的 pH 值、 等张性、 安定性的非肠道可接受蛋白质溶液， 属于该技术领域的公知技术。 在某些实施例中， 用于静 脉、 皮肤或皮下注射的医疗组成物可包含等张载体， 例如 ： 氯化钠注射液、 林格氏液、 葡萄糖 注射液、 葡萄糖及氯化钠注射液、 乳酸林格注射液或其它本领域公知的载体。 本发明的医疗 组成物还可包含安定剂、 防腐剂、 缓冲剂、 抗氧化剂或其它本领域公知的添加剂。
在进行本发明治疗方法或使用本发明时， 先将治疗有效量的 TAT-HOXB4H 蛋白质 给予使用者， 例如一哺乳类动物， 当然， 也可以是人类。 “治疗有效量” 在此处指该医疗组成 物中活性剂的总量足以产生积极的效果， 例如症状减轻、 治愈或增加治愈率。 当用在单一活 性剂且单独给药时， “治疗有效量” 单指该活性剂。当用于一组合时， “治疗有效量” 指所有 活性剂足以产生治疗效果的总合量， 不论该些活性剂指系列性组合给药或同时组合给药。
TAT-HOXB4H 蛋白质在本发明医疗组成物中的含量视欲治疗症状的严重性与本质、 患者先前接受的治疗本质以及患者的年龄及性别而定。最后， 主治医师可以决定个别患者 活性剂给药量。刚开始， 主治医师可以给予低剂量的活性剂， 并观察患者的反应。可给予较 大剂量的活性剂直到患者得到适当的治疗效果， 此时一般不会再增加剂量。用以实施本发 明方法的医疗组成物可含有每公斤体重约 1g 至约 1mg 的 TAT-HOXB4H 蛋白质。给予使用者 的剂量范围可选自 1μg/kg 至 1mg/kg、 1μg/kg 至 0.5mg/kg、 1μg/kg 至 0.1mg/kg、 10μg/ kg 至 0.5mg/kg、 10μg/kg 至 0.1mg/kg、 100μg 至 0.5mg/kg、 250μg/kg 至 0.5mg/kg。 此外， 剂量范围可选自 50μg 至 100mg、 100μg 至 50mg、 500μg 至 50mg、 1mg 至 50mg。使用本发 明医疗组成物的静脉注射时间视欲治疗的疾病严重性以及个别患者的特异反应而定。 在本 发明又一实施例中， 施以本发明 TAT-HOXB4H 蛋白质的时间可以是 12 至 24 小时的连续静脉 注射。在本发明又一实施例中， 本发明 TAT-HOXB4H 蛋白质可持续使用， 只要患者继续在进行化疗或放射线治疗。TAT-HOXB4H 蛋白质可以静脉注射 10-100μg/kg， 一天两次， 4.5 至 5 天。一次治疗循环可能就足以在体内扩增造血干细胞。最后， 主治医师可以决定使用本发 明医疗组成物的适当静脉注射时间。
化合物毒性以及治疗效价可以标准的药剂学程序以细胞培养或实验动物决定， 例 如 LD50( 总数 50％致死剂量 ) 以及 ED50( 总数 50％有效治疗剂量 )。毒性以及治疗间的剂 量比例即为治疗指数， 其可以 LD50/ED50 表示。细胞培养与实验动物的数据可以用来评估用 于人类的剂量范围。化合物剂量可以在包含 ED50 且毒性小或无毒的循环浓度范围内。视所 使用的剂型与给药途径， 剂量可在上述范围内变化。TAT-HOXB4H 的有效治疗剂量可以由细 胞培养试验初步估计。 在动物模型中， 剂量可以是达到包含 IC50( 也即测试蛋白质达到最大 症状抑制一半的浓度 ) 的循环血浆浓度范围， 就如同细胞培养决定的方式。血浆浓度可以 利用高效液相层析测定。任何特定剂量的效果可以藉由适当的生物检定法 (Bioassay) 监 测。适合的生物检定法包含， 但不限于， 利用标记有荧光探针 ( 例如 FITC) 的 CD34+ 干细胞 抗体来量测在单核细胞内的 CD34+ 干细胞， 以及利用流式细胞仪量测在外围血液或骨髓造 血干细胞中的 LY5 细胞比例。本发明的多核苷酸与蛋白质系预期可展现下述的一个或一个 以上的用途或生物活性。 本发明蛋白质的用途或活性可以由给药或使用此蛋白质的方式提 供， 也可由给药或使用编码此蛋白质的多核苷酸的方式 ( 例如基因疗法或适用于送入 DNA 的载体 ) 提供。 III. 体内造血刺激方法
A. 需要治疗的患者
本发明的医疗组成物可用于治疗自体免疫疾病、 免疫不全症以及血液疾病。 此外， 本发明的医疗组成物可用于改善造血干细胞移植后的恢复时间。 本发明的医疗组成物可用 于治疗罹患淋巴瘤、 白血病、 霍奇金氏症以及骨髓增生性疾病的患者。此外， 造血干细胞缺 乏而造成的先天性疾病以及再生不良贫血也可以本发明的医疗组成物治疗。
此外， 本发明的医疗组成物可用于造血干细胞捐赠者以及颗粒球细胞生长因子 (G-CSF) 不敏感患者。
在本发明又一实施例中， TAT-HOXB4H 是被用来动员造血干细胞的唯一活性剂， 并 且氟脲嘧啶 (5-FU) 并未给予捐赠者， 不论是作为预处理或综合治疗计划。
可以用本发明医疗组成物治疗的额外的疾病或与增加细胞生存相关的症状包括 恶性肿瘤及相关疾病的进行及 / 或转移， 例如早幼粒细胞白血病 ( 包括急性白血病 ( 例如 ： 急性淋巴细胞性白血病， 急性髓细胞性白血病 ( 包括髓细胞、 早幼粒细胞、 粒细胞、 单核细 胞、 红白血病 )) 和慢性白血病 ( 例如 ： 慢性粒细胞 ( 颗粒细胞 ) 白血病和慢性淋巴细胞白 血病 )， 骨髓形成异常症 (myelodysplastic syndrome)， 真性红血球增多症 (polycythemia vera)， 淋巴瘤 ( 例如 ： 霍奇金氏症和非霍奇金氏症 )， 多发性骨髓瘤， 巨球蛋 白血症以及实体瘤， 包括肉瘤和癌瘤， 例如 ： 纤维肉瘤， 黏液肉瘤， 脂肪肉瘤， 软骨肉瘤， 骨肉 瘤， 脊索瘤， 血管肉瘤， 内皮细胞肉瘤， 淋巴管肉瘤， 淋巴管内皮瘤， 滑膜瘤， 间皮瘤， 尤文氏 瘤， 平滑肌肉瘤， 横纹肌肉瘤， 结肠癌， 胰脏癌， 乳腺癌， 卵巢癌， 前列腺癌， 鳞状细胞癌， 基底 细胞癌， 腺癌， 汗腺癌， 皮脂腺癌， 乳头状癌， 乳头状腺癌， 囊腺癌， 髓样癌， 支气管癌， 肾细胞 癌， 肝癌， 胆道癌， 绒癌， 精母细胞瘤， 胚胎瘤， 威姆氏瘤， 子宫颈癌癌， 睾丸肿瘤， 肺癌， 小细 胞肺癌， 膀胱癌， 上皮癌， 胶质瘤， 星形细胞瘤， 髓母细胞瘤， 颅咽管瘤， 室管膜瘤， 松果腺瘤，
血管母细胞瘤， 听神经瘤， 胶质瘤， 黑色素瘤， 神经母细胞瘤以及视网膜母细胞瘤。
本发明并不限于特定的方法、 实验计划、 细胞株、 动物物种或属或下述的试剂。所 用来描述特定实施例的术语不能用以限定本发明的范围， 本发明的范围应以权利要求书的 范围为准。此处使用的， 单数形式的 “一” 与 “该” ， 除非文意另有所指外， 也包含复数个。因 此， 举例来说， “一个细胞” 是指一个或多个细胞， 并且包括本技术领域中已知的均等物。
除非另外定义， 否则所有的技术和科学所用词汇具有与本发明所属技术领域中熟 悉此技术者相同涵义的理解。 虽然任何方法， 组件和材料相似或均等于在此描述的， 都可用 于实践或试验本发明， 优选的方法， 组件和材料于现在描述。 所有此处提及的刊物和专利在 此并入用以描述和公开， 举例来说， 描述于刊物内的构造和方法， 可与目前所描述的发明结 合。先前以及本文中讨论的刊物仅提供作为本案有效日期前的公开。所有皆不可解释为承 认发明人无法凭借先前发明来预见此公开。
定义 ：
“干细胞” 是一种多能或多潜能细胞， 其有能力自我更新， 以保持未分化， 以及成为 已分化。干细胞， 至少在动物自然存在的一生中， 可以无限分裂。干细胞并非末期分化， 即 它们不是在分化途径末端。 当干细胞分裂， 每个子细胞， 可仍然是一个干细胞或可以走向出 一条导致末期分化的路。 “嵌合体” 干细胞是指干细胞的一部分 DNA 属于一个异种生物体。 “造血” 细胞是指涉及造血过程 ( 也即前体细胞形成成熟血液细胞的过程 ) 的一种 细胞。在成人， 造血发生在骨髓。在发育早期， 在不同发育阶段， 造血发生在不同的地点 ； 原 始血液细胞出现于卵黄囊， 后来， 血液细胞形成在肝、 脾和骨髓。 造血有复杂的调控， 包括激 素 ( 例如红血球生成素， 生长因子 ( 例如集落刺激因子和细胞因子 ( 例如介白素 )))。
此处使用的 “载体” 是指能够运送另一种核酸的核酸分子， 该另一种核酸连接于该 核酸分子上。一种类型的载体是一个 “质体” ， 这指的是一个圆形双股 DNA 环， 额外的 DNA 片段可接合在其中。另一种类型的载体是病毒载体， 其中额外的 DNA 片段可接合在病毒 基因体中。某些载体有能力在所送入的宿主细胞中自主复制 ( 例如具有一个细菌复制来 源的细菌载体和附加体质粒 (episomal) 哺乳动物载体 )。其它载体 ( 例如非附加体质粒 (episomal) 哺乳动物载体 ) 可以在送入宿主细胞时整合到宿主细胞的基因体中， 从而随着 宿主基因体复制。此外， 某些载体， 是有能力指挥其所连接的基因表现。这种载体在此是称 为 “重组表现载体” ( 或简单地说 “表现载体” )。一般来说， 用于 DNA 重组技术的表现载体 通常是以质体的形式。在本发明中， “质体” 与 “载体” 可以互换使用， 因为质体是最常用的 载体形式。然而， 本发明包括具有等同功能的其它形式的表现载体， 例如病毒载体 ( 例如复 制缺陷的反转录病毒、 腺病毒和腺相关病毒 )。
此处使用的 “转化” 是指将一个外源多核苷酸送入宿主细胞， 不论用什么方法送 入： 举例来说， 直接吸收转化、 转染以及感染等。特定的转染方法见于下文。外源多核苷酸 可能是以未插入载体的形式 ( 例如 ： 质粒 )， 或者可能被整合到宿主基因体中。
一般来说， “蛋白质” 是指任何两个或两个以上的个别氨基酸由胜肽键 (peptide bond) 接合的聚合物 ( 不论是否自然发生 )， 该胜肽键指当键结在一个氨基酸 ( 或氨基酸残 基 ) 的 α 碳的羧酸基的羧基碳原子， 与键结在相邻氨基酸 ( 或氨基酸残基 ) 的 α 碳的胺基 的氨基氮原子， 所形成的共价键结。 该胜肽键连接及其所包含的原子 ( 也即 α 碳原子、 羧基 碳原子 ( 以及其氧原子取代基 ) 以及氨基氮原子 ( 以及其氢原子取代基 )) 形成蛋白质的
“多胜肽骨架” 。此外， 此处使用的 “蛋白质” 可以理解为包括 “多胜肽” 以及 “胜肽” ( 其有 时可以交互使用 )。同样， 蛋白质片段， 类似物， 衍生物以及突变物可在此称为 “proteins” ， 除非另有说明， 也应被视为是一 “蛋白质” 。蛋白质 “片段” 是指包含少于一个蛋白质所有氨 基酸残基的多胜肽。可以理解的是， 蛋白质 “片段” 可能是一个在 N 端、 C 端或内部 ( 例如受 天然的剪接 (splicing) 所致 ) 截短的蛋白质， 可以是突变物及 / 或衍生物。蛋白质 “功能 区块 (domain)” 也是一个片段， 其包含赋予蛋白质生化活性所需的氨基酸残基， 对应于自然 存在的蛋白质。
“重组” 在此处指一个核酸分子， 基因组， 基因， 病毒， 半合成， 或合成的， 其一部分 或全部的多核苷酸并非天然。 “重组” 相对于一蛋白质或多胜肽而言， 指以重组多核苷酸表 现产生的多胜肽。
一个 “单离的” 、 “纯化的” 、 “实质上单离的” 或 “实质上纯化的” 分子 ( 如一个多胜 肽或核苷酸 ) 指被人为操作使相较于自然有较高的浓度。举例来说， 当标的蛋白质被单离、 纯化、 实质上单离或实质上纯化， 指至少有 50％， 70％， 75％， 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％， 99％或以上的天然存在的非标的蛋白质物质被移除。 此 处使用的 “单离的” 、 “纯化的” 、 “实质上单离的” 或 “实质上纯化的” 分子包括重组分子。 SCID“小鼠” 指重度联合免疫缺陷 (SCID) 小鼠模型， SCID 会造成免疫系统发育的 严重缺陷。无论是 T 或 B 淋巴球， 这些小鼠皆不足或完全缺乏。该 SCID 突变似乎损害抗原 受体基因的重组， 导致缺乏功能性的 T 与 B 淋巴球。其它造血细胞类型可正常发展和运作。 SCID 小鼠随时支持正常淋巴球分化， 并且可与来自同基因或异基因小鼠的正常淋巴球重组 或与人类淋巴球重组。这些小鼠还支持异基因和异种基因肿瘤的生长。因此， SCID 小鼠允 许一些人类肿瘤的扩散增长， 特别是血液系统疾病以及恶性黑色素瘤， 因此可用于研究恶 性肿瘤。
“使用者” 、 “个人” 、 “宿主” 以及 “病人” 在此处可互换使用， 用以指活的动物， 包括 人类和非人类的动物。使用者可能是， 举例来说， 一个拥有免疫细胞的有机体， 该免疫细胞 能对抗源刺激产生反应， 并且能对经由细胞表面的受体结合传递的刺激和抑制信号产生反 应。使用者可以是一个哺乳类动物， 例如人或非人类的哺乳动物， 例如狗， 猫， 猪， 牛， 绵羊， 山羊， 马， 大鼠以及小鼠。 “使用者” 并不排除， 相对于疾病或各方面， 完全正常的个人。
“治疗” 指的是一个治疗性或预防性的措施。治疗可施加于具有医疗疾病的使用者 或最终会得到疾病者， 用以预防、 治疗、 延误、 减少严重性或改善一个或一个以上疾病或反 复发生的疾病的症状， 或用以延长使用者生存期间使其超过没有治疗所预期的生存期间。
“治疗有效量” 是指主化合物可引起预期反应 ( 例如经由研究员、 兽医、 医生或其它 的临床医师所认定的组织、 制度、 动物、 动物或人类的生物或医学反应 ) 的量。
以下具体的例子是， 以被视为仅仅是说明性的， 无论在任何情况皆不是用以限定 本发明的其它部分。本技术领域中普通技术人员可基于本申请文件的叙述而实施本发明。
实例例 1 ： pET21b-His-TAT-HOXB4-His 质体的构筑
(a)N- 端及 C- 端含有组胺酸标记及 TAT 讯号胜肽的 pET21b 质体的修改 N- 端含有 组胺酸标记及 TAT 讯号胜肽的 pET21b 表现载体由在 pET21b 质体插入下列寡核苷酸而得 ：
5’ -TATGCACCACCACCACCACCACTACGGCCGCAAGAAACGCCGCCAGCGCCGCCGGCG-3’ ( 正股 (sense)) 及
5’ -CTAGCGGCGCTGGCGGCGTTTCTTGCGGCCGTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCA-3’ ( 反 股 (antisense))。C- 端组胺酸标记原本就存在于 pET21b 质体中。
(b) 将 HOXB4 选殖入修改后的 pET21b 表现质体
含有 HOXB4 开放读框 (ORF) 以及额外六组胺酸编码序列的 DNA 片段， 以 MGC54130 质体 (GeneDiscovery， Taipei， Taiwan.Cat.No.5533346) 为模板， 利用聚合酵素链锁反应 (PCR) 放大而得， 将 PCR 所得的 HOXB4cDNA 片段次选殖 (subclone) 到修改后的 pET21b 表现 质体。构筑的质体以及核酸序列系如图 2 及图 3 所示。
实例例 2 ： 在大肠杆菌表现 TAT-HOXB4H 重组蛋白质
将 pET21b-His-TAT-HOXB4-His 表现质体转化至 BL21(DE3)pLysS(Novagen) 大肠 杆菌株。令经转化的细胞于 37℃下生长过夜。将过夜培养物稀释成起始 OD600 值为 0.05， 并置于 37℃下生长至 D600 值为 0.5， 接着以 1mM 异丙基硫代 -β-D- 半乳糖 (IPTG) 于 37℃ 下进行诱导表现 3 小时， 期间伴随剧烈摇晃。
实例例 3 ： TAT-HOXB4H 重组蛋白质的纯化
在诱导作用后， 将细胞以离心收集并再悬浮于缓冲液 A(8M 尿素， 20mM HEPES， 0.5mM DTT 及 100mM NaCl pH8.0) 中。将细胞悬浮液通过 French press 三次， 并将细胞溶 解产物以 20,000×g 于 4℃下离心 30 分钟使其澄清。将上清液调整至 10mM 咪唑并加样至 HisTrap 螯合管柱 (Amersham Pharmacia)。将结合的蛋白以 50、 100 及 250mM 配制于缓冲 液 A 中的咪唑进行溶离。 将含有 TAT-HOXB4H 的流份 (fraction) 加样至存在缓冲液 B(4M 尿 素， 20mM HEPES 及 50mM NaCl pH6.5) 的 MonoSP 管柱， 以 1.5M NaCl 及 20mM HEPES(pH8.0) 溶离。
实例例 4 ： TAT-HOXB4H 重组蛋白质的复性 (renaturation)
将溶离流份中的 TAT-HOXB4H 蛋白质溶解并变性于一含有变性盐类 ( 例如胍盐 酸盐 (guanidine hydrochloride)) 的溶液， 然后将其与 D-PBS-T 缓冲溶液 ( 含有 0.1 ％ Triton X-100 的两倍磷酸盐缓冲溶液 ) 混合。TAT-HOXB4H 蛋白质溶液与 D-PBS-T 缓冲溶 液的比例为 1 ： 4。将所成的混合液加入以水 (10ml or 3ml) 前处理的 10K 蛋白浓缩管柱 (centricon tube)(50ml or 15ml)， 离心 3000r pm， 10 分钟。在此步骤中， 变性盐类系被 D-PBS-T 缓冲液置换， D-PBS-T 缓冲液中的 Triton X-100 系可与 HOXB4H 蛋白质的疏水性 (Hydrophobic) 区域结合
接着以 10K 蛋白浓缩管柱 (centricon tube) 进行超过滤或缓冲溶液置换步骤 10 次， 以 1000-2500g/min 离心速度， 依序将缓冲液置换为含 1mM、 2mM、 3mM、 4mM 及 5mM β- 环 糊精 (beta-cyclodextrin) 的 IMDM 储存缓冲液， 其中于各离心速度下以每种浓度置换离心 两次。收集浓缩管柱中留存的样品， 并保存于 -20℃冰箱。
纯 化 后 TAT-HOXB4H 蛋 白 质 的 均 一 性 系 以 SDS-polyacrylamide 凝 胶 以 及 coomassie 染色分析。如图 5 所示， 经 HisTrap and MonoSP 纯化的 TAT-HOXB4H 较原始 TAT-HOXB4 蛋白质的产率增加大约 3-5 倍。pTAT-HA-HOXB4 质体， 系加拿大蒙特娄大学 (University of Montreal) 的盖· 萨瓦格 (Guy Sauvageau) 博士所赠。pTAT-HA-HOXB4 质 体系转化至 BL21(DE3)pLys S(Novagen)， TAT-HOXB4 蛋白质的纯化系如 Krosl 等人 (2003) 所述。
实例例 5 ： TAT-HOXB4H 重组蛋白质的安定性TAT-HOXB4H 的 安 定 性 系 以 SDS-polyacrylamide 凝 胶 分 析。 储 存 时， 全长的 TAT-HOXB4H 可能会降解为 30kD 与 10kD 片段。如图 6 所示， 本发明的 TAT-HOXB4H 蛋白质即 使在 PBS， -4℃中储存 16 小时依然安定。
此 外， 储 存 在 -4 ℃ 以 及 -20 ℃， PBS 以 及 IMDM 缓 冲 液 的 TAT-HOXB4H， 以 10 ％ SDS-polyacrylamide 凝胶电泳以及 coomassie 染色分析。如图 7 所示， 当储存在 IMDM 储存 缓冲液中， 本发明的 TAT-HOXB4H 蛋白质可维持 4 星期。
实例例 6 ： TAT-HOXB4H 重组蛋白质对于 Balb/c 小鼠的造血影响
TAT-HOXB4H 重组蛋白质对于造血干细胞由骨髓动员至外围血液的可能影响系利 用 Balb/c 小鼠研究。 每天四次皮下注射 4 天给予小鼠 TAT-HOXB4H 重组蛋白质 ( 在 PBS 中 )。 为了解剂量反应性， 试验组 (n ＝ 21) 的剂量为 1μg、 5μg、 10μg、 15μg...to 100μg/ kg 体重。一组对照组只施打 PBS， 另一组对照组则每天两次皮下注射 4 天 5μg/kg 体重的 G-CSF。
取各组周边血液进行流式细胞仪分析， 可得到 CD34+ 干细胞在单核细胞 (MNC) 中 的比例。结果以平均值 ± 标准差的形式列于表一。
表一
组别 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 TAT-HOXB4H(g/kg) 1 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 CD34+/MNC(％ ) 0±0.03 0.3±0.05 0.45±0.03 0.42±0.01 0.38±0.05 0.41±0.02 0.35±0.21 0.33±0.11 0.29±0.16 0.46±0.01 0.45±0.02 0.42±0.06 0.44±0.0215CN 102805859 A 14 15 16 17 18 19 20 21 对照组 (PBS) 对照组 (G-CSF)
65 70 75 80 85 90 95 100 0 0说明书0.41±0.04 0.41±0.03 0.49±0.01 0.45±0.04 0.46±0.07 0.44±0.02 0.41±0.01 0.42±0.05 0.002 0.5±0.0314/15 页周边血液内 CD34+/MNC 的比例系列于表一。 接受 TAT-HOXB4H 的第 3-21 实验组 ( 剂 量至少为 10μg/kg 体重以上 ) 显示类似于注射 G-CSF 对照组的动员效果。
取实验组 3(TAT-HOXB4H 剂量为 10μg/kg 体重 ) 小鼠的骨髓以及注射 G-CSF 与 PBS 的对照组小鼠的骨髓， 以 CD34+FITC-conjugated 抗体 (Becton Dickinson) 表型， 并以 + 流式细胞仪分析。注射 TAT-HOXB4H 的小鼠骨髓 ( 图 8C)， 其 CD34 干细胞比注射 G-CSF 与 PBS 的小鼠骨髓多。 这些结果显示注射 TAT-HOXB4H 重组蛋白质可以同时增加小鼠骨髓中以 及外围血液中的造血干细胞。
实例例 7 ： TAT-HOXB4H 重组蛋白质对于恒河猴的造血影响
TAT-HOXB4H 重组蛋白质在猴类的效力系利用成年的公恒河猴研究。 试验组 I(n ＝ 5) 系每天四次静脉注射 4 天给予 TAT-HOXB4H 重组蛋白质 ( 剂量 10μg/kg 体重 )。试验组 II(n ＝ 5) 系每天四次静脉注射 4 天给予 TAT-HOXB4H 重组蛋白质 ( 剂量 10μg/kg 体重 ) 以及皮下注射 G-CSF( 剂量 5μg/kg 体重 )。对照组 I 只施打 PBS， 对照组 II 则每天两次皮 下注射 4 天 G-CSF( 剂量 5μg/kg 体重 )。取所有猴子的周边血液进行流式细胞仪分析， 可 + 得到 CD34 干细胞在单核细胞 (MNC) 中的比例。结果列于表二。
表二
如表二所示， 只接受 TAT-HOXB4H 的猴子 ( 实验组 I) 显示出比注射 G-CSF 的猴子 ( 对照组 II) 更好的动员效果。同时注射 TAT-HOXB4H 以及 G-CSF 的猴子 ( 实验组 II) 显示 出比注射 G-CSF 的猴子 ( 对照组 II) 的动员效果好一点。
取注射 TAT-HOXB4H、 G-CSF 以及 PBS 的猴子骨髓样本， 以 CD34+FITC-conjugated 抗体 (Becton Dickinson) 表型， 并以流式细胞仪分析。注射 TAT-HOXB4H 的猴子骨髓 ( 图 + 9C)， 其 CD34 干细胞系远多于注射 G-CSF 的猴子骨髓 ( 图 9A)、 注射 TAT-HOXB4H+G-CSF 的
猴子骨髓 ( 图 9B) 及注射 PBS 的猴子骨髓 ( 图 9D) 中的 CD34+ 干细胞。
实例例 8 ： TAT-HOXB4H 重组蛋白质对于 NOD-SCID 小鼠的造血回复影响 4
将 10 Lin-/CD34+ 细 胞 以 及 经 放 射 线 照 射 的 105CD34- 辅 助 细 胞 注 射 至 NOD-LtSz-scid/scid(NOD-SCID) 小鼠 ( 经放射线照射 (2.5Gy)) 中。将上述小鼠随机分为 两组， 一组 (n ＝ 28) 每日静脉注射两次 TAT-HOXB4H 蛋白质 ( 剂量 10μg/kg 体重 )， 另一 + 组 (n ＝ 28) 每日注射两次 PBS。植入后， 以人类 CD45 细胞存在鼠类周边血液中的比例达 0.1％以上的小鼠数目来评估造血回复。如图 10 所示， 注射 TAT-HOXB4H 重组蛋白质的小鼠 可观察到较佳的造血回复。
实例例 9 ： TAT-HOXB4H 重组蛋白质对于接受 Cisplatin 化疗后 Balb/c 小鼠的造血 回复影响
重复以 cisplatin 静脉注射五周大 Balb/c 小鼠， 直到其外围血液中 Ly5(murine CD45) 细胞数目降为原始数目的 10％。将注射过 cisplatin 的小鼠随机分为两组， 一组 (n ＝ 28) 每日静脉注射两次 TAT-HOXB4H 蛋白质 ( 剂量 10μg/kg 体重 )， 另一组 (n ＝ 28) 每 日注射两次 PBS。以流式细胞仪周期性量测分析所有小鼠外围血液中存在的 Ly5 细胞。造 血回复比例系以外围血液中的 Ly5 细胞数目相对于原始数目的比例来评估。如图 11 所示， 注射 TAT-HOXB4H 重组蛋白质的小鼠可观察到较佳的造血回复。
这些实验中使用的动物模型已在本技术领域中被确认为可用以预测人类患者 的 结 果， 例如： Broxmeyer 等 人 (2005)The Journal of Experimental Medicine， 201， 1307-1318 ； Larochelle 等人 (2006)Blood 107， 3772-3778。
以上所述， 仅为本发明的具体实施方式， 但本发明的保护范围不局限于此， 任何熟 悉本技术领域的技术人员在本发明的技术范围内， 可轻易想到变化或替换， 都应涵盖在本 发明的保护范围之内。因此， 本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。