一种基于硅纳米线的药物载体制备方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102989006 A (43)申请公布日 2013.03.27 CN 102989006 A *CN102989006A* (21)申请号 201210579414.5 (22)申请日 2012.12.27 A61K 47/48(2006.01) A61K 47/04(2006.01) A61K 45/00(2006.01) A61K 31/704(2006.01) A61K 31/337(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (71)申请人 苏州大学 地址 215123 江苏省苏州市工业园区仁爱路 199 号 (72)发明人 何耀 彭飞 苏媛媛。

2、 李述汤 (74)专利代理机构 北京集佳知识产权代理有限 公司 11227 代理人 常亮 (54) 发明名称 一种基于硅纳米线的药物载体制备方法 (57) 摘要 本发明公开了一种基于硅纳米线的药物载体 的制备方法， 用缓冲溶液将硅纳米线配成 20200 微克每毫升的体系， 加入抗肿瘤药物混合成溶液， 在 2037 摄氏度下振荡 330 小时， 离心并用相同 缓冲溶液清洗 310 次， 除去上层未结合的抗肿瘤 药物， 得到下层沉淀即为硅纳米线 - 抗肿瘤药物 复合物。本发明的方法极大地提高了传统抗肿瘤 药物在载体中的负载效率， 操作安全， 快速简便， 所得的硅纳米线 - 抗肿瘤药物复合物能够在细。

3、胞 及活体层面不仅能够起到良好的杀伤癌细胞的作 用， 还能够起到药物缓释从而在较长时间内抑制 肿瘤生长的作用， 由于硅纳米线具有极大的载药 效率可以作为纳米药物广泛用于癌症治疗领域。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 一种基于硅纳米线的药物载体的制备方法， 其特征在于， 包括下述步骤 ： 用缓冲溶液将硅纳米线配成 20200 微克每毫升的体系， 加入抗肿瘤药物混合成溶液， 在 2037 摄氏度下振荡 330 小时， 离心并用。

4、相同缓冲溶液清洗 310 次， 除去上层未结合的 抗肿瘤药物， 得到下层沉淀即为硅纳米线 - 抗肿瘤药物复合物。 2. 根据权利要求 1 所述的制备方法， 其特征在于 ： 所述的硅纳米线直径为 50150 纳 米、 长度为 250750 纳米。 3. 根据权利要求 1 所述的制备方法， 其特征在于 ： 所述的缓冲溶液 pH 为 410。 4.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于 ： 所述的缓冲溶液为PB缓冲液、 PBS缓 冲液或碳酸盐缓冲液。 5. 根据权利要求 1 所述的制备方法， 其特征在于 ： 所述的抗肿瘤药物为盐酸阿霉素或 紫杉醇。 权 利 要 求 书 CN 102989006 。

5、A 2 1/6 页 3 一种基于硅纳米线的药物载体制备方法 技术领域 0001 本发明属于纳米生物医学技术领域， 涉及一种纳米材料药物载体的制备方法， 具 体涉及一种基于硅纳米线的药物载体的制备方法。 背景技术 0002 随着纳米生物技术的快速发展， 近年来纳米材料作为药物载体进行癌症治疗得到 了广泛的关注。传统的抗癌药物， 如 ： 盐酸阿霉素 （DOX） 和紫杉醇 （PTX） ， 会分布于正常组 织中并且能够快速的被肾脏清除， 只有极少量的抗肿瘤药物能够累积在癌症部位发挥作 用 （Clin.Cancer.Res.1999,5,1703-1707;Pharm.Res.2003,20,1337-。

6、1350;Clin.Cancer. Res.2005,11,8782-8788;Nat.Rev.Cancer.2006,6,583-592.） ， 因而在癌症治疗方面受到 极大的限制。 0003 为提高抗肿瘤药物在作用部位的药物浓度， 其有效的策略之一是设计高载药 效率的药物载体。近年来， 许多纳米材料由于其较大的比表面积、 多孔结构等优良的性 能被用于设计成高载药量的纳米药物载体， 如 ： 基于介孔硅的药物载体装载 DOX 的量为 1200mg/g（ACS nano2010,4,529-539;ACS Nano2011,5,7462-7470;Angew.Chem.Int. Ed.2011,。

7、50,8853-8857.） ； 氧 化 石 墨 烯 负 载 DOX 的 量 达 到 2350mg/g（J.Phys.Chem. C.2008,112,17554-17558;J.Am.Chem.Soc.2008,130,10876-10877;Small2011,7,460-464 .） ； 而单壁碳纳米管具有极高的 DOX 负载效率达到 4000mg/g（ACS Nano2007,1,50-56.） 。 然而尽管在癌症治疗领域取得如此巨大的进步， 发展具有更高载药效率的新型纳米药物载 体依然势在必行。 发明内容 0004 有鉴于此， 本发明的目的在于提供一种基于硅纳米线的具有更高负载效率的。

8、药物 载体的制备方法。 0005 与 传 统 硅 技 术 相 比， 硅 纳 米 结 构 （如 ： 纳 米 点、 纳 米 线、 纳 米 球 等）具 有良好的生物相容性、 优良的光电性质、 在体内易降解和极易进行表面修饰的 优点 （Nature2000,408,440-444;Science2003,299,1874-1877;J.Am.Chem. Soc.2007,129,7228-7229;Angew.Chem.Int.Ed.2009,121,134-138;J.Am.Chem. Soc.2009,131,4434-4438;J.Am.Chem.Soc.2011,133,14192-14195。

9、;Nat. Mater.2009,8,331-336;Nano Lett.2012,12,5532-5538.） 。 因 而，硅 纳 米 材 料 被 广 泛 用 于 生 物 领 域， 尤 其 是 硅 纳 米 线 （silicon nanowires,SiNWs）被 广 泛 用 于 生 物应用领域， 如 ： 基于 SiNWs 肿瘤成像和癌症热治疗的纳米探针 （Angew.Chem.Int. Ed.2011,123,3136-3139;ACS Nano2012,6,2582-2590;Nano.Lett.2012,12,1845-1850.） 。 近期相关工作表明硅纳米线由于大的比表面积和多孔结构。

10、在催化领域得到了很好的 应用 （J.Am.Chem.Soc.2009,131,17738-17739;Nano.Lett.2009,9,4539-4543;Nano. Lett.2009,9,3550-3554.） ， 而大的比表面积和多孔结构也是增大载药率的两个重要因素。 说 明 书 CN 102989006 A 3 2/6 页 4 0006 基于上述的理论基础， 发明人首次发展了利用硅纳米线作为新型纳米载体装载抗 肿瘤药物。 0007 为实现上述目的， 本发明提供如下技术方案 ： 0008 本发明的基于硅纳米线的药物载体的制备方法， 具体包括下述步骤 ： 0009 用缓冲溶液将硅纳米线配成。

11、 20200 微克每毫升的体系， 加入抗肿瘤药物混合成 溶液， 在 2037 摄氏度下振荡 330 小时， 离心并用相同缓冲溶液清洗 310 次， 除去上层未 结合的抗肿瘤药物， 得到下层沉淀即为硅纳米线 - 抗肿瘤药物复合物。 0010 优选的， 所述的硅纳米线直径为 50150 纳米、 长度为 250750 纳米。 0011 优选的， 所述的缓冲溶液 pH 为 410。 0012 优选的， 所述的缓冲溶液为 PB 缓冲液、 PBS 缓冲液或碳酸盐缓冲液， 其中 PB 缓冲 液表示磷酸盐缓冲液， PBS 缓冲液表示加了氯化钠的磷酸盐缓冲液。 0013 本发明以硅纳米线复合盐酸阿霉素 （DOX。

12、） 为例， 做负载效率测定及硅纳米线 - 盐 酸阿霉素 （SiNW-DOX）复合物对体外和体内癌症细胞的杀伤研究， 但不限于 DOX， 紫杉醇 （PTX） 及其他的抗肿瘤药物亦同样适用。 0014 优选的， 所述的抗肿瘤药物为盐酸阿霉素或紫杉醇。 0015 将上层未结合的 DOX 溶液用紫外 - 可见 - 近红外光谱仪测定 DOX 在特定吸收峰处 的吸光值， 从而计算出硅纳米线载药效率， 其负载效率不低于 10000 毫克每克， 甚至可以达 到 20000 毫克每克以上。 0016 利用 3-（4， 5- 二甲基噻唑 -2） -2， 5- 二苯基四氮唑溴盐标准比色 （MTT） 法进行硅 纳米线。

13、-抗肿瘤药物复合物对体外癌症细胞的杀伤研究， 本发明制备得到的SiNW-DOX复合 物在细胞层面起到良好的杀伤癌细胞的作用 ； 在45周龄雌性Balb/c裸鼠右侧背部皮下注 射 0.10.2 毫升密度为 51062107的癌细胞悬液进行硅纳米线 - 抗肿瘤药物复合物对 体内癌症细胞的杀伤研究， 本发明制备得到的 SiNW-DOX 复合物在较长时间内抑制肿瘤生 长增加了小鼠存活率。 0017 本发明的方法极大地提高了传统抗肿瘤药物在载体中的负载效率， 操作安全， 快 速简便。所得的硅纳米线 - 抗肿瘤药物复合物能够在细胞及活体层面不仅能够起到良好的 杀伤癌细胞的作用， 还能够起到药物缓释从而在较。

14、长时间内抑制肿瘤生长的作用。由于硅 纳米线具有极大的载药效率可以作为纳米药物广泛用于癌症治疗领域。 附图说明 0018 为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案， 下面将对实施例中所需要使用的 附图作简单地介绍， 显而易见地， 下面描述中的有关本发明的附图仅仅是本发明的一些实 施例， 对于本领域普通技术人员来讲， 在不付出创造性劳动的前提下， 还可以根据这些附图 获得其他的附图。 0019 图 1 是本发明制备得到的 SiNW-DOX 复合物在细胞层面杀伤癌细胞的对比曲线 图 ； 0020 图2是本发明制备得到的SiNW-DOX复合物在活体层面通过药物缓释杀伤癌细胞， 抑制肿瘤生长的对比曲线图。

15、。 说 明 书 CN 102989006 A 4 3/6 页 5 具体实施方式 0021 本发明的基于硅纳米线的药物载体的制备方法， 具体包括下述步骤 ： 0022 用缓冲溶液将硅纳米线配成 20200 微克每毫升的体系， 加入抗肿瘤药物混合成 溶液， 在 2037 摄氏度下振荡 330 小时， 离心并用相同缓冲溶液清洗 310 次， 除去上层未 结合的抗肿瘤药物， 得到下层沉淀即为硅纳米线 - 抗肿瘤药物复合物。 0023 优选的， 所述的硅纳米线直径为 50150 纳米、 长度为 250750 纳米。 0024 优选的， 所述的缓冲溶液 pH 为 410。 0025 优选的， 所述的缓冲溶。

16、液为 PB 缓冲液、 PBS 缓冲液或碳酸盐缓冲液。 0026 优选的， 所述的抗肿瘤药物为盐酸阿霉素或紫杉醇。 0027 下面将结合本发明实施例中的附图， 对本发明实施例中的技术方案进行详细的描 述， 显然， 所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例， 而不是全部的实施例。基于本发明 中的实施例， 本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施 例， 都属于本发明保护的范围。 0028 以下具体实施方式中用到的仪器、 药品试剂包括 ： 恒温振荡器、 离心机、 酶标仪、 紫 外 - 可见 - 近红外光谱仪、 PB 缓冲液、 PBS 缓冲液、 碳酸盐缓冲液、 盐酸阿霉素、 改良。

17、型 1640 培养基、 高糖 DMEM 培养基、 低糖 DMEM 培养基、 3-（4， 5- 二甲基噻唑 -2） -2， 5- 二苯基四氮 唑溴盐 （MTT） 、 十二烷基磺酸钠 （SDS） 、 浓盐酸、 生理盐水。 0029 实施例 1 0030 （1） SiNW-DOX 复合物制备 0031 将 20 微克 SiNWs 固体加入 100 微升 pH=9 的 PB 缓冲液中， 然后和 1 毫升 640 微克 每毫升的DOX溶液共同放入到一个1.5毫升离心管中， 于恒温振荡器中25摄氏度下反应12 个小时后， 离心机中离心， PB 缓冲液清洗可得到 SiNW-DOX 复合物溶液备用。 0032。

18、 （2） DOX 装载效率 0033 收集离心后的含有自由 DOX 的上清溶液， 利用紫外 - 可见光 - 近红外光谱仪通过 比色法测定 490 纳米处吸光值， 计算得到装载效率约为 20800 微克每克。 0034 （3） SiNW-DOX 复合物细胞毒性研究 0035 将含 20 微克每毫升 SiNW-DOX 复合物的高糖 DMEM 培养基， 加入含有 HeLa 细胞的 96 孔细胞培养板中孵育 24 小时， 经 MTT 法用酶标仪检测 570 纳米处吸光值。经计算 HeLa 细胞存活率下降到约 40%。 0036 实施例 2 0037 （1） SiNW-DOX 复合物制备 0038 将 。

19、20 微克 SiNWs 固体加入 100 微升 pH=9 的 PBS 缓冲液中， 然后和 1 毫升 700 微 克每毫升的DOX溶液共同放入到一个1.5毫升离心管中， 于恒温振荡器25摄氏度下反应24 个小时后， 离心机中离心， PBS 缓冲液清洗可得到 SiNW-DOX 复合物溶液备用。 0039 （2） DOX 装载效率 0040 收集离心后的含有自由 DOX 的上清溶液， 利用紫外 - 可见光 - 近红外光谱仪通过 比色法测定 490 纳米处吸光值， 计算得到装载效率为 19000 微克每克。 0041 （3） SiNW-DOX 复合物细胞毒性研究 0042 将含 5 微克每毫升 SiN。

20、W-DOX 复合物的改良型 -1640 培养基， 加入含有 KB 细胞的 说 明 书 CN 102989006 A 5 4/6 页 6 96 孔细胞培养板中孵育 48 小时， 经 MTT 法用酶标仪检测 570 纳米处吸光值。经计算 KB 细 胞存活率下降到约 20%。 0043 实施例 3 0044 （1） SiNW-DOX 复合物制备 0045 将 20 微克 SiNWs 固体加入 100 微升 pH=8 的碳酸盐缓冲液中， 然后和 1 毫升 800 微克每毫升的 DOX 溶液共同放入到一个 1.5 毫升离心管中， 于恒温振荡器 20 摄氏度下反应 30 个小时后， 离心机离心， 碳酸盐缓。

21、冲液清洗可得到 SiNW-DOX 复合物溶液备用。 0046 （2） DOX 装载效率 0047 收集离心后的含有自由 DOX 的上清溶液， 利用紫外 - 可见光 - 近红外光谱仪通过 比色法测定 490 纳米处吸光值， 计算得到装载效率为 14000 微克每克。 0048 （3） SiNW-DOX 复合物细胞毒性研究 0049 将含 10 微克每毫升 SiNW-DOX 复合物的改良型 -1640 培养基， 加入含有 A549 细 胞的 96 孔细胞培养板中孵育 48 小时， 经 MTT 法用酶标仪检测 570 纳米处吸光值。经计算 A549 细胞存活率下降到约 30%。 0050 实施例 4。

22、 0051 （1） SiNW-DOX 复合物制备 0052 将 20 微克 SiNWs 固体加入 100 微升 pH=8 的 PB 缓冲液中， 然后和 1 毫升 900 微克 每毫升的 DOX 溶液共同放入到一个 1.5 毫升离心管中， 于恒温振荡器 37 摄氏度下反应 3 个 小时后， 离心机离心， PB 缓冲液清洗可得到 SiNW-DOX 复合物溶液备用。 0053 （2） DOX 装载效率 0054 收集离心后的含有自由 DOX 的上清溶液， 利用紫外 - 可见光 - 近红外光谱仪通过 比色法测定 490 纳米处吸光值， 计算得到装载效率为 16000 微克每克。 0055 （3） Si。

23、NW-DOX 复合物细胞毒性研究 0056 将含 15 微克每毫升 SiNW-DOX 复合物的改良型 -1640 培养基， 加入含有 MCF-7 细 胞的 96 孔细胞培养板中孵育 24 小时， 经 MTT 法用酶标仪检测 570 纳米处吸光值。经计算 MCF-7 细胞存活率下降到约 30%。 0057 实施例 5 0058 （1） SiNW-DOX 复合物制备 0059 将 20 微克 SiNWs 固体加入 100 微升 pH=8 的 PBS 缓冲液中， 然后和 1 毫升 1000 微 克每毫升 DOX 溶液共同放入到一个 1.5 毫升离心管中， 于恒温振荡器 30 摄氏度下反应 6 个 小。

24、时后， 离心机离心， PBS 缓冲液清洗可得到 SiNW-DOX 复合物溶液备用。 0060 （2） DOX 装载效率 0061 收集离心后的含有自由 DOX 的上清溶液， 利用紫外 - 可见光 - 近红外光谱仪通过 比色法测定 490 纳米处吸光值， 计算得到装载效率为 14000 微克每克。 0062 （3） SiNW-DOX 复合物细胞毒性研究 0063 将含40微克每毫升SiNW-DOX复合物的改良型-1640培养基， 加入含有MCF-7/Adr 细胞的 96 孔细胞培养板中孵育 48 小时， 经 MTT 法用酶标仪检测 570 纳米处吸光值。经计 算 MCF-7/Adr 细胞存活率下。

25、降到约 45%。 0064 实施例 6 说 明 书 CN 102989006 A 6 5/6 页 7 0065 （1） SiNW-DOX 复合物制备 0066 将 20 微克 SiNWs 固体加入 100 微升 pH=7 的 PB 缓冲液中， 然后和 1 毫升 1000 微 克每毫升 DOX 溶液共同放入到一个 1.5 毫升离心管中， 于恒温振荡器 20 摄氏度下反应 30 个小时后， 离心机离心， PB 缓冲液清洗可得到 SiNW-DOX 复合物溶液备用。 0067 （2） DOX 装载效率 0068 收集离心后的含有自由 DOX 的上清溶液， 利用紫外 - 可见光 - 近红外光谱仪通过 比。

26、色法测定 490 纳米处吸光值， 计算得到装载效率为 10000 微克每克。 0069 （3） SiNW-DOX 复合物细胞毒性研究 0070 将含 20 微克每毫升 SiNW-DOX 复合物的低糖 DMEM 培养基， 加入含有 U87MG 细胞的 96 孔细胞培养板中孵育 48 小时， 经 MTT 法用酶标仪检测 570 纳米处吸光值。经计算 U87MG 细胞存活率下降到约 15%。 0071 实施例 7SiNW-DOX 复合物对体外癌症细胞的杀伤研究 0072 将含 20 微克每毫升 SiNW-DOX 复合物的高糖 DMEM 培养基， 加入含有 HeLa 细胞的 96 孔细胞培养板中孵育 。

27、24 小时， 经 MTT 法用酶标仪检测 570 纳米处吸光值。经计算 HeLa 细胞存活率下降到约 40%。 0073 将 HeLa 细胞和 KB 细胞以每孔 0.83 万个的相同密度培养在 96 孔细胞培养板中， 在 37 摄氏度 5vol% 二氧化碳条件下培养过夜。将不同浓度 （1.25 微克每毫升、 2.5 微克每 毫升、 5 微克每毫升、 10 微克每毫升和 20 微克每毫升） 盐酸阿霉素 （DOX） 、 硅纳米线 （SiNW） 和硅纳米线 - 盐酸阿霉素 （SiNW-DOX） 复合物加入细胞培养板中孵育 24 小时和 48 小时。然 后， 向每孔中加入 20 微升 5 毫克每毫升贮。

28、存在 -20 摄氏度中的 MTT 溶液， 在 37 摄氏度条件 下孵育 4 小时， 向每孔中加入 100 微升经过盐酸酸化的十二烷基磺酸钠 （SDS） 溶液将细胞 裂解， 用酶标仪检测 570 纳米处吸光值。 0074 结果如图 1 所示， 图 1a 与图 1b 为 HeLa 细胞与不同浓度硅纳米线、 盐酸阿霉素和 硅纳米线 - 盐酸阿霉素复合物分别孵育 24 小时和 48 小时， 在细胞层面杀伤 HeLa 细胞的结 果 ； 图 1c 与图 1d 为 KB 细胞与不同浓度硅纳米线、 盐酸阿霉素和硅纳米线 - 盐酸阿霉素复 合物分别孵育 24 小时和 48 小时， 在细胞层面杀伤 KB 细胞的结。

29、果。由图 1 明显的看出， 硅 纳米线对癌细胞并无杀伤作用， 盐酸阿霉素和硅纳米线 - 盐酸阿霉素复合物保持基本一致 的癌细胞杀灭趋势， 只是在低浓度时略有差异， 低浓度时盐酸阿霉素略好， 渐渐的随着浓度 的增加硅纳米线 - 盐酸阿霉素复合物杀灭效果和盐酸阿霉素基本相同。 0075 实施例 8SiNW-DOX 复合物对体内癌症细胞的杀伤研究 0076 在 45 周 龄 雌 性 Balb/c 裸 鼠 右 侧 背 部 皮 下 注 射 0.10.2 毫 升 密 度 为 51062107的癌细胞悬液。当肿瘤大小达到 50250 立方毫米时， 为减少体重和肿瘤 大小引起的误差将裸鼠随机分为四组， 分别在。

30、瘤内注射相同体积的生理盐水、 盐酸阿霉素 （DOX） 、 硅纳米线 （SiNW） 和硅纳米线 - 盐酸阿霉素 （SiNW-DOX） 复合物。用游标卡尺每两天 对每组裸鼠肿瘤长和宽进行测量， 用以下公式计算肿瘤体积 ： ab2/2， a代表肿瘤长度， b代表 肿瘤宽度 ； 用以下公式计算肿瘤相对体积 ： v/v0， v 代表测量时肿瘤体积， v0代表原始肿瘤体 积。 0077 结果如图 2 所示， 可以清晰的看出， 硅纳米线 - 盐酸阿霉素复合物在较长时间内 （30日） 均能稳定的抑制肿瘤的生长， 而盐酸阿霉素只在最初的一段时间 （10天左右） 能稳定 说 明 书 CN 102989006 A 。

31、7 6/6 页 8 的抑制肿瘤的生长， 之后的抑制效果越来越差， 可见活体组织中能够快速的清除 DOX， 只有 少量的 DOX 能够累积的发挥作用， 而 SiNW-DOX 复合物却能够不断缓释 DOX 到活体组织中， 使得活体组织中的 DOX 量维持稳定， 极大的延长了 DOX 的药效。 0078 对于本领域技术人员而言， 显然本发明不限于上述示范性实施例的细节， 而且在 不背离本发明的精神或基本特征的情况下， 能够以其他的具体形式实现本发明。 因此， 无论 从哪一点来看， 均应将实施例看作是示范性的， 而且是非限制性的， 本发明的范围由所附权 利要求而不是上述说明限定， 因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有 变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。 0079 此外， 应当理解， 虽然本说明书按照实施方式加以描述， 但并非每个实施方式仅包 含一个独立的技术方案， 说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见， 本领域技术人员应当 将说明书作为一个整体， 各实施例中的技术方案也可以经适当组合， 形成本领域技术人员 可以理解的其他实施方式。 说 明 书 CN 102989006 A 8 1/1 页 9 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102989006 A 9 。