预防山羊葡萄球菌乳房炎的基因工程疫苗制备方法及应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102847172 A (43)申请公布日 2013.01.02 CN 102847172 A *CN102847172A* (21)申请号 201210394438.3 (22)申请日 2012.10.17 A61K 48/00(2006.01) A61K 39/085(2006.01) A61P 31/04(2006.01) (71)申请人西北农林科技大学地址 712100 陕西省西安市杨凌示范区西农路西北农林科技大学动医学院 (72)发明人陈德坤许君艳姚运亮田婷婷李前瑞罗军曹斌云 (74)专利代理机构西安新思维专利商标事务所有限公司 61。

2、114 代理人韩翎 (54) 发明名称预防山羊葡萄球菌乳房炎的基因工程疫苗制备方法及应用 (57) 摘要本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及一种预防山羊葡萄球菌乳房炎的基因工程疫苗制备方法及应用。本发明通过以下步骤完成： 1）扩增目的基因 ClfA、 ClfA 及 Sbi ； 2）构建 pCI-Hla/ClfA-A/Sbi-I-II 真核重组表达载体； 3）建立免疫程序及评估免疫效果。本发明基因工程疫苗是以迅速发展的分子生物学技术、遗传性、免疫学为基础，包括基因工程亚单位疫苗、基因突变疫苗、核酸疫苗等。核酸疫苗即 DNA 疫苗，是重组构建一种或多。

3、种抗原编码基因的真核表达载体，并将其直接注入机体而激活免疫系统，以达到预防和治疗疾病的目的。 (51)Int.Cl. 权利要求书 3 页说明书 5 页序列表 2 页附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书 3 页说明书 5 页序列表 2 页附图 1 页 1/3 页 2 1. 一种预防山羊葡萄球菌乳房炎的基因工程疫苗制备方法，其特征在于：包括以下步骤： 1）扩增目的基因 ClfA、 ClfA 及 Sbi ； 2）构建 pCI- Hla/ClfA-A/ Sbi-I-II 真核重组表达载体； 3）建立免疫程序及评估免疫。

4、效果。 2. 根据权利要求 1 所述的预防山羊葡萄球菌乳房炎的基因工程疫苗制备方法，其特征在于：所述的将 ClfA、 ClfA 及 Sbi 三种蛋白的基因功能性区域串联，制成多价核酸疫苗，免疫宿主，使其在宿主细胞内表达，宿主产生特异性抗体以达到预防金黄色葡萄球菌感染的目的。 3. 根据权利要求 1 所述的预防山羊葡萄球菌乳房炎的基因工程疫苗制备方法，其特征在于：所述的基因工程疫苗制备方法的具体步骤为： 1）设计引物； 2）制备模板； 3） PCR 扩增与回收目的基因； 4）构建真核表达载体 pCI- Hla/ClfA-A/ Sbi-I-II ； 5）。

5、建立免疫程序及评估免疫效果。 4. 根据权利要求 3 预防山羊葡萄球菌乳房炎的基因工程疫苗制备方法，其特征在于： 1）设计引物根据 Genebank 上已经提交的ClfA、Hla及Sbi基因序列分别设计引物 H1/H2、 CA1/CA2 和 S1/S2，并加入相应的酶切位点： H1: GCGCTAGCATGAAAACACGTATAG NheI H2: GCCTCGAGTTAATTTGTCATTTCTTCT XhoI CA1: GCCTCGAGGTAGCTGCAGATG XhoI CA2:GCGAATTCCTCATCAGGTTGTTCAGGA EcoRI S1:GCGAATTCA。

6、CAAACAACTCAAAACAACTAC EcoRI S2: GCTCTAGAATTTTGACGTTCTTTAGCTT XbaI 2）制备模板提取 DNA 模板所用的金黄色葡萄球菌分离自患临床乳房炎的奶山羊乳样，均匀涂抹乳样于血琼脂平板， 37温箱中过夜培养，挑取溶血性菌于显微镜下观察细菌形态，确定为金黄色葡萄球菌后再挑取菌落于5 mL LB液体培养基中， 37摇床中培养过夜，取1 mL菌液，用细菌基因组 DNA 快速抽提试剂盒提取金黄色葡萄球菌基因组 DNA， -20保存备用； 3） PCR 扩增与回收目的基因（1）扩增目的基因Hla 反应体系（50 L）：超。

7、纯水 32 L， 10 Taq Buffer 5 L， dNTP Mixture 4 L， MgCl2 4 L， H1/H2 各 1 L，模板 2 L， Taq 酶 1 L，加样后充分混匀； PCR程序：预变性94 5 min ；进入循环：变性94 30 s，退火51.6 30 s，延伸72 1.5 min，共 30 个循环；最终延伸 72 10 min ；（2）扩增目的基因ClfA的 A 区反应体系（50L）：超纯水 32 L， 10 Taq Buffer 5 L， dNTP Mixture 4 L， MgCl2 4 L， CA1/CA2 各 1 L，。

8、模板 2 L， Taq 酶 1 L，加样后充分混匀；权利要求书 CN 102847172 A 2 2/3 页 3 PCR 程序：预变性 94 5 min ；进入循环：变性 94 30 s，退火 52 30 s，延伸 72 1.5 min，共 30 个循环；最终延伸 72 10 min ；（3）扩增目的基因Sbi的 I 区和 II 区反应体系（50L）：超纯水 32 L， 10Taq Buffer 5L， dNTP Mixture 4L， MgCl2 4L， S1/S2 各 1L，模板 2L， Taq 酶 1L，加样后充分混匀； PCR 程序。

9、：预变性 94 5min ；进入循环：变性 94 30s，退火 51 30s，延伸 72 1min，共 30 个循环；最终延伸 72 10min ；（4）回收 PCR 扩增产物胶回收试剂盒回收 PCR 扩增产物用， -20保存备用； 4）构建真核表达载体 pCI- Hla/ClfA-A/ Sbi-I-II （1） pCI-Hla 重组载体的构建用限制性内切酶 Nhe I 和 Xho I 分别对 pCI、Hla在 37 温箱中酶切反应 1 h，酶切产物经核酸电泳鉴定纯化后回收，然后将二者混合于 16 过夜连接，将连接产物转化入感受态细胞，在 Amp+平板。

10、上 37培养 12 h 后挑取阳性质粒做菌液 PCR 鉴定、双酶切鉴定和测序鉴定；（2） pCI- Hla/ClfA-A 重组载体的构建用限制性内切酶Xho I和EcoR I分别对pCI-Hla、ClfA-A进行双酶切，方法同pCI-Hla 重组载体的构建方法；（3） pCI-Hla/ClfA-A/Sbi-I-II 重组载体的构建用限制性内切酶 EcoR I 和 Xba I 分别对 pCI- Hla/ClfA-A、Sbi-I-II进行双酶切，方法同 pCI-Hla 重组载体的构建方法； 5）建立免疫程序及评估免疫效果选12只1416 g的小鼠分两组，每组6只，分。

11、别用pCI质粒和重组的pCI-Hla/ClfA-A/ Sbi-I-II 质粒以肌肉途径注射免疫，每三周免疫一次，最后一次免疫后第 3 周采集小鼠血清； IgG水平测定：用原核表达的ClfA的A区蛋白包被96孔板， 37 孵育2 h,加入小鼠血清， 37 共孵育2 h，最后加入辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG的二抗37 孵育1 h，酶标仪读取OD450的值，结果表明pCI质粒免疫组的OD450几乎为零， pCI-Hla/ClfA-A/Sbi-I-II 质粒免疫组的 OD450平均为 1.6，说明 pCI-Hla/ClfA-A/Sbi-I-II 质粒免疫组小鼠有较高的 Ig。

12、G 水平； IgG1和IgG2a水平测定：方法同IgG水平测定， pCI质粒免疫组的IgG1和IgG2a的OD450 均为零，而 pCI-Hla/ClfA-A/Sbi-I-II 质粒免疫组 IgG1 和 IgG2a 水平均在 0.60.7 之间，且 IgG2a 的量大于 IgG1 的量，说明经 pCI-Hla/ClfA-A/Sbi-I-II 质粒免疫的小鼠能产生较强的细胞免疫应答和体液免疫应答，并且细胞免疫应答强于体液免疫应答；保护效应评估：用 100 L 1 106 /ml 的金黄色葡萄球菌分别感染 pCI 质粒免疫组小鼠、 pCI-Hla/ClfA-A/Sbi-I。

13、-II质粒免疫组小鼠的乳腺， 24 h后取小鼠的乳腺组织，称重、捣碎后，将组织匀浆涂抹在琼脂平板上， 37培养 12 h 后，计菌落数， pCI 质粒免疫组小鼠乳腺载菌量平均为 3107/g， pCI-Hla/ClfA-A/Sbi-I-II 质粒免疫组小鼠乳腺载菌量平均为 1.21010/g，说明 pCI-Hla/ClfA-A/Sbi-I-II 质粒免疫能对小鼠产生较强的免疫保护作权利要求书 CN 102847172 A 3 3/3 页 4 用。 5. 根据权利要求 1 所述的基因工程疫苗在预防山羊葡萄球菌乳房炎中的应用。权利要求书 CN 102847172 。

14、A 4 1/5 页 5 预防山羊葡萄球菌乳房炎的基因工程疫苗制备方法及应用 0001 一、技术领域：本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及一种预防山羊葡萄球菌乳房炎的基因工程疫苗制备方法及应用。 0002 二、背景技术：乳房炎是令产奶动物养殖者比较头疼的动物疫病之一，引起母畜产奶量和相应的奶制品质量下降，造成重大的经济损失。金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、链球菌是造成乳房感染，引起临床、亚临床乳房炎的主要致病菌。因金黄色葡萄球菌抵抗多种抗生素的抑制作用，非抗生素途径控制金黄色葡萄球菌感染引起乳房炎已显得十分重要。 0003 传统乳房炎疫苗为上述致病菌的弱毒活。

15、疫苗或灭活疫苗，在生产实践中，对乳房炎的防治有一定作用。然而随着大规模集约化养殖的发展，人工致弱菌株存在着同源重组、自身毒力返强等潜在可能，而灭活疫苗也存在使用剂量大、免疫期短等不足，为提高传统疫苗的安全性与免疫保护力，具有高效、廉价的新型疫苗研制极其重要。 0004 三、发明内容：本发明的目的在于提供一种预防山羊葡萄球菌乳房炎的基因工程疫苗制备方法及应用，其更加安全稳定、制备简单、应用方便、价格低廉。 0005 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种预防山羊葡萄球菌乳房炎的基因工程疫苗制备方法，其特征在于：包括以下步骤： 1）扩。

16、增目的基因 ClfA、 ClfA 及 Sbi ； 2）构建 pCI- Hla/ClfA-A/ Sbi-I-II 真核重组表达载体； 3）建立免疫程序及评估免疫效果。 0006 所述的将ClfA、 ClfA及Sbi三种蛋白的基因功能性区域串联，制成多价核酸疫苗，免疫宿主，使其在宿主细胞内表达，宿主产生特异性抗体以达到预防金黄色葡萄球菌感染的目的。 0007 所述的基因工程疫苗制备方法的具体步骤为： 1）设计引物； 2）制备模板； 3） PCR 扩增与回收目的基因； 4）构建真核表达载体 pCI- Hla/ClfA-A/ Sbi-I-II ； 5）建立免疫程序及。

17、评估免疫效果。 0008 预防山羊葡萄球菌乳房炎的基因工程疫苗制备方法，其特征在于： 1）设计引物根据 Genebank 上已经提交的ClfA、Hla及Sbi基因序列分别设计引物 H1/H2、 CA1/CA2 和 S1/S2，并加入相应的酶切位点： H1: GCGCTAGCATGAAAACACGTATAG NheI H2: GCCTCGAGTTAATTTGTCATTTCTTCT XhoI CA1: GCCTCGAGGTAGCTGCAGATG XhoI CA2: GCGAATTCCTCATCAGGTTGTTCAGGA EcoRI S1: GCGAATTCACAAACAACTCAAAA。

18、CAACTAC EcoRI S2: GCTCTAGAATTTTGACGTTCTTTAGCTT XbaI 说明书 CN 102847172 A 5 2/5 页 6 2）制备模板提取 DNA 模板所用的金黄色葡萄球菌分离自患临床乳房炎的奶山羊乳样，均匀涂抹乳样于血琼脂平板， 37温箱中过夜培养，挑取溶血性菌于显微镜下观察细菌形态，确定为金黄色葡萄球菌后再挑取菌落于5 mL LB液体培养基中， 37摇床中培养过夜，取1 mL菌液，用细菌基因组 DNA 快速抽提试剂盒提取金黄色葡萄球菌基因组 DNA， -20保存备用； 3） PCR 扩增与回收目的基因（1）扩增目的基因Hl。

19、a 反应体系（50 L）：超纯水 32 L， 10 Taq Buffer 5 L， dNTP Mixture 4 L， MgCl2 4 L， H1/H2 各 1 L，模板 2 L， Taq 酶 1 L，加样后充分混匀； PCR程序：预变性94 5 min ；进入循环：变性94 30 s，退火51.6 30 s，延伸72 1.5 min，共 30 个循环；最终延伸 72 10 min ；（2）扩增目的基因ClfA的 A 区反应体系（50L）：超纯水 32 L， 10 Taq Buffer 5 L， dNTP Mixture 4 L， MgCl2 4 L。

20、， CA1/CA2 各 1 L，模板 2 L， Taq 酶 1 L，加样后充分混匀； PCR 程序：预变性 94 5 min ；进入循环：变性 94 30 s，退火 52 30 s，延伸 72 1.5 min，共 30 个循环；最终延伸 72 10 min ；（3）扩增目的基因Sbi的 I 区和 II 区反应体系（50L）：超纯水 32 L， 10Taq Buffer 5L， dNTP Mixture 4L， MgCl2 4L， S1/S2 各 1L，模板 2L， Taq 酶 1L，加样后充分混匀； PCR 程序：预变性 94 5min ；进入。

21、循环：变性 94 30s，退火 51 30s，延伸 72 1min，共 30 个循环；最终延伸 72 10min ；（4）回收 PCR 扩增产物胶回收试剂盒回收 PCR 扩增产物用， -20保存备用； 4）构建真核表达载体 pCI- Hla/ClfA-A/ Sbi-I-II （1） pCI-Hla 重组载体的构建用限制性内切酶 Nhe I 和 Xho I 分别对 pCI、Hla在 37 温箱中酶切反应 1 h，酶切产物经核酸电泳鉴定纯化后回收，然后将二者混合于 16 过夜连接，将连接产物转化入感受态细胞，在 Amp+平板上 37培养 12 h 后挑取阳性质。

22、粒做菌液 PCR 鉴定、双酶切鉴定和测序鉴定；（2） pCI- Hla/ClfA-A 重组载体的构建用限制性内切酶Xho I和EcoR I分别对pCI-Hla、ClfA-A进行双酶切，方法同pCI-Hla 重组载体的构建方法；（3） pCI-Hla/ClfA-A/Sbi-I-II 重组载体的构建用限制性内切酶 EcoR I 和 Xba I 分别对 pCI- Hla/ClfA-A、Sbi-I-II进行双酶切，方法同 pCI-Hla 重组载体的构建方法； 5）建立免疫程序及评估免疫效果选12只1416 g的小鼠分两组，每组6只，分别用pCI质粒和重组的pCI-Hla。

23、/ClfA-A/ Sbi-I-II 质粒以肌肉途径注射免疫，每三周免疫一次，最后一次免疫后第 3 周采集小鼠血清；说明书 CN 102847172 A 6 3/5 页 7 IgG水平测定：用原核表达的ClfA的A区蛋白包被96孔板， 37 孵育2 h,加入小鼠血清， 37 共孵育2 h，最后加入辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG的二抗37 孵育1 h，酶标仪读取OD450的值，结果表明pCI质粒免疫组的OD450几乎为零， pCI-Hla/ClfA-A/Sbi-I-II 质粒免疫组的 OD450平均为 1.6，说明 pCI-Hla/ClfA-A/Sbi-I-II 质。

24、粒免疫组小鼠有较高的 IgG 水平； IgG1和IgG2a水平测定：方法同IgG水平测定， pCI质粒免疫组的IgG1和IgG2a的OD450 均为零，而 pCI-Hla/ClfA-A/Sbi-I-II 质粒免疫组 IgG1 和 IgG2a 水平均在 0.60.7 之间，且 IgG2a 的量大于 IgG1 的量，说明经 pCI-Hla/ClfA-A/Sbi-I-II 质粒免疫的小鼠能产生较强的细胞免疫应答和体液免疫应答，并且细胞免疫应答强于体液免疫应答；保护效应评估：用 100 L 1 106 /ml 的金黄色葡萄球菌分别感染 pCI 质粒免疫组小鼠、 pCI-Hla。

25、/ClfA-A/Sbi-I-II质粒免疫组小鼠的乳腺， 24 h后取小鼠的乳腺组织，称重、捣碎后，将组织匀浆涂抹在琼脂平板上， 37培养 12 h 后，计菌落数， pCI 质粒免疫组小鼠乳腺载菌量平均为 3107/g， pCI-Hla/ClfA-A/Sbi-I-II 质粒免疫组小鼠乳腺载菌量平均为 1.21010/g，说明 pCI-Hla/ClfA-A/Sbi-I-II 质粒免疫能对小鼠产生较强的免疫保护作用。 0009 所述的基因工程疫苗在预防山羊葡萄球菌乳房炎中的应用。 0010 与现有技术相比，本发明具有的优点和效果如下：本发明基因工程疫苗是以迅速发展的分子生物学。

26、技术、遗传性、免疫学为基础，包括基因工程亚单位疫苗、基因突变疫苗、核酸疫苗等。核酸疫苗即 DNA 疫苗，是重组构建一种或多种抗原编码基因的真核表达载体，并将其直接注入机体而激活免疫系统，以达到预防和治疗疾病的目的。核酸疫苗与病毒的自然感染过程相似，可促进粘膜免疫，诱导免疫记忆和引起广泛的免疫应答，产生很好的交叉保护反应，是一种更加安全稳定、制备简单、应用方便、价格低廉的新型疫苗。 0011 四、附图说明图 1 为本发明基因clfa的 PCR 的扩增结果图；图 2 为本发明基因 Hla 的 PCR 的扩增结果图；图 3 为本发明基因sbi的 PCR 。

27、的扩增结果图；图 4 为本发明 ELISA 检测 IgG 水平图；图 5 为本发明 ELISA 检测 IgG1、 IgG2a 水平。 0012 五、具体实施方式本疫苗研发时，选择基因基于以下事实： ClfA、 Hla 及 Sbi 是金黄色葡萄球菌产生的毒力因子，在金黄色葡萄球菌感染宿主的过程中以特定的结构域发挥毒力作用。ClfA 的 A 区（ClfA-A）是结合宿主细胞外基质中前卫蛋白与纤维蛋白原的功能性区域； Hla 通过各个单体之间的相互作用形成攻膜复合物，在靶细胞表面打孔使其裂解； Sbi 的 I 区和 II 区特异性地与宿主的IgG的Fc段结合，干扰。

28、抗体介导的调理吞噬作用从而抵抗宿主吞噬细胞的杀伤作用。 0013 1、设计引物根据 Genebank 上已经提交的ClfA、Hla及Sbi基因序列分别设计引物 H1/H2、 CA1/CA2 和 S1/S2，并加入相应的酶切位点： H1: GCGCTAGCATGAAAACACGTATAG NheI 说明书 CN 102847172 A 7 4/5 页 8 H2: GCCTCGAGTTAATTTGTCATTTCTTCT XhoI CA1: GCCTCGAGGTAGCTGCAGATG XhoI CA2: GCGAATTCCTCATCAGGTTGTTCAGGA EcoRI S1: GCG。

29、AATTCACAAACAACTCAAAACAACTAC EcoRI S2: GCTCTAGAATTTTGACGTTCTTTAGCTT XbaI 2、制备模板提取 DNA 模板所用的金黄色葡萄球菌分离自患临床乳房炎的奶山羊乳样。均匀涂抹乳样于血琼脂平板， 37温箱中过夜培养，挑取溶血性菌于显微镜下观察细菌形态，确定为金黄色葡萄球菌后再挑取菌落于5 mL LB液体培养基中， 37摇床中培养过夜。取1 mL菌液，用细菌基因组 DNA 快速抽提试剂盒提取金黄色葡萄球菌基因组 DNA， -20保存备用。 0014 3、 PCR 扩增与回收目的基因（1）扩增目的基因Hla 反应体系（。

30、50 L）：超纯水 32 L， 10 Taq Buffer 5 L， dNTP Mixture 4 L， MgCl2 4 L， H1/H2 各 1 L，模板 2 L， Taq 酶 1 L，加样后充分混匀。 0015 PCR 程序：预变性 94 5 min ；进入循环：变性 94 30 s，退火 51.6 30 s，延伸 72 1.5 min，共 30 个循环；最终延伸 72 10 min。（见图 2）（2）扩增目的基因ClfA的 A 区反应体系（50L）：超纯水 32 L， 10 Taq Buffer 5 L， dNTP Mixture 4 L， M。

31、gCl2 4 L， CA1/CA2 各 1 L，模板 2 L， Taq 酶 1 L，加样后充分混匀。 0016 PCR 程序：预变性 94 5 min ；进入循环：变性 94 30 s，退火 52 30 s，延伸 72 1.5 min，共 30 个循环；最终延伸 72 10 min。（见图 1）（3）扩增目的基因Sbi的 I 区和 II 区反应体系（50L）：超纯水 32 L， 10Taq Buffer 5L， dNTP Mixture 4L， MgCl2 4L， S1/S2 各 1L，模板 2L， Taq 酶 1L，加样后充分混匀。 0017 PCR。

32、程序：预变性94 5min ；进入循环：变性94 30s，退火51 30s，延伸72 1min，共 30 个循环；最终延伸 72 10min。（见图 3）（4）回收 PCR 扩增产物胶回收试剂盒回收 PCR 扩增产物用， -20保存备用。 0018 4、构建真核表达载体 pCI- Hla/ClfA-A/ Sbi-I-II （1） pCI-Hla 重组载体的构建用限制性内切酶 Nhe I 和 Xho I 分别对 pCI、Hla在 37 温箱中酶切反应 1 h，酶切产物经核酸电泳鉴定纯化后回收，然后将二者混合于16 过夜连接。将连接产物转化入感受态细胞，。

33、在 Amp+平板上 37培养 12 h 后挑取阳性质粒做菌液 PCR 鉴定、双酶切鉴定和测序鉴定。 0019 （2） pCI- Hla/ClfA-A 重组载体的构建用限制性内切酶Xho I和EcoR I分别对pCI-Hla、ClfA-A进行双酶切，方法同pCI-Hla 重组载体的构建方法。 0020 （3） pCI-Hla/ClfA-A/Sbi-I-II 重组载体的构建用限制性内切酶 EcoR I 和 Xba I 分别对 pCI- Hla/ClfA-A、Sbi-I-II进行双酶切，方说明书 CN 102847172 A 8 5/5 页 9 法同 pCI-Hla 重组载体的构建。

34、方法。 0021 5、建立免疫程序及评估免疫效果选12只1416 g的小鼠分两组，每组6只，分别用pCI质粒和重组的pCI-Hla/ClfA-A/ Sbi-I-II 质粒以肌肉途径注射免疫，每三周免疫一次，最后一次免疫后第 3 周采集小鼠血清。 0022 IgG 水平测定：用原核表达的 ClfA 的 A 区蛋白包被 96 孔板， 37 孵育 2 h, 加入小鼠血清， 37 共孵育2 h，最后加入辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG的二抗37 孵育 1 h，酶标仪读取 OD450的值，结果表明 pCI 质粒免疫组的 OD450几乎为零， pCI-Hla/ClfA-A/ Sb。

35、i-I-II 质粒免疫组的 OD450平均为 1.6，说明 pCI-Hla/ClfA-A/Sbi-I-II 质粒免疫组小鼠有较高的 IgG 水平（见图 4）。 0023 IgG1 和 IgG2a 水平测定：方法同 IgG 水平测定， pCI 质粒免疫组的 IgG1 和 IgG2a 的 OD450均为零，而 pCI-Hla/ClfA-A/Sbi-I-II 质粒免疫组 IgG1 和 IgG2a 水平均在 0.60.7 之间，且 IgG2a 的量大于 IgG1 的量，说明经 pCI-Hla/ClfA-A/Sbi-I-II 质粒免疫的小鼠能产生较强的细胞免疫应答和体液免疫应答，并。

36、且细胞免疫应答强于体液免疫应答（见图 5）。 0024 保护效应评估：用 100 L 1 106 /ml 的金黄色葡萄球菌分别感染 pCI 质粒免疫组小鼠、 pCI-Hla/ClfA-A/Sbi-I-II 质粒免疫组小鼠的乳腺， 24 h 后取小鼠的乳腺组织，称重、捣碎后，将组织匀浆涂抹在琼脂平板上， 37培养12 h后，计菌落数。 pCI质粒免疫组小鼠乳腺载菌量平均为 3107/g， pCI-Hla/ClfA-A/Sbi-I-II 质粒免疫组小鼠乳腺载菌量平均为 1.21010/g。说明 pCI-Hla/ClfA-A/Sbi-I-II 质粒免疫能对小鼠产生较强的免疫保。

37、护作用。说明书 CN 102847172 A 9 1/2 页 10 SEQUENCE LISTING 西北农林科技大学预防山羊葡萄球菌乳房炎的基因工程疫苗制备方法及应用 2012 6 PatentIn version 3.3 1 24 DNA 人工合成 1 gcgctagcat gaaaacacgt atag 24 2 27 DNA 人工合成 2 gcctcgagtt aatttgtcat ttcttct 27 3 21 DNA 人工合成 3 gcctcgaggt agctgcagat g 21 序列表 CN 102847172 A 10 2/2 页 11 4 27 DNA 人工合成 4 gcgaattcct catcaggttg ttcagga 27 5 30 DNA 人工合成 5 gcgaattcac aaacaactca aaacaactac 30 6 28 DNA 人工合成 6 gctctagaat tttgacgttc tttagctt 28 序列表 CN 102847172 A 11 1/1 页 12 图 1 图 2 图 3 图 4 图 5 说明书附图 CN 102847172 A 12 。

摘要
申请专利号：	CN201210394438.3	申请日：	2012.10.17
公开号：	CN102847172A	公开日：	2013.01.02
当前法律状态：	授权	有效性：	有权
法律详情：	授权\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):A61K 48/00申请日:20121017\|\|\|公开
IPC分类号：	A61K48/00; A61K39/085; A61P31/04	主分类号：	A61K48/00
申请人：	西北农林科技大学
发明人：	陈德坤; 许君艳; 姚运亮; 田婷婷; 李前瑞; 罗军; 曹斌云
地址：	712100 陕西省西安市杨凌示范区西农路西北农林科技大学动医学院
优先权：
专利代理机构：	西安新思维专利商标事务所有限公司 61114	代理人：	韩翎
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内容摘要

本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及一种预防山羊葡萄球菌乳房炎的基因工程疫苗制备方法及应用。本发明通过以下步骤完成：1）扩增目的基因ClfA、ClfA及Sbi；2）构建pCI-Hla/ClfA-A/Sbi-I-II真核重组表达载体；3）建立免疫程序及评估免疫效果。本发明基因工程疫苗是以迅速发展的分子生物学技术、遗传性、免疫学为基础，包括基因工程亚单位疫苗、基因突变疫苗、核酸疫苗等。核酸疫苗即DNA疫苗，是重组构建一种或多种抗原编码基因的真核表达载体，并将其直接注入机体而激活免疫系统，以达到预防和治疗疾病的目的。

权利要求书

权利要求书一种预防山羊葡萄球菌乳房炎的基因工程疫苗制备方法，其特征
在于：包括以下步骤：
1）扩增目的基因ClfA、ClfA及Sbi；
2）构建pCI‑ Hla/ClfA‑A/ Sbi‑I‑II真核重组表达载体；
3）建立免疫程序及评估免疫效果。
根据权利要求1所述的预防山羊葡萄球菌乳房炎的基因工程疫苗制备方法，其特征在于：所述的将ClfA、ClfA及Sbi三种蛋白的基因功能性区域串联，制成多价核酸疫苗，免疫宿主，使其在宿主细胞内表达，宿主产生特异性抗体以达到预防金黄色葡萄球菌感染的目的。
根据权利要求1所述的预防山羊葡萄球菌乳房炎的基因工程疫苗制备方法，其特征在于：所述的基因工程疫苗制备方法的具体步骤为：1）设计引物；2）制备模板；3）PCR扩增与回收目的基因；4）构建真核表达载体pCI‑ Hla/ClfA‑A/ Sbi‑I‑II；5）建立免疫程序及评估免疫效果。
根据权利要求3预防山羊葡萄球菌乳房炎的基因工程疫苗制备方法，其特征在于：
1）设计引物
根据Genebank上已经提交的ClfA、Hla及Sbi基因序列分别设计引物H1/H2、CA1/CA2和S1/S2，并加入相应的酶切位点：
H1: GCGCTAGCATGAAAACACGTATAG                NheI
H2: GCCTCGAGTTAATTTGTCATTTCTTCT              XhoI

CA1: GCCTCGAGGTAGCTGCAGATG                  XhoI
CA2:GCGAATTCCTCATCAGGTTGTTCAGGA            EcoRI

S1:GCGAATTCACAAACAACTCAAAACAACTAC          EcoRI
S2: GCTCTAGAATTTTGACGTTCTTTAGCTT             XbaI
2）制备模板
提取DNA模板所用的金黄色葡萄球菌分离自患临床乳房炎的奶山羊乳样，均匀涂抹乳样于血琼脂平板，37℃温箱中过夜培养，挑取溶血性菌于显微镜下观察细菌形态，确定为金黄色葡萄球菌后再挑取菌落于5 mL LB液体培养基中，37℃摇床中培养过夜，取1 mL菌液，用细菌基因组DNA快速抽提试剂盒提取金黄色葡萄球菌基因组DNA， ‑20℃保存备用；
3）PCR扩增与回收目的基因
（1）扩增目的基因Hla
反应体系（50 μL）：超纯水32 μL，10 × Taq Buffer 5 μL，dNTP Mixture 4 μL，MgCl2 4 μL，H1/H2各1 μL，模板2 μL，Taq酶1 μL，加样后充分混匀；
PCR程序：预变性94℃ 5 min；进入循环：变性94℃ 30 s，退火51.6℃ 30 s，延伸72℃ 1.5 min，共30个循环；最终延伸72℃ 10 min；
（2）扩增目的基因ClfA的A区
反应体系（50μL）：超纯水32 μL，10 × Taq Buffer 5 μL，dNTP Mixture 4 μL，MgCl2 4 μL，CA1/CA2各1 μL，模板2 μL，Taq酶1 μL，加样后充分混匀；
PCR程序：预变性94℃ 5 min；进入循环：变性94℃ 30 s，退火52℃ 30 s，延伸72℃ 1.5 min，共30个循环；最终延伸72℃ 10 min；
（3）扩增目的基因Sbi的I区和II区
反应体系（50μL）：超纯水32 μL，10×Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture 4μL，MgCl2 4μL，S1/S2各1μL，模板2μL，Taq酶1μL，加样后充分混匀；
PCR程序：预变性94℃ 5min；进入循环：变性94℃ 30s，退火51℃ 30s，延伸72℃ 1min，共30个循环；最终延伸72℃ 10min；
（4）回收PCR扩增产物
胶回收试剂盒回收PCR扩增产物用， ‑20℃保存备用；
4）构建真核表达载体pCI‑ Hla/ClfA‑A/ Sbi‑I‑II
（1）pCI‑Hla重组载体的构建
用限制性内切酶Nhe I和Xho I分别对pCI、Hla在37 ℃温箱中酶切反应1 h，酶切产物经核酸电泳鉴定纯化后回收，然后将二者混合于16 ℃过夜连接，将连接产物转化入感受态细胞，在Amp+平板上37℃培养12 h后挑取阳性质粒做菌液PCR鉴定、双酶切鉴定和测序鉴定；
（2）pCI‑ Hla/ClfA‑A重组载体的构建
用限制性内切酶Xho I和EcoR I分别对pCI‑Hla、ClfA‑A进行双酶切，方法同pCI‑Hla重组载体的构建方法；
（3）pCI‑Hla/ClfA‑A/Sbi‑I‑II重组载体的构建
用限制性内切酶EcoR I和Xba I分别对pCI‑ Hla/ClfA‑A、Sbi‑I‑II进行双酶切，方法同pCI‑Hla重组载体的构建方法；
5）建立免疫程序及评估免疫效果
选12只14~16 g的小鼠分两组，每组6只，分别用pCI质粒和重组的pCI‑Hla/ClfA‑A/Sbi‑I‑II质粒以肌肉途径注射免疫，每三周免疫一次，最后一次免疫后第3周采集小鼠血清；
IgG水平测定：用原核表达的ClfA的A区蛋白包被96孔板，37 ℃孵育2 h,加入小鼠血清，37 ℃共孵育2 h，最后加入辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG的二抗37 ℃孵育1 h，酶标仪读取OD450的值，结果表明pCI质粒免疫组的OD450几乎为零，pCI‑Hla/ClfA‑A/Sbi‑I‑II质粒免疫组的OD450平均为1.6，说明pCI‑Hla/ClfA‑A/Sbi‑I‑II质粒免疫组小鼠有较高的IgG水平；
IgG1和IgG2a水平测定：方法同IgG水平测定，pCI质粒免疫组的IgG1和IgG2a的OD450均为零，而pCI‑Hla/ClfA‑A/Sbi‑I‑II质粒免疫组IgG1和IgG2a水平均在0.6~0.7之间，且IgG2a的量大于IgG1的量，说明经pCI‑Hla/ClfA‑A/Sbi‑I‑II质粒免疫的小鼠能产生较强的细胞免疫应答和体液免疫应答，并且细胞免疫应答强于体液免疫应答；
保护效应评估：用100 μL 1 × 106 /ml的金黄色葡萄球菌分别感染pCI质粒免疫组小鼠、pCI‑Hla/ClfA‑A/Sbi‑I‑II质粒免疫组小鼠的乳腺，24 h后取小鼠的乳腺组织，称重、捣碎后，将组织匀浆涂抹在琼脂平板上，37℃培养12 h后，计菌落数，pCI质粒免疫组小鼠乳腺载菌量平均为3×107/g，pCI‑Hla/ClfA‑A/Sbi‑I‑II质粒免疫组小鼠乳腺载菌量平均为1.2×1010/g，说明pCI‑Hla/ClfA‑A/Sbi‑I‑II质粒免疫能对小鼠产生较强的免疫保护作用。
根据权利要求1所述的基因工程疫苗在预防山羊葡萄球菌乳房炎中的应用。

说明书

说明书预防山羊葡萄球菌乳房炎的基因工程疫苗制备方法及应用
一、技术领域：
本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及一种预防山羊葡萄球菌乳房炎的基因工程疫苗制备方法及应用。
二、背景技术：
乳房炎是令产奶动物养殖者比较头疼的动物疫病之一，引起母畜产奶量和相应的奶制品质量下降，造成重大的经济损失。金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、链球菌是造成乳房感染，引起临床、亚临床乳房炎的主要致病菌。因金黄色葡萄球菌抵抗多种抗生素的抑制作用，非抗生素途径控制金黄色葡萄球菌感染引起乳房炎已显得十分重要。
传统乳房炎疫苗为上述致病菌的弱毒活疫苗或灭活疫苗，在生产实践中，对乳房炎的防治有一定作用。然而随着大规模集约化养殖的发展，人工致弱菌株存在着同源重组、自身毒力返强等潜在可能，而灭活疫苗也存在使用剂量大、免疫期短等不足，为提高传统疫苗的安全性与免疫保护力，具有高效、廉价的新型疫苗研制极其重要。
三、发明内容：
本发明的目的在于提供一种预防山羊葡萄球菌乳房炎的基因工程疫苗制备方法及应用，其更加安全稳定、制备简单、应用方便、价格低廉。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种预防山羊葡萄球菌乳房
炎的基因工程疫苗制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）扩增目的基因ClfA、ClfA及Sbi；
2）构建pCI‑ Hla/ClfA‑A/ Sbi‑I‑II真核重组表达载体；
3）建立免疫程序及评估免疫效果。
所述的将ClfA、ClfA及Sbi三种蛋白的基因功能性区域串联，制成多价核酸疫苗，免疫宿主，使其在宿主细胞内表达，宿主产生特异性抗体以达到预防金黄色葡萄球菌感染的目的。
所述的基因工程疫苗制备方法的具体步骤为：1）设计引物；2）制备模板；3）PCR扩增与回收目的基因；4）构建真核表达载体pCI‑ Hla/ClfA‑A/ Sbi‑I‑II；5）建立免疫程序及评估免疫效果。
预防山羊葡萄球菌乳房炎的基因工程疫苗制备方法，其特征在于：
1）设计引物
根据Genebank上已经提交的ClfA、Hla及Sbi基因序列分别设计引物H1/H2、CA1/CA2和S1/S2，并加入相应的酶切位点：
H1: GCGCTAGCATGAAAACACGTATAG                NheI
H2: GCCTCGAGTTAATTTGTCATTTCTTCT              XhoI
CA1: GCCTCGAGGTAGCTGCAGATG                  XhoI
CA2: GCGAATTCCTCATCAGGTTGTTCAGGA            EcoRI
S1: GCGAATTCACAAACAACTCAAAACAACTAC          EcoRI
S2: GCTCTAGAATTTTGACGTTCTTTAGCTT             XbaI
2）制备模板
提取DNA模板所用的金黄色葡萄球菌分离自患临床乳房炎的奶山羊乳样，均匀涂抹乳样于血琼脂平板，37℃温箱中过夜培养，挑取溶血性菌于显微镜下观察细菌形态，确定为金黄色葡萄球菌后再挑取菌落于5 mL LB液体培养基中，37℃摇床中培养过夜，取1 mL菌液，用细菌基因组DNA快速抽提试剂盒提取金黄色葡萄球菌基因组DNA， ‑20℃保存备用；
3）PCR扩增与回收目的基因
（1）扩增目的基因Hla
反应体系（50 μL）：超纯水32 μL，10 × Taq Buffer 5 μL，dNTP Mixture 4 μL，MgCl2 4 μL，H1/H2各1 μL，模板2 μL，Taq酶1 μL，加样后充分混匀；
PCR程序：预变性94℃ 5 min；进入循环：变性94℃ 30 s，退火51.6℃ 30 s，延伸72℃ 1.5 min，共30个循环；最终延伸72℃ 10 min；
（2）扩增目的基因ClfA的A区
反应体系（50μL）：超纯水32 μL，10 × Taq Buffer 5 μL，dNTP Mixture 4 μL，MgCl2 4 μL，CA1/CA2各1 μL，模板2 μL，Taq酶1 μL，加样后充分混匀；
PCR程序：预变性94℃ 5 min；进入循环：变性94℃ 30 s，退火52℃ 30 s，延伸72℃ 1.5 min，共30个循环；最终延伸72℃ 10 min；
（3）扩增目的基因Sbi的I区和II区
反应体系（50μL）：超纯水32 μL，10×Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture 4μL，MgCl2 4μL，S1/S2各1μL，模板2μL，Taq酶1μL，加样后充分混匀；
PCR程序：预变性94℃ 5min；进入循环：变性94℃ 30s，退火51℃ 30s，延伸72℃ 1min，共30个循环；最终延伸72℃ 10min；
（4）回收PCR扩增产物
胶回收试剂盒回收PCR扩增产物用， ‑20℃保存备用；
4）构建真核表达载体pCI‑ Hla/ClfA‑A/ Sbi‑I‑II
（1）pCI‑Hla重组载体的构建
用限制性内切酶Nhe I和Xho I分别对pCI、Hla在37 ℃温箱中酶切反应1 h，酶切产物经核酸电泳鉴定纯化后回收，然后将二者混合于16 ℃过夜连接，将连接产物转化入感受态细胞，在Amp+平板上37℃培养12 h后挑取阳性质粒做菌液PCR鉴定、双酶切鉴定和测序鉴定；
（2）pCI‑ Hla/ClfA‑A重组载体的构建
用限制性内切酶Xho I和EcoR I分别对pCI‑Hla、ClfA‑A进行双酶切，方法同pCI‑Hla重组载体的构建方法；
（3）pCI‑Hla/ClfA‑A/Sbi‑I‑II重组载体的构建
用限制性内切酶EcoR I和Xba I分别对pCI‑ Hla/ClfA‑A、Sbi‑I‑II进行双酶切，方法同pCI‑Hla重组载体的构建方法；
5）建立免疫程序及评估免疫效果
选12只14~16 g的小鼠分两组，每组6只，分别用pCI质粒和重组的pCI‑Hla/ClfA‑A/Sbi‑I‑II质粒以肌肉途径注射免疫，每三周免疫一次，最后一次免疫后第3周采集小鼠血清；
IgG水平测定：用原核表达的ClfA的A区蛋白包被96孔板，37 ℃孵育2 h,加入小鼠血清，37 ℃共孵育2 h，最后加入辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG的二抗37 ℃孵育1 h，酶标仪读取OD450的值，结果表明pCI质粒免疫组的OD450几乎为零，pCI‑Hla/ClfA‑A/Sbi‑I‑II质粒免疫组的OD450平均为1.6，说明pCI‑Hla/ClfA‑A/Sbi‑I‑II质粒免疫组小鼠有较高的IgG水平；
IgG1和IgG2a水平测定：方法同IgG水平测定，pCI质粒免疫组的IgG1和IgG2a的OD450均为零，而pCI‑Hla/ClfA‑A/Sbi‑I‑II质粒免疫组IgG1和IgG2a水平均在0.6~0.7之间，且IgG2a的量大于IgG1的量，说明经pCI‑Hla/ClfA‑A/Sbi‑I‑II质粒免疫的小鼠能产生较强的细胞免疫应答和体液免疫应答，并且细胞免疫应答强于体液免疫应答；
保护效应评估：用100 μL 1 × 106 /ml的金黄色葡萄球菌分别感染pCI质粒免疫组小鼠、pCI‑Hla/ClfA‑A/Sbi‑I‑II质粒免疫组小鼠的乳腺，24 h后取小鼠的乳腺组织，称重、捣碎后，将组织匀浆涂抹在琼脂平板上，37℃培养12 h后，计菌落数，pCI质粒免疫组小鼠乳腺载菌量平均为3×107/g，pCI‑Hla/ClfA‑A/Sbi‑I‑II质粒免疫组小鼠乳腺载菌量平均为1.2×1010/g，说明pCI‑Hla/ClfA‑A/Sbi‑I‑II质粒免疫能对小鼠产生较强的免疫保护作用。
所述的基因工程疫苗在预防山羊葡萄球菌乳房炎中的应用。
与现有技术相比，本发明具有的优点和效果如下：本发明基因工程疫苗是以迅速发展的分子生物学技术、遗传性、免疫学为基础，包括基因工程亚单位疫苗、基因突变疫苗、核酸疫苗等。核酸疫苗即DNA疫苗，是重组构建一种或多种抗原编码基因的真核表达载体，并将其直接注入机体而激活免疫系统，以达到预防和治疗疾病的目的。核酸疫苗与病毒的自然感染过程相似，可促进粘膜免疫，诱导免疫记忆和引起广泛的免疫应答，产生很好的交叉保护反应，是一种更加安全稳定、制备简单、应用方便、价格低廉的新型疫苗。
四、附图说明
图1为本发明基因clfa的PCR的扩增结果图；
图2为本发明基因Hla的PCR 的扩增结果图；
图3为本发明基因sbi的PCR的扩增结果图；
图4 为本发明ELISA检测IgG水平图；
图5 为本发明ELISA检测IgG1、IgG2a水平。
五、具体实施方式
本疫苗研发时，选择基因基于以下事实：ClfA、Hla及Sbi是金黄色葡萄球菌产生的毒力因子，在金黄色葡萄球菌感染宿主的过程中以特定的结构域发挥毒力作用。ClfA的A区（ClfA‑A）是结合宿主细胞外基质中前卫蛋白与纤维蛋白原的功能性区域；Hla通过各个单体之间的相互作用形成攻膜复合物，在靶细胞表面打孔使其裂解；Sbi的I区和II区特异性地与宿主的IgG的Fc段结合，干扰抗体介导的调理吞噬作用从而抵抗宿主吞噬细胞的杀伤作用。
1、设计引物
根据Genebank上已经提交的ClfA、Hla及Sbi基因序列分别设计引物H1/H2、CA1/CA2和S1/S2，并加入相应的酶切位点：
H1: GCGCTAGCATGAAAACACGTATAG                NheI
H2: GCCTCGAGTTAATTTGTCATTTCTTCT              XhoI
CA1: GCCTCGAGGTAGCTGCAGATG                  XhoI
CA2: GCGAATTCCTCATCAGGTTGTTCAGGA            EcoRI
S1: GCGAATTCACAAACAACTCAAAACAACTAC          EcoRI
S2: GCTCTAGAATTTTGACGTTCTTTAGCTT             XbaI
2、制备模板
提取DNA模板所用的金黄色葡萄球菌分离自患临床乳房炎的奶山羊乳样。均匀涂抹乳样于血琼脂平板，37℃温箱中过夜培养，挑取溶血性菌于显微镜下观察细菌形态，确定为金黄色葡萄球菌后再挑取菌落于5 mL LB液体培养基中，37℃摇床中培养过夜。取1 mL菌液，用细菌基因组DNA快速抽提试剂盒提取金黄色葡萄球菌基因组DNA， ‑20℃保存备用。
3、PCR扩增与回收目的基因
（1）扩增目的基因Hla
反应体系（50 μL）：超纯水32 μL，10 × Taq Buffer 5 μL，dNTP Mixture 4 μL，MgCl2 4 μL，H1/H2各1 μL，模板2 μL，Taq酶1 μL，加样后充分混匀。
PCR程序：预变性94℃ 5 min；进入循环：变性94℃ 30 s，退火51.6℃ 30 s，延伸72℃ 1.5 min，共30个循环；最终延伸72℃ 10 min。（见图2）
（2）扩增目的基因ClfA的A区
反应体系（50μL）：超纯水32 μL，10 × Taq Buffer 5 μL，dNTP Mixture 4 μL，MgCl2 4 μL，CA1/CA2各1 μL，模板2 μL，Taq酶1 μL，加样后充分混匀。
PCR程序：预变性94℃ 5 min；进入循环：变性94℃ 30 s，退火52℃ 30 s，延伸72℃ 1.5 min，共30个循环；最终延伸72℃ 10 min。（见图1）
（3）扩增目的基因Sbi的I区和II区
反应体系（50μL）：超纯水32 μL，10×Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture 4μL，MgCl2 4μL，S1/S2各1μL，模板2μL，Taq酶1μL，加样后充分混匀。
PCR程序：预变性94℃ 5min；进入循环：变性94℃ 30s，退火51℃ 30s，延伸72℃ 1min，共30个循环；最终延伸72℃ 10min。（见图3）
（4）回收PCR扩增产物
胶回收试剂盒回收PCR扩增产物用， ‑20℃保存备用。
4、构建真核表达载体pCI‑ Hla/ClfA‑A/ Sbi‑I‑II
（1）pCI‑Hla重组载体的构建
用限制性内切酶Nhe I和Xho I分别对pCI、Hla在37 ℃温箱中酶切反应1 h，酶切产物经核酸电泳鉴定纯化后回收，然后将二者混合于16 ℃过夜连接。将连接产物转化入感受态细胞，在Amp+平板上37℃培养12 h后挑取阳性质粒做菌液PCR鉴定、双酶切鉴定和测序鉴定。
（2）pCI‑ Hla/ClfA‑A重组载体的构建
用限制性内切酶Xho I和EcoR I分别对pCI‑Hla、ClfA‑A进行双酶切，方法同pCI‑Hla重组载体的构建方法。
（3）pCI‑Hla/ClfA‑A/Sbi‑I‑II重组载体的构建
用限制性内切酶EcoR I和Xba I分别对pCI‑ Hla/ClfA‑A、Sbi‑I‑II进行双酶切，方法同pCI‑Hla重组载体的构建方法。
5、建立免疫程序及评估免疫效果
选12只14~16 g的小鼠分两组，每组6只，分别用pCI质粒和重组的pCI‑Hla/ClfA‑A/Sbi‑I‑II质粒以肌肉途径注射免疫，每三周免疫一次，最后一次免疫后第3周采集小鼠血清。
IgG水平测定：用原核表达的ClfA的A区蛋白包被96孔板，37 ℃孵育2 h,加入小鼠血清，37 ℃共孵育2 h，最后加入辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG的二抗37 ℃孵育1 h，酶标仪读取OD450的值，结果表明pCI质粒免疫组的OD450几乎为零，pCI‑Hla/ClfA‑A/Sbi‑I‑II质粒免疫组的OD450平均为1.6，说明pCI‑Hla/ClfA‑A/Sbi‑I‑II质粒免疫组小鼠有较高的IgG水平（见图4）。
IgG1和IgG2a水平测定：方法同IgG水平测定，pCI质粒免疫组的IgG1和IgG2a的OD450均为零，而pCI‑Hla/ClfA‑A/Sbi‑I‑II质粒免疫组IgG1和IgG2a水平均在0.6~0.7之间，且IgG2a的量大于IgG1的量，说明经pCI‑Hla/ClfA‑A/Sbi‑I‑II质粒免疫的小鼠能产生较强的细胞免疫应答和体液免疫应答，并且细胞免疫应答强于体液免疫应答（见图5）。
保护效应评估：用100 μL 1 × 106 /ml的金黄色葡萄球菌分别感染pCI质粒免疫组小鼠、pCI‑Hla/ClfA‑A/Sbi‑I‑II质粒免疫组小鼠的乳腺，24 h后取小鼠的乳腺组织，称重、捣碎后，将组织匀浆涂抹在琼脂平板上，37℃培养12 h后，计菌落数。pCI质粒免疫组小鼠乳腺载菌量平均为3×107/g，pCI‑Hla/ClfA‑A/Sbi‑I‑II质粒免疫组小鼠乳腺载菌量平均为1.2×1010/g。说明pCI‑Hla/ClfA‑A/Sbi‑I‑II质粒免疫能对小鼠产生较强的免疫保护作用。