用于恶性肿瘤治疗的组合物及其应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102895672 A (43)申请公布日 2013.01.30 CN 102895672 A *CN102895672A* (21)申请号 201210046682.0 (22)申请日 2012.02.24 A61K 48/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (71)申请人 中国科学院北京基因组研究所 地址 100029 北京市朝阳区北土城西路七号 (72)发明人 李春燕 杨芳 刘稳升 王瑜 吕雪梅 吴仲义 (74)专利代理机构 北京同达信恒知识产权代理 有限公司 11291 代理人 郭红丽 (54) 发明名称 用于恶性肿瘤治疗的组合物及。

2、其应用 (57) 摘要 本发明涉及一种用于恶性肿瘤治疗的组合物 及其应用。所述组合物包含 SEQ ID No.1、 SEQ ID No.3、 SEQ ID No.5、 SEQ ID No.7 和 SEQ ID No.9 所示的 siRNA。本发明的用于恶性肿瘤治疗的组 合物能够大幅降低癌细胞的存活率。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 9 页 序列表 7 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 9 页 序列表 7 页 1/1 页 2 1. 用于恶性肿瘤治疗的组合物， 其特征在于， 所述组合物包含 SEQ ID No.1、 S。

3、EQ ID No.3、 SEQ ID No.5、 SEQ ID No.7 和 SEQ ID No.9 所示的 siRNA。 2. 根据权利要求 1 所述的用于恶性肿瘤治疗的组合物， 其特征在于， 所述组合物还包 括SEQ ID No.2、 SEQ ID No.6、 SEQ ID No.10、 SEQ ID No.11和SEQ ID No.13所示的siRNA。 3. 根据权利要求 2 所述的用于恶性肿瘤治疗的组合物， 其特征在于， 所述组合物的有 效药效成分由 SEQ ID No.1、 SEQ ID No.2、 SEQ ID No.3、 SEQ ID No.5、 SEQ ID No.6、 SE。

4、Q ID No.7、 SEQ ID No.9、 SEQ ID No.10、 SEQ ID No.11 和 SEQ ID No.13 所示的 siRNA 组成。 4.根据权利要求2所述的用于恶性肿瘤治疗的组合物， 其特征在于， 所述组合物由SEQ ID No.1、 SEQ ID No.2、 SEQ ID No.3、 SEQ ID No.5、 SEQ ID No.6、 SEQ ID No.7、 SEQ ID No.9、 SEQ ID No.10、 SEQ ID No.11 和 SEQ ID No.13 所示的 siRNA 组成。 5. 根据权利要求 1-4 中任一项所述的用于恶性肿瘤治疗的组合物，。

5、 其特征在于， 所述 恶性肿瘤是骨肉瘤。 6. 权利要求 1-4 中任一项所述的组合物在制备治疗恶性肿瘤的药物中的应用。 7. 根据权利要求 6 所述的应用， 其特征在于， 所述恶性肿瘤是骨肉瘤。 权 利 要 求 书 CN 102895672 A 2 1/9 页 3 用于恶性肿瘤治疗的组合物及其应用 技术领域 0001 本发明涉及用于恶性肿瘤治疗的组合物及其应用。 背景技术 0002 恶性肿瘤是导致人类死亡的主要疾病类型之一， 当前， 人类尚未发现有效的治疗 方案。比如说， 骨肉瘤是最常见的骨恶性肿瘤， 其恶性程度甚高， 常发生于青少年， 发展迅 速， 若不经过有效治疗， 数月内即可通过血液循。

6、环转移至肺部， 从而导致患者死亡。 0003 研 究 发 现， ANAPC5(51433， 该 数 字 表 示 在 NCBI 中 的 Gene ID， 以 下 同。)、 CCNT2(905)、 CDCA5(113130)、 CSNK1(1452)、 CTNNB1(1499)、 FAS(355)、 FZD6(8323)、 GLI1(2735)、 HIP1(3092)、 MTOR(2475)、 NOTCH1(4851)、 RANBP9(10048)、 RBPJ(3516)、 RRM2(6241) 和 SMO(6608) 基因都是肿瘤相关基因， 在细胞癌变后， 其表达会出现不同程度 的升高。 发明内。

7、容 0004 本发明的目的在于提供一种用于癌症基因治疗的组合物。 0005 基于上述目的， 本发明提供一种用于恶性肿瘤治疗的组合物， 所述组合物包含 SEQ ID No.1、 SEQ ID No.3、 SEQ ID No.5、 SEQ ID No.7 和 SEQ ID No.9 所示的 siRNA。 0006 所述组合物还包括 SEQ ID No.2、 SEQ ID No.6、 SEQ ID No.10、 SEQ ID No.11 和 SEQ ID No.13 所示的 siRNA。 0007 作为优选， 所述组合物的有效药效成分由 SEQ ID No.1、 SEQ ID No.2、 SEQ I。

8、D No.3、 SEQ ID No.5、 SEQ ID No.6、 SEQ ID No.7、 SEQ ID No.9、 SEQ ID No.10、 SEQ ID No.11 和 SEQ ID No.13 所示的 siRNA 组成。 0008 进一步优选， 所述组合物由 SEQ ID No.1、 SEQ ID No.2、 SEQ ID No.3、 SEQ ID No.5、 SEQ ID No.6、 SEQ ID No.7、 SEQ ID No.9、 SEQ ID No.10、 SEQ ID No.11 和 SEQ ID No.13 所示的 siRNA 组成。 0009 作为进一步优选， 所述恶性。

9、肿瘤是骨肉瘤。 0010 本发明还提供上述组合物在制备治疗恶性肿瘤的药物中的应用， 尤其是在制备治 疗骨肉瘤的药物中的应用。 0011 施加本发明提供的用于恶性肿瘤治疗的组合物后， 癌细胞的存活率大幅降低。 具体实施方式 0012 1. 合成 siRNA 0013 由广州市锐博生物科技有限公司合成以下15条siRNA， 其正义链序列如表1所示。 0014 表 1 0015 说 明 书 CN 102895672 A 3 2/9 页 4 序列号 siRNA 正义链序列 SEQ ID No.1 GAAAGCGGUUGUAUUACAATT SEQ ID No.2 ACCGUAUGAAGUACUUGGC。

10、TT SEQ ID No.3 AAUGAUGAUCUCAACUCUGTT SEQ ID No.4 CAGAAUUUGCGAUGUACUUTT SEQ ID No.5 CUGCUAUUGUACGUACCAUTT SEQ ID No.6 GAAGCGUAUGACACAUUGATT SEQ ID No.7 UAGCCAUGAUUACCUAGGATT SEQ ID No.8 UCAUACUCACGCCUCGAAATT SEQ ID No.9 ACUUAAUUGAGCGACUAUATT SEQ ID No.10 GUGUUCCGACGAAUCUCAATT SEQ ID No.11 CUCACACGCCG。

11、ACGUCAACTT SEQ ID No.12 GAUAGAUCGAUUUCCUAUCTT SEQ ID No.13 CUAAACGACUUACUAGGGATT SEQ ID No.14 UUGCGUCGAUAUUCUGGCUTT SEQ ID No.15 CACUUCUACGACUUCUUCATT 0016 2. 不同 siRNA 序列对基因 knockdown 效率的检测 0017 (1) 转染 siRNA ： 0018 步骤1 ： 将骨肉瘤细胞系U-2 OS培养于含10小牛血清的1640培养基中， 转染前 24 小时， 以每孔 4104个细胞接种于 24 孔培养板， 每孔体积 400l，。

12、 使得转染时的细胞密 度达到约 30 -50的汇合度。 0019 步骤 2 ： 对于每种 siRNA， 按如下步骤准备 siRNA-lipo2000 混合液 ： 0020 a) 用 50l 不含血清培养基 Opti-MEM(Invitrogen) 稀释 siRNA， 轻轻混匀， 室温 孵育 5 分钟 ； 0021 b) 用 50l 不含血清培养基 Opti-MEM 稀释 1l lipofectamine 2000 转染试剂 (Invitrogen)， 轻轻混匀， 室温孵育 5 分钟 ； 0022 c) 将 a) 与 b) 的混合物轻混， 室温孵育 20 分钟， 制备得到 siRNA-lipo2。

13、000 混合 液。 0023 步骤 3 ： 将 siRNA-lipo2000 混合液加入已接种骨肉瘤细胞系 U-2OS 的培养板各孔 说 明 书 CN 102895672 A 4 3/9 页 5 中， 使 siRNA 终浓度为 5nM， 轻轻混匀。 0024 每种 siRNA 设 3 个平行孔， 同时， 每块 24 孔板上设置 3 个对照孔。对照孔中除不 加 siRNA 外， 其余成分与实验孔相同。 0025 步骤 4 ： 将培养板置于 37的 CO2培养箱中培养 6 小时后， 弃去孔中培养基， 更换 不含抗生素的新鲜培养基， 继续培养 3 天。 0026 (2) 利用实时定量 PCR 检测基。

14、因 knockdown 效率 0027 a. 细胞总 RNA 的提取 0028 向上述24孔培养板的每一孔加入1ml TRIzol(Invitrogen)试剂， 用移液器吹打， 直至细胞充分溶解， 室温静置 3 分钟， 转移至 1.5ml 没有核酸酶的干净离心管中 ； 0029 每管加入 300l 氯仿 ( 北京化工厂 )， 震荡 15 秒 ； 0030 于 4下以 13000rpm 离心 15 分钟 ； 0031 将上清转移至 1.5ml 没有核酸酶的干净离心管 ； 0032 每管加入等体积的异丙醇 ( 北京化工厂 )， -20沉淀 1 小时以上 ； 0033 于 4下以 13000rpm 。

15、离心 15 分钟 ； 0034 去除上清， 然后用 70乙醇充分洗涤沉淀 ； 0035 于 4下以 13000rpm 离心 10 分钟 ； 0036 去除上清， 室温下晾干至沉淀刚好变成透明 ； 0037 每管加入 10l Nuclease-free 的双蒸水， 混匀， 于室温下溶解 15 分钟， 得总 RNA 溶液 ； 0038 取 1l 上述总 RNA 溶液， 用 Nano-drop 1000(Thermo Scientific) 确定总 RNA 的 浓度和总量。 0039 b. 通过反转录获得 cDNA 0040 针对每种 siRNA 转染所得的总 RNA 样品， 各取 1g 用于反转录。

16、， 并用 DNase I(Fermentas) 消化， 以去除基因组 DNA 的污染 ； 0041 用反转录试剂盒(Reverse Transcription System， Promega)进行反转录， 上述每 种总 RNA 样品分别获得 20l cDNA ； 0042 将上述所得到的 cDNA 分别稀释至 100l。 0043 c. 实时定量 PCR 0044 每个 qRT-PCR 反应取 2l cDNA 作为模板， 使用 Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix(Fermentas)， 根据产品说明在 BioRad CFX96 上进行实时定量 PCR。以。

17、看家基 因 GAPDH 的表达量作为内参， 使用 Ct 的方法计算 siRNA 降低基因表达的效率， 结果见 表 2。 0045 knockdown效率1-转染siRNA的细胞中基因的表达量/未转染siRNA的细胞中 基因的表达量。 0046 表 2 0047 siRNA 目的基因 knockdown 效率 SEQ ID No.1 ANAPC5 71 说 明 书 CN 102895672 A 5 4/9 页 6 SEQ ID No.2 CCNT2 72 SEQ ID No.3 CDCA5 69 SEQ ID No.4 CSNK1A1 65 SEQ ID No.5 CTNNB1 45 SEQ I。

18、D No.6 FAS 53 SEQ ID No.7 FZD6 57 SEQ ID No.8 GLI1 62 SEQ ID No.9 HIP1 66 SEQ ID No.10 MTOR 51 SEQ ID No.11 NOTCH1 39 SEQ ID No.12 RANBP9 34 SEQ ID No.13 RBPJ 70 SEQ ID No.14 RRM2 52 SEQ ID No.15 SMO 58 0048 3. 不同 siRNA 组合对肿瘤细胞存活率的影响 0049 (1) 以人骨肉瘤细胞系 U-2OS(ATCC Number ： HTB-96) 为例。 0050 (2) 利用上述 15。

19、 种 siRNA 设计 8 类含不同数目 siRNA 的组合类型， 每类组合类型 所含 siRNA 的数目分别为 1 个、 3 个、 5 个、 8 个、 10 个、 11 个、 13 个、 15 个， 从中随机挑选 79 种组合方案， 检测其对肿瘤细胞存活率的影响。 0051 (3) 挑选的 79 种组合方案如表 3 所示。 0052 表 3 0053 说 明 书 CN 102895672 A 6 5/9 页 7 说 明 书 CN 102895672 A 7 6/9 页 8 0054 0055 说 明 书 CN 102895672 A 8 7/9 页 9 0056 (4)转染siRNA ： 转。

20、染步骤基本同前， 不同之处在于， 转染前24小时， 以每孔2103 个细胞接种于 96 孔培养板中， 每孔体积 50l。以 25l Opti-MEM 分别稀释各 siRNA 组合 物和lipo2000(0.25l/孔)， 每孔中最终siRNA的总浓度保持一致， 均为75nM。 每种siRNA 组合设 3 个平行孔， 同时， 每块 96 孔板上设置 3 个对照孔， 对照孔中除不加 siRNA 外， 其余 成分与实验孔相同。 转染6小时后换不含抗生素的新鲜培养基， 5天后利用MTT比色法检测 细胞存活率。 0057 (5)MTT比色法 ： 每孔加入MTT溶液(5mg/mL)20l， 继续培养4-6。

21、小时， 终止培养， 弃去孔内培养基， 每孔加入 100l DMSO， 使蓝紫色结晶物充分溶解并混匀。选择 490nm 波 长， 在酶联免疫检测仪上测定各孔的光吸收值。以未转染 siRNA 的细胞为对照， 求出细胞存 活率。结果见表 4。 0058 细胞存活率实验孔吸光度值 / 对照孔吸光度值 0059 表 4 0060 组合序号 细胞存活率 组合序号 细胞存活率 1 0.934 8M1 0.851 2 0.981 8M2 0.872 3 0.715 8M3 1.056 4 0.702 8M4 0.620 5 0.635 8M5 0.954 6 0.670 8M6 0.714 7 0.524 8。

22、M7 0.581 8 1.289 8M8 0.830 9 0.885 10M1 0.806 10 0.898 10M2 0.956 11 1.030 10M3 0.600 12 1.068 10M4 0.968 说 明 书 CN 102895672 A 9 8/9 页 10 13 0.644 10M5 0.988 14 0.855 10M6 0.512 15 0.520 10M7 0.640 3M1 0.480 10M8 0.859 3M2 0.741 10M9 0.766 3M3 0.911 10M10 1.052 3M4 1.007 10M11 0.906 3M5 0.475 10M12 。

23、0.788 3M6 0.500 10M13 1.326 3M7 0.726 10M14 0.472 5M1 0.556 10M15 0.306 5M2 0.857 10M16 0.553 5M3 0.926 10M17 0.418 5M4 0.613 11M1 0.709 5M5 0.842 11M2 0.866 5M6 0.790 11M3 0.622 5M7 0.451 11M4 0.889 5M8 0.888 11M5 0.874 5M9 0.699 11M6 0.720 5M10 0.768 11M7 0.797 5M11 1.126 13M1 0.861 5M12 0.521 13M。

24、2 0.885 5M13 1.080 13M3 1.071 5M14 0.523 13M4 0.854 说 明 书 CN 102895672 A 10 9/9 页 11 5M15 0.468 13M5 0.572 5M16 0.845 13M6 0.451 5M17 0.571 13M7 0.476 15M 0.877 0061 0062 由表 4 可以看出， 在所筛选的 79 种 siRNA 组合方案中， 能最有效抑制细胞存活的 是编号为 10M15 的组合方案， 即由 SEQ ID No.1、 SEQ ID No.2、 SEQ ID No.3、 SEQ ID No.5、 SEQ ID No。

25、.6、 SEQ ID No.7、 SEQ ID No.9、 SEQ ID No.10、 SEQ ID No.11 和 SEQ ID No.13 所示的 siRNA 组成的组合物。 0063 显然， 本领域的技术人员可以在不脱离本发明的构思的范围内对本发明进行各种 修改和变型。这些修改和变型也属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内。 说 明 书 CN 102895672 A 11 1/7 页 12 0001 0002 序 列 表 CN 102895672 A 12 2/7 页 13 0003 序 列 表 CN 102895672 A 13 3/7 页 14 0004 序 列 表 CN 102895672 A 14 4/7 页 15 0005 序 列 表 CN 102895672 A 15 5/7 页 16 0006 序 列 表 CN 102895672 A 16 6/7 页 17 0007 序 列 表 CN 102895672 A 17 7/7 页 18 序 列 表 CN 102895672 A 18 。