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1、(10)申请公布号 CN 102847175 A (43)申请公布日 2013.01.02 CN 102847175 A *CN102847175A* (21)申请号 201110182831.1 (22)申请日 2011.06.30 A61L 2/18(2006.01) A61K 31/165(2006.01) A61P 31/04(2006.01) A61L 101/32(2006.01) (71)申请人 复旦大学 地址 200433 上海市杨浦区邯郸路 220 号 申请人 中国科学院上海药物研究所 (72)发明人 瞿涤 蒋华良 沈旭 蔡霞 陈明亮 (74)专利代理机构 上海元一成知识产权。
2、代理事 务所 ( 普通合伙 ) 31268 代理人 吴桂琴 (54) 发明名称 一种抑制细菌信号转导系统 PhoQ 组氨酸激 酶活性的制剂 (57) 摘要 本发明属生物技术领域， 涉及一种抑制细菌 信号转导系统 PhoQ 组氨酸激酶活性的制剂， 具体 涉及一种含有小分子化合物的细菌 PhoQ 组氨酸 激酶抑制剂， 尤其是对革兰阴性菌的信号转导系 统PhoQ蛋白的抑制剂。 所述的制剂由式(I) 结构 的小分子化合物和DMSO组成。 本发明的抑制细菌 信号转导系统 PhoQ 组氨酸激酶活性的制剂， 对志 贺菌信号转导系统中 PhoQ 蛋白具有抑制作用， 抑 制志贺菌的毒力， 可用于制备抑制志贺菌毒。
3、力的 药物， 或可用于制备治疗由革兰阴性菌引起的疾 病的药物， 还可配制成医疗器械或医疗器具消毒 液。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 一种抑制细菌信号转导系统 PhoQ 组氨酸激酶活性的制剂， 其特征在于， 由式 (I) 结 构的小分子化合物和 0.1-2二甲基亚砜组成 ； 2.按权利要求1所述的抑制细菌信号转导系统PhoQ组氨酸激酶活性的制剂， 其特征在 于， 所述的细菌为革兰阴性菌。 3.按权利要求1或2所述的抑制细。
4、菌信号转导系统PhoQ组氨酸激酶活性的制剂， 其特 征在于， 所述的细菌为志贺菌、 沙门菌或大肠杆菌。 4.按权利要求1所述的抑制细菌信号转导系统PhoQ组氨酸激酶活性的制剂， 其特征在 于， 所述的制剂为消毒液。 5. 权利要求 1 的抑制细菌信号转导系统 PhoQ 组氨酸激酶活性的制剂在制备抑制志贺 菌毒力药物中的用途。 6. 权利要求 1 的抑制细菌信号转导系统 PhoQ 组氨酸激酶活性的制剂在制备治疗由革 兰阴性菌引起的疾病的药物中的用途。 权 利 要 求 书 CN 102847175 A 2 1/6 页 3 一种抑制细菌信号转导系统 PhoQ 组氨酸激酶活性的制剂 技术领域 0001。
5、 本发明属生物技术领域， 涉及一种抑制细菌信号转导系统 PhoQ 组氨酸激酶活性 的制剂， 具体涉及一种含有小分子化合物的细菌 PhoQ 组氨酸激酶抑制剂， 尤其是对革兰阴 性菌的信号转导系统 PhoQ 蛋白的抑制剂 ； 所述的制剂对志贺菌信号转导系统中 PhoQ 蛋白 具有抑制作用， 能抑制革兰阴性菌生长， 并抑制志贺菌的毒力。 背景技术 0002 现有技术公开了志贺菌 (Shigella) 为革兰阴性菌， 是细菌性痢疾的病原体， 主要 通过粪 - 口途径传播， 侵入结肠粘膜。有统计表明， 在我国， 细菌性痢疾是发病率仅次于病 毒性肝炎和肺结核的第三大传染病， 血清型以福氏 2a 型为主。近。
6、年来， 由于抗生素的不规 范使用以及耐药基因的水平传播， 志贺菌在临床上呈现多重耐药， 对青霉素类、 磺胺类、 四 环素类抗生素耐药率极高， 甚至对喹诺酮类、 头孢菌素类等目前临床常用药物的耐药率也 不断上升， 因此需要研究新的治疗策略加以应对。 0003 当前， 抑制细菌毒力而不影响细菌的生长可能成为研究抑制剂的新策略 ； 相比现 有的以抑制或杀灭细菌为目的抗生素， 抑制细菌毒力而不影响细菌生长可能使细菌处于低 选择压力下而减少细菌变异的机会并降低细菌产生耐药性的机率 ； 同时， 宿主与无毒或减 毒的细菌相互作用， 能够产生足够的免疫力对抗病原菌并彻底根除入侵的病原菌。 因此， 以 细菌毒力。
7、因子为靶标已经成为发展新型抗菌药物的新策略。 发明内容 0004 本发明的目的是提供一种抑制细菌信号转导系统 PhoQ 组氨酸激酶活性的制剂， 尤其是对革兰阴性菌的信号转导系统 PhoQ 蛋白的抑制。 0005 本发明对志贺菌双组分信号转导系统中的 PhoQ 蛋白 (PhoQ 组氨酸蛋白激酶 ) 进 行蛋白质结构三维模拟， 并根据此模型， 利用对接软件进行虚拟， 获得能抑制志贺菌等革兰 阴性细菌毒力的小分子化合物 ； 然后， 将所述的小分子化合物与二甲基亚砜 (DMSO) 混合， 制成抑制细菌信号转导系统 PhoQ 组氨酸激酶活性的制剂。 0006 具体而言， 本发明所述的抑制细菌信号转导系统。
8、 PhoQ 组氨酸激酶活性的制剂， 其 特征在于， 由式 (I) 结构的小分子化合物 (FDDDC1) 和 0.1-2二甲基亚砜 (DMSO) 组成 ； 0007 说 明 书 CN 102847175 A 3 2/6 页 4 0008 本发明中， 所述的细菌为革兰阴性菌， 包括志贺菌、 沙门菌或大肠杆菌。 0009 本发明中， 所述的小分子化合物 FDDDC1 具有抑制细菌毒力的功能， 能有效抑制临 床常见的革兰阴性菌， 如志贺菌、 沙门菌或大肠杆菌的毒力， 且对哺乳动物细胞无明显毒 性 ； 0010 本发明中， 所述小分子化合物 FDDDC1 可通过市购 ( 荷兰 SPECS 公司 ) 获得。
9、。 0011 本发明中， 所述二甲基亚砜 (DMSO) 其分子式为 (CH3)2SO， 常温下为无色无臭的透 明液体， 具有高极性、 高沸点、 热稳定性好、 非质子、 与水混溶的特性， 能溶于乙醇、 丙醇、 苯 和氯仿等大多数有机物， 可通过市购途径获得。 0012 本发明通过蛋白结构分子模建和虚拟高通量筛选技术从已知结构的化合物库中 筛选出针对志贺菌组氨酸蛋白激酶 PhoQ 蛋白潜在的小分子抑制物 (FDDDC1 化合物 )， 经体 外及体内生物学实验证实， 该小分子化合物 FDDDC1 能有效抑制志贺菌及几种临床常见的 革兰氏阴性菌的毒力， 且对哺乳动物细胞没有毒性。 0013 本发明中，。
10、 所述的小分子化合物 FDDDC1 具有如下优点 ： 0014 (1) 所述的小分子化合物在体外及体内能明显抑制志贺菌的毒力 ； 0015 (2) 所述的小分子化合物不影响细菌的生长 ； 0016 (3) 所述的小分子化合物对哺乳动物细胞无毒性， 且对人红细胞无明显的溶血作 用 ； 0017 (4) 所述的小分子化合物与目的蛋白志贺菌组氨酸激酶 PhoQ 保守功能域片段有 很强的结合力， 且均能明显抑制蛋白组氨酸激酶 PhoQ 的自身磷酸化活性。 0018 本发明中， 所述的小分子化合物 FDDDC1 与 0.1-2二甲基亚砜 (DMSO) 制成细菌 PhoQ 组氨酸激酶抑制剂， 对志贺菌信号。
11、转导系统中 PhoQ 蛋白具有抑制作用， 能抑制革兰阴 性菌生长， 并抑制志贺菌的毒力。 0019 本发明中， 所述的小分子化合物 FDDDC1 可用于配制成医疗器械或医疗器具消毒 液， 还可进一步进行化学结构的改造， 制备抗革兰阴性球菌感染的新药物。 0020 本发明的细菌 PhoQ 组氨酸激酶抑制剂， 对志贺菌信号转导系统中 PhoQ 蛋白具有 抑制作用， 抑制志贺菌的毒力， 可配制成医疗器械或医疗器具消毒液 ； 所述的抑制剂还可用 于制备抑制志贺菌毒力的药物， 或可用于制备治疗由革兰阴性菌引起的疾病的药物。 附图说明 说 明 书 CN 102847175 A 4 3/6 页 5 0021。
12、 图 1 显示了本发明中化合物 FDDDC1 对志贺菌侵袭 HeLa 细胞的影响， 其中， Sf9380 为阳性对照， ATCC 25922 为阴性对照， DMSO 为化合物溶剂对照。 具体实施方式 0022 下面结合实验例对本发明进一步详细描述但不限制本发明。 0023 本发明试验所涉及的大肠杆菌JM109和pQE30载体均为本领域技术人员所熟知的 现有公开技术， 或可通过市购渠道获得。 0024 实施例 1 构建志贺菌组氨酸激酶 PhoQ 原核表达质粒 0025 通过如下方法获取志贺菌组氨酸激酶 PhoQ 基因 (NC_004337) ： 0026 在正义链引物 5 端设计 BamH I 。
13、酶切位点， 反义链引物 5 端设计 HindIII 酶切 位点 ： sense ： 5 -CGCGGATCCGTACGAAACCTGAACCGATT-3 ， 下划线部分为 BamH I 酶切位点 ； antisense ： 5 -CCCAAGCTTTTATTCATCTTTCGGCGCAG-3 ， 下划线部分为 HindIII 酶切位点。 0027 用上述引物经 PCR 扩增出志贺菌组氨酸激酶 PhoQ 的编码基因。通过限制性内切 酶 (BamH I 和 HindIII) 的酶切反应和 T4DNA 连接酶的连接反应， 将上述基因连入 pQE30 载 体， 转化 JM109 细菌， 挑选阳性菌落，。
14、 测序证实克隆构建成功。 0028 实施例 2 志贺菌组氨酸激酶 PhoQ 蛋白的表达和纯化 0029 宿主菌 ： 大肠杆菌 JM109 0030 1. 挑单克隆菌落接种至 5ml LB 培养基中， 37 250rpm 至 OD600 0.6。 0031 2. 加 1M IPTG 至终浓度 0.8mmol/L， 在 30下诱导 6h 后。 0032 3. 离心取菌体， 用 PBS 重悬后超声破碎， 于 4以 12000 转 / 分离心 5 分钟， 取上 清液。 0033 用Invitrogen公司ProBondTM Purification System提纯蛋白。 以12SDS-PAGE 蛋白。
15、电泳分析确定目的蛋白的分布。用 Bradford 法对蛋白质进行定量。 0034 实施例 3 化合物 FDDDC1 对志贺菌组氨酸激酶 PhoQ 酶活性的影响 ： 0035 采用下述两种方法进行检测， 0036 1.检测底物ATP的减少量Kinase-GloTM Luminescent Kinase Assay Kit(美 国 Promega 公司 ) ： 0037 将重组表达、 纯化的 2g 志贺菌组氨酸激酶 PhoQ 分别与梯度稀释的化合物在 25作用 20 分钟， 然后加入 100M ATP( 反应总体积 50L)， 在 25作用 20 分钟后， 将反 应混合物加入 96 孔酶标板， 每。
16、孔 50L， 加入 Kinase-GloTMReagent 每孔 50L 室温静置 10 分钟， 读取化学发光值表示反应剩余的 ATP 的量， 实验设不加化合物组为对照组。最后计算 化合物对目的蛋白活性的抑制率 ： 0038 0039 2. 检测产物焦磷酸的生成量Pyrophosphate Reagent( 美国 Sigma-A1drich 公司 ) ： 0040 将重组表达、 纯化的 2g 志贺菌组氨酸激酶 PhoQ 分别与梯度稀释的小分子化 合物混合， 加入 96 孔酶标板， 然后加入 100L Pyrophosphate Reagent， 用水补足总体积 说 明 书 CN 1028471。
17、75 A 5 4/6 页 6 200L， 在 37作用 30 分钟， 连续读取 OD340， 实验设不加化合物组为对照组。最后计算化 合物对目的蛋白活性的抑制率。 0041 采用 Logit 法对上述两种方法检测的抑制率分别计算半数抑制浓度 IC50。结果表 明 ： 化合物能较强地抑制志贺菌组氨酸激酶 PhoQ 的活性， 表 1 为 IC50结果。 0042 表 1 0043 0044 注 ： IC50值即半数抑制浓度， 代表化合物抑制反应体系中组氨酸激酶 PhoQ 酶半数 催化活性时的浓度。 0045 实施例 4 表面等离子共振 (SPR) 技术检测化合物 FDDDC1 与志贺菌组氨酸激酶 。
18、PhoQ 的亲合力 0046 将重组表达、 纯化的志贺菌组氨酸激酶 PhoQ 酶偶联在能量共振生物传感芯片 (Biacore CM5型芯片)上， 将化合物按两倍梯度稀释， 通过Biacore仪器观察化合物与蛋白 结合的情况， 计算出解离衡常数 KD。 0047 结果显示化合物 FDDDC1 与志贺菌组氨酸激酶 PhoQ 有较强的结合能力。表 2 为化 合物 FDDDC1 与志贺菌组氨酸激酶 PhoQ 的亲合力。 0048 表 2 0049 0050 注 ： KD值为解离常数， 代表化合物 FDDDC1 与志贺菌组氨酸激酶 PhoQ 的结合力， 其 值越小表示结合力越强。 0051 实施例 5 。
19、化合物 FDDDC1 对细菌生长的抑制实验 0052 本实施例使用美国Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI)推荐 的标准试管稀释法 ： 0053 1. 将细菌接种于新鲜的 MH 液体培养基， 37培养过夜。 0054 2. 将菌液用新鲜的 MH 液体培养基将菌液浓度校正至 0.5 麦氏比浊标准， 再用 MH 液体培养基按 1 200 稀释， 向每只试管中加入 1mL， 加入 1mL 不同浓度梯度的化合物 ( 溶 剂 DMSO 终浓度保持 0.1 )， 37培养 18 小时。因化合物 FDDDC1 溶解于 DMSO 中， 以 0.1 D。
20、MSO+ 细菌作为对照， 以无菌培养基为空白对照。 0055 3. 取出与空白对照比较， 细菌不生长的浓度最低的一管即为化合物 FDDDC1 的最 小抑菌浓度。 0056 结果显示化合物 FDDDC1 对志贺菌生长没有明显的抑制作用。 0057 实施例 6MTT 法检测化合物 FDDDC1 的细胞毒性 0058 1. 将新鲜培养的 Vero 细胞接种于 96 孔板， 每孔 100L 细胞 ( 约 5104细胞 )， 37， 5 CO2条件下培养 24 小时， 使细胞长成单层。 0059 2.弃去培养基， 加入100L/每孔新鲜的MEM培养基， 其中含有不同浓度的化合物 说 明 书 CN 102。
21、847175 A 6 5/6 页 7 FDDDC1( 溶剂 DMSO 终浓度保持 0.1 )， 每个样品采用 6 复孔上样， 37， 5 CO2条件下继 续培养 24 小时。因化合物溶解于 DMSO 中， 因此设 0.1 DMSO+ 细胞为对照。 0060 3. 每孔加入 10L MTT 标记物， 37、 5 CO2条件下培养 4 小时。 0061 4. 每孔加入 100L 溶解液， 37、 5 CO2条件下培养过夜。 0062 5.将96孔板取出读取OD570值， 每个样品读数取6复孔的均值， 计算不同浓度的化 合物对 Vero 细胞生长的抑制率 ： 0063 0064 半数抑制量 CC50。
22、值采用 Logit 法计算。 0065 结果表明， 未观察到对 Vero 细胞具有毒性。 0066 表 3 是化合物 FDDDC1 对 Vero 细胞的毒性作用。 0067 表 3 0068 0069 实施例 6 红细胞溶血实验 ： 0070 1. 将分离的健康人红细胞用无菌生理盐水洗 3 遍， 并稀释至 5。 0071 2.加入不同浓度的小分子化合物FDDDC1(溶剂DMSO终浓度保持0.1)于5红 细胞悬液中， 每孔 200l 接种于 96 孔板上， 每个样品采用三复孔。因所述小分子化合物溶 解于 DMSO 中， 因此设 0.1 DMSO+ 细胞为阴性对照， 设 1细胞穿透液 Triton。
23、-100+ 细胞为 阳性对照， 并设两种常用抗生素四环素和环丙沙星作对照。37培养箱培养 1 小时， 离心后 取 100l 上清移入另一块干净的 96 孔板， OD570读数， 每个样品读数取三复孔的均值。 0072 结果表明 ： 该小分子化合物对人红细胞均没有溶血作用。 0073 表 4 是化合物 FDDDC1 对血红细胞的毒性作用。 0074 表 4 0075 0076 实施例 7HeLa 细胞侵袭实验 0077 1.HeLa 细胞于 12 孔板中长至半融合性单层后， 以对数生长期的志贺菌进行感染 (M.O.I. 100)， 900g5min 在 37离心， 然后于 37培养 60min。。
24、 0078 2.PBS洗板三次后， 加入庆大霉素使其终浓度为200g/ml， 再于37培养30min。 0079 3.每孔加入1ml含0.1Triton X-100的PBS， 室温下10min后， 将裂解液进行适 当稀释后涂布于 LB 琼脂平板上， 37培养过夜后进行菌落计数， 计算出侵袭入细胞的细菌 总数 ； 0080 每个实验为三复孔， 结果以存活细菌所占的百分比来表示。 说 明 书 CN 102847175 A 7 6/6 页 8 0081 结果如图1显示 ： 志贺菌与化合物FDDDC1作用后， 对HeLa细胞的侵袭率有显著下 降 (p 0.01) ； 所述的 FDDDC1 的最小有效浓。
25、度为 12.5mol/L。 0082 实施例 8 志贺菌感染小鼠角结膜 0083 将志贺菌接种于 TSB- 刚果红平板， 挑取红色 ( 有毒力者 ) 单克隆接种于 LB 肉汤 中。 将Sf9380与一系列倍比稀释的化合物终浓度(mol/L)为100、 50、 25、 12.5在37 振荡培养 8h 后， 将细菌浓度调整至 51010/mL， 选 25g 左右健康 BALB/c 小鼠， 吸取上述浓 度的细菌悬液滴入小鼠眼睛， 细菌数约为 5108/ 眼， 轻轻按摩小鼠眼周围， 使菌液均匀分 布。每份样品接种于 6 只独立的小鼠眼睛， 24h 后观察小鼠角结膜发病情况。以接种经等 量 DMSO 处。
26、理的 Sf9380 者为空白对照组， 接种未经化合物处理的 Sf9380 者为阳性对照组， 接种大肠埃希菌 ATCC 25922 者为阴性对照组。 0084 结果表明 ： 化合物 FDDDC1 能够明显抑制志贺菌所引起的小鼠角结膜炎症反应， 降 低 24h 和 48h 时的急性角结膜炎症程度， 并加快炎症恢复速度， 72h 后炎症明显减弱 ； 化合 物FDDDC1的最小有效浓度为12.5mol/L。 对照组中， 接种经等量DMSO处理的志贺菌菌液 的小鼠表现为严重的角结膜炎症反应， 炎症发展过程与 Sf9380 相似 (P 0.05) ； 接种大肠 杆菌 ATCC 25922 或 NS 的小鼠。
27、则无角结膜炎症反应。 0085 表 5 为化合物 FDDDC1 对小鼠角结膜炎的影响 0086 0087 注 ： 志贺菌侵袭力强弱的评判标准 ： - ： 无角膜结膜炎或轻微刺激 ； + ： 轻微结膜炎 或者延迟发病或者症状快速消退 ； + ： 角结膜炎， 无脓性分泌物 ； + ： 严重角结膜炎， 有脓 性分泌物。阳性对照组及空白对照组显示其毒力为 +， 阴性对照组则为 -。 0088 注 ： Sf9380 为阳性对照， ATCC 25922 为阴性对照， DMSO 为化合物溶剂对照。 说 明 书 CN 102847175 A 8 1/1 页 9 图 1 说 明 书 附 图 CN 102847175 A 9 。