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1、(10)申请公布号 CN 102861358 A (43)申请公布日 2013.01.09 CN 102861358 A *CN102861358A* (21)申请号 201210298860.9 (22)申请日 2012.08.16 A61L 27/36(2006.01) A61L 27/56(2006.01) (71)申请人 吴鸿 地址 湖南省长沙市雨花区梨子山 21 栋 601 房 (72)发明人 吴鸿 (54) 发明名称 一种以脐带沃顿胶为材料制作新型生物软骨 支架 (57) 摘要 本发明公开了一种以脐带沃顿胶制作新型生 物软骨支架的方法， 包括首先对脐带标本进行处 理制作出新型生物软。
2、骨支架的流程 ； 支架材料经 石蜡包埋切片后， 行 HE 染色， 光镜下观察材料的 孔性结构 ； 取制备的三维多孔支架切成约 50um 薄 片， 于表面喷铂金处理后， 于扫描电镜下观察， 选 择合适倍数拍摄扫描照片， 观察复合支架材料的 形貌 ； 通过对人脐带沃顿胶结合物理和化学两种 方法进行脱细胞处理， 再经冷冻干燥成型后成功 地制备了三维多孔海绵样支架， 去细胞彻底， 且不 破坏胶原结构。本方法通过对人脐带沃顿胶结合 物理和化学两种方法进行脱细胞处理， 再经冷冻 干燥成型后成功地制备了三维多孔海绵样支架， 去细胞彻底， 且不破坏胶原结构， 适合作为软骨组 织工程的支架载体。 (51)Int。
3、.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 一种以脐带沃顿胶制作新型生物软骨支架的方法， 其特征在于， 该方法包括以下步 骤 ： 对脐带标本进行处理制作出新型生物软骨支架 ； 支架材料经石蜡包埋切片后， 行 HE 染色， 光镜下观察材料的孔性结构 ； 取制备的三维多孔支架切成约 50um 薄片， 于表面喷铂金处理后， 扫描电镜下观察， 选 择合适倍数拍摄扫描照片， 观察复合支架材料的形貌 ； 通过对人脐带沃顿胶结合物理和化学两种方法进行脱细胞处理，。
4、 再经冷冻干燥成型后 成功地制备了三维多孔海绵样支架， 去细胞彻底， 且不破坏胶原结构。 2. 如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 对脐带标本进行处理制作出新型生物软骨 支架的流程包括以下步骤 ： (1) 将脐带取下后， 磷酸盐缓冲液反复冲洗， 冲净脐带表面及脐血管中的脐血， 手术剪 将脐血管及脐带外膜小心分离后去除， 分离出沃顿胶， 将脐带沃顿胶剪成长约 2cm 小段备 用 ； (2) 再次用合青、 链霉素 PBS 液冲洗沃顿胶， 5 分钟 3 次 ； (3) 三蒸水浸泡沃顿胶 ； (4) 胰酶 37消化 30 分钟， 反复震荡 ； (5) 三蒸水反复震荡漂洗 ； (6) 将漂洗后的。
5、沃顿胶装入冻存管中， 置入含 -196液氮的液氮罐中冷冻 15 分钟， 取 出 37水浴快速复温解冻， 重复 3 次 ； (7) 再次予 PBS 液清洗数次 ； (8) 三蒸水浸泡 5 小时， 并震荡数次 ； (9) 低温冰箱， -80预冻 1 小时成型 ； (10) 真空冷冻干燥机中真空冷冻干燥 16 小时 ； (11) 将经过冷冻干燥处理后制备出的支架分装在双层塑料袋中 ； (12) 使用环氧乙烷灭菌 12 小时 ； (13) 放置于 4冰箱中密封条件下保存备用。 3. 如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 支架呈三维多孔网状结构， 孔隙分布较均 匀， 材料内空隙相互连通， 适合作为。
6、软骨组织工程的支架载体。 权 利 要 求 书 CN 102861358 A 2 1/4 页 3 一种以脐带沃顿胶为材料制作新型生物软骨支架 技术领域 0001 本发明属于生物软骨支架技术领域， 尤其涉及一种以脐带沃顿胶为材料制作新型 生物软骨支架。 背景技术 0002 由于创伤、 肿瘤、 感染及退行性变等各种原因导致的关节软骨损伤在临床上常 见， 然而关节软骨细胞属于终末分化细胞， 且在软骨组织中软骨细胞所占比例较小 ( 少于 1 )， 软骨本身又缺乏血管、 神经及淋巴管分布， 因此软骨组织自我修复能力低下。 0003 传统上修复软骨损伤常用的方法有关节腔清理术、 关节磨削成形术、 软骨下骨钻。
7、 孔术及微骨折术等， 但利用这些技术修复软骨损伤， 到目前为止效果一直都不理想， 因为其 形成的修复组织往往并不是透明软骨， 而是纤维软骨， 从而影响修复效果及关节功能。 而自 体骨软骨、 骨膜或软骨膜移植取材时可造成附加损伤， 且其来源有限 ； 异体组织虽来源广泛 但存在难以解决的排斥反应问题。 发明内容 0004 本实用新型针对现有修复软骨损伤常用方法中存在的缺点， 如关节腔清理术、 关 节磨削成形术、 软骨下骨钻孔术及微骨折术形成的修复组织往往并不是透明软骨， 而是纤 维软骨， 从而影响修复效果及关节功能 ； 自体骨软骨、 骨膜或软骨膜移植取材时可造成附加 损伤， 且其来源有限 ； 异体。
8、组织虽来源广泛但存在难以解决的排斥反应问题， 提出一种以脐 带沃顿胶制作新型生物软骨支架的方法。 0005 本发明实施例是这样实现的， 一种以脐带沃顿胶制作新型生物软骨支架的方法， 其特征在于， 该方法包括以下步骤 ： 0006 对脐带标本进行处理制作出新型生物软骨支架 ； 0007 支架材料经石蜡包埋切片后， 行 HE 染色， 光镜下观察材料的孔性结构 ； 0008 取制备的三维多孔支架切成约 50um 薄片， 于表面喷铂金处理后， 扫描电镜下观 察， 选择合适倍数拍摄扫描照片， 观察复合支架材料的形貌 ； 0009 通过对人脐带沃顿胶结合物理和化学两种方法进行脱细胞处理， 再经冷冻干燥成 。
9、型后成功地制备了三维多孔海绵样支架， 去细胞彻底， 且不破坏胶原结构。 0010 进一步， 对脐带标本进行处理制作出新型生物软骨支架的流程包括以下步骤 ： 0011 (1) 将脐带取下后， 磷酸盐缓冲液反复冲洗， 冲净脐带表面及脐血管中的脐血， 手 术剪将脐血管及脐带外膜小心分离后去除， 分离出沃顿胶， 将脐带沃顿胶剪成长约 2cm 小 段备用 ； 0012 (2) 再次用含青、 链霉素 PBS 液冲洗沃顿胶， 5 分钟 3 次 ； 0013 (3) 三蒸水浸泡沃顿胶 ； 0014 (4) 胰酶 37消化 30 分钟， 反复震荡 ； 0015 (5) 三蒸水反复震荡漂洗 ； 说 明 书 CN 。
10、102861358 A 3 2/4 页 4 0016 (6) 将漂洗后的沃顿胶装入冻存管中， 置入含 -196液氮的液氮罐中冷冻 15 分 钟， 取出 37水浴快速复温解冻， 重复 3 次 ； 0017 (7) 再次予 PBS 液清洗数次 ； 0018 (8) 三蒸水浸泡 5 小时， 并震荡数次 ； 0019 (9) 低温冰箱， -80预冻 1 小时成型 ； 0020 (10) 真空冷冻干燥机中真空冷冻干燥 16 小时 ； 0021 (11) 将经过冷冻干燥处理后制备出的支架分装在双层塑料袋中 ； 0022 (12) 使用环氧乙烷灭菌 12 小时 ； 0023 (13) 放置于 4冰箱中密封条。
11、件下保存备用。 0024 进一步， 支架呈三维多孔网状结构， 孔隙分布较均匀， 材料内空隙相互连通， 适合 作为软骨组织工程的支架载体。 0025 本发明提供的以脐带沃顿胶制作新型生物软骨支架的方法， 通过对人脐带沃顿胶 结合物理和化学两种方法进行脱细胞处理， 再经冷冻干燥成型后成功地制备了三维多孔海 绵样支架， 去细胞彻底， 且不破坏胶原结构。 支架呈三维多孔网状结构， 孔隙分布较均匀， 材 料内空隙相互连通， 适合作为软骨组织工程的支架载体。 附图说明 0026 图 1 是本发明实施例提供的以脐带沃顿胶制作新型生物软骨支架的流程图。 具体实施方式 0027 为了使本发明的目的、 技术方案及。
12、优点更加清楚明白， 以下结合附图及实施例， 对 本发明进行进一步详细说明。 应当理解， 此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明， 并 不用于限定本发明。 0028 图 1 示出了本发明实施例提供的以脐带沃顿胶制作新型生物软骨支架的流程图。 该方法包括 ： 0029 S101 ： 对脐带标本进行处理制作出新型生物软骨支架。(1) 将脐带取下后， 磷酸盐 缓冲液 (PBS 液 ) 反复冲洗， 冲净脐带表面及脐血管中的脐血， 手术剪将脐血管及脐带外膜 小心分离后去除， 分离出沃顿胶， 将脐带沃顿胶剪成长约 2cm 小段备用 ； 0030 (2) 再次用含青、 链霉素 PBS 液冲洗沃顿胶， 5 分。
13、钟 3 次 ； 0031 (3) 三蒸水浸泡沃顿胶 ； 0032 (4) 胰酶 (2.5g/l)37消化 30 分钟 ( 反复震荡 ) ； 0033 (5) 三蒸水反复震荡漂洗 ； 0034 (6) 将漂洗后的沃顿胶装入冻存管中， 置入含 -196液氮的液氮罐中冷冻 15 分 钟， 取出 37水浴快速复温解冻， 重复 3 次 ； 0035 (7) 再次予 PBS 液清洗数次 ； 0036 (8) 三蒸水浸泡 5 小时， 并震荡数次 ； 0037 (9) 低温冰箱 (-80 ) 预冻 1 小时成型 ； 0038 (10) 真空冷冻干燥机中真空冷冻干燥 16 小时 ； 0039 (11) 将经过冷。
14、冻干燥处理后制备出的支架分装在双层塑料袋中 ； 说 明 书 CN 102861358 A 4 3/4 页 5 0040 (12) 使用环氧乙烷灭菌 12 小时 ； 0041 (13) 放置于 4冰箱中密封条件下保存备用。 0042 S102 ： 支架材料经石蜡包埋切片后， 行 HE 染色， 光镜下观察材料的孔性结构。 0043 S103 ： 取制备的三维多孔支架切成约 50um 薄片， 于表面喷铂金处理后， 扫描电镜 下观察， 选择合适倍数拍摄扫描照片， 观察复合支架材料的形貌支架材料的扫描电镜观察。 0044 S104 ： 结果。 通过对人脐带沃顿胶结合物理和化学两种方法进行脱细胞处理， 再。
15、经 冷冻干燥成型后成功地制备了三维多孔海绵样支架， 去细胞彻底， 且不破坏胶原结构。 支架 呈三维多孔网状结构， 孔隙分布较均匀， 材料内空隙相互连通， 适合作为软骨组织工程的支 架载体。 0045 本发明实施例提供的以脐带沃顿胶制作新型生物软骨支架的方法， 主要包括以下 步骤 ： 0046 第一步、 对脐带标本进行处理制作出新型生物软骨支架。(1) 将脐带取下后， 磷酸 盐缓冲液 (PBS 液 ) 反复冲洗， 冲净脐带表面及脐血管中的脐血， 手术剪将脐血管及脐带外 膜小心分离后去除， 分离出沃顿胶， 将脐带沃顿胶剪成长约 2cm 小段备用 ； 0047 (2) 再次用含青、 链霉素 PBS 。
16、液冲洗沃顿胶， 5 分钟 3 次 ； 0048 (3) 三蒸水浸泡沃顿胶 ； 0049 (4) 胰酶 (2.5g/l)37消化 30 分钟 ( 反复震荡 ) ； 0050 (5) 三蒸水反复震荡漂洗 ； 0051 (6) 将漂洗后的沃顿胶装入冻存管中， 置入含 -196液氮的液氮罐中冷冻 15 分 钟， 取出 37水浴快速复温解冻， 重复 3 次 ； 0052 (7) 再次予 PBS 液清洗数次 ； 0053 (8) 三蒸水浸泡 5 小时， 并震荡数次 ； 0054 (9) 低温冰箱 (-80 ) 预冻 1 小时成型 ； 0055 (10) 真空冷冻干燥机中真空冷冻干燥 16 小时 ； 005。
17、6 (11) 将经过冷冻干燥处理后制备出的支架分装在双层塑料袋中 ； 0057 (12) 使用环氧乙烷灭菌 12 小时 ； 0058 (13) 放置于 4冰箱中密封条件下保存备用。 0059 第二步、 支架材料经石蜡包埋切片后， 行 HE 染色， 光镜下观察材料的孔性结构。 0060 第三步、 取制备的三维多孔支架切成约 50um 薄片， 于表面喷铂金处理后， 扫描电 镜下观察， 选择合适倍数拍摄扫描照片， 观察复合支架材料的形貌支架材料的扫描电镜观 察支架材料的扫描电镜观察。 0061 第四步、 结果。 通过对人脐带沃顿胶结合物理和化学两种方法进行脱细胞处理， 再 经冷冻干燥成型后成功地制备。
18、了三维多孔海绵样支架， 去细胞彻底， 且不破坏胶原结构。 支 架呈三维多孔网状结构， 孔隙分布较均匀， 材料内空隙相互连通， 适合作为软骨组织工程的 支架载体。 0062 本发明实施例提供的以脐带沃顿胶制作新型生物软骨支架的方法， 通过对人脐带 沃顿胶结合物理和化学两种方法进行脱细胞处理， 再经冷冻干燥成型后成功地制备了三维 多孔海绵样支架， 去细胞彻底， 且不破坏胶原结构。支架呈三维多孔网状结构， 孔隙分布较 均匀， 材料内空隙相互连通， 适合作为软骨组织工程的支架载体。 说 明 书 CN 102861358 A 5 4/4 页 6 0063 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已， 并不用以限制本发明， 凡在本发明的精 神和原则之内所作的任何修改、 等同替换和改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。 说 明 书 CN 102861358 A 6 1/1 页 7 图 1 说 明 书 附 图 CN 102861358 A 7 。