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1、(10)申请公布号 CN 102895240 A (43)申请公布日 2013.01.30 CN 102895240 A *CN102895240A* (21)申请号 201210417505.9 (22)申请日 2012.10.26 A61K 31/58(2006.01) A61P 1/16(2006.01) (71)申请人 吴俊华 地址 210009 江苏省南京市鼓楼区汉口路 22 号 (72)发明人 王慧 张广 吴俊华 (74)专利代理机构 江苏银创律师事务所 32242 代理人 何震花 (54) 发明名称 Gypensapogenin A在抑制肝脏成纤维细胞增 殖药物中的应用 (57)。
2、 摘要 本 发 明 公 开 了 GypensapogeninA 在 制 备 治疗肝纤维化药物的用途。药理试验证明， GypensapogeninA 可以明显抑制肝纤维化的发生 和发展， 可用于制备抗肝纤维化、 防治肝硬化的药 物。本发明涉及的 GypensapogeninA 在制备抑制 肝脏成纤维细胞增殖药物中的用途属于首次公 开， 由于骨架类型属于全新的骨架类型， 而且其对 于肝脏成纤维细胞增殖抑制活性强得意想不到， 不存在由其他化合物给出任何启示的可能， 具备 突出的实质性特点， 同时用于抗肝脏成纤维细胞 增殖显然具有显著的进步。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页。
3、 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 1/1 页 2 1.Gypensapogenin A 在抑制肝脏成纤维细胞增殖药物中的应用， 所述化合物 Gypensapogenin A 结构如式 （） 所示 ： 式 （） 。 权 利 要 求 书 CN 102895240 A 2 1/4 页 3 Gypensapogenin A在抑制肝脏成纤维细胞增殖药物中的应 用 技术领域 0001 本发明涉及化合物经药理试验证明可显著抑制肝纤维化的发生和发展， 更具体指 化合物 Gypensapogenin A， 它可在制备抗肝纤维化药物中应用。 背景技术。
4、 0002 肝纤维化是慢性肝损伤向肝硬化发展的动态过程， 表现为细胞外基质 （ECM） 大量 合成、 分泌， 而降解绝对或相对不足， 使ECM在肝脏内弥漫沉积。 其起始于肝细胞 （HC） 坏死， 随之是炎症反应、 纤维生成介质释放， 肝星状细胞 （FSC） 激活， 最终以肝脏结缔组织成分的 合成与降解明显失去平衡。肝纤维化是多种慢性肝病共同的病理过程， 是影响预后的重要 因素。 0003 过去的 20 年间， 肝纤维化的研究取得了长足进展， 证实肝纤维化与一定程度的肝 硬化都是可逆的。近年来陆续出现了一些抗肝纤维化治疗方法， 包括化学药、 生物制剂、 中 药与基因疗法等， 但是理想的临床治疗手。
5、段仍然缺乏 （刘平 . 加强抗肝纤维化作用机制的 研究 . 中华肝病杂志， 2005,8（13） ： 561） 。目前防治肝纤维的关键是针对与肝星状细胞激 活相关的环节， 主要是 ： 减轻肝损伤 ； 抑制星状细胞激活， 减少细胞外基质产生 ； 调节细胞 因子紊乱， 促进活化肝星状细胞凋亡。 0004 本 发 明 涉 及 的 化 合 物 Gypensapogenin A 是 一 个 2012 年 发 表 （Li, N. et al., 2012. Triterpenes possessing an unprecedented skeleton isolated from hydrolyzate 。
6、of total saponins from Gynostemma pentaphyllum. European Journal of Medicinal Chemistry 50, 173178.） 的新骨架化合物， 该化合物拥有全新的骨架类 型， 目前的用途仅仅涉及人肿瘤细胞株的细胞毒活性 （Li, N. et al., 2012. Triterpenes possessing an unprecedented skeleton isolated from hydrolyzate of total saponins from Gynostemma pentaphyllum. Europea。
7、n Journal of Medicinal Chemistry 50, 173178.） ， 对于本发明涉及的Gypensapogenin A在制备抑制肝脏成纤维细胞增殖药 物中的用途属于首次公开， 由于骨架类型属于全新的骨架类型， 而且其对于肝脏成纤维细 胞增殖抑制活性强得意想不到， 不存在由其他化合物给出任何启示的可能， 具备突出的实 质性特点， 同时用于抗肝脏成纤维细胞增殖显然具有显著的进步。 发明内容 0005 化合物 Gypensapogenin A 经药理试验证明其能抗肝纤维化。 0006 本发明 Gypensapogenin A 的结构式如式 （） 所示 ： 0007 说 明 。
8、书 CN 102895240 A 3 2/4 页 4 0008 本发明对 Gypensapogenin A 抑制肝脏成纤维细胞增殖作用进行了药理试验。 0009 成纤维细胞增殖并合成大量细胞外基质 （ECM） ， 是肝纤维化发生的重要环节。 活化 的肝星状细胞 （HSC） 具有成纤维细胞特征， NIH/3T3 细胞是研究药物抗肝纤维化活性常用 的细胞模型。本研究以 NIH/3T3 成纤维细胞为靶细胞， 观察发明药物对其增殖的影响。用 MTT 法检测的抑制细胞增殖的试验结果表明， 本发明药物对 NIH/3T3 的细胞增殖有显著的 抑制活性。 0010 根据药理试验结果证明 Gypensapoge。
9、nin A 具有抗肝纤维化作用。 0011 本发明涉及的 Gypensapogenin A 在制备抑制肝脏成纤维细胞增殖药物中的用途 属于首次公开， 由于骨架类型属于全新的骨架类型， 而且其对于肝脏成纤维细胞增殖抑制 活性强得意想不到， 不存在由其他化合物给出任何启示的可能， 具备突出的实质性特点， 同 时用于抗肝脏成纤维细胞增殖显然具有显著的进步。 具体实施方式 0012 本发明所涉及化合物 Gypensapogenin A 的制备方法参见文献 （Li, N. et al., 2012. Triterpenes possessing an unprecedented skeleton iso。
10、lated from hydrolyzate of total saponins from Gynostemma pentaphyllum. European Journal of Medicinal Chemistry 50, 173178. 和 Wei, J.X. et al., 1982. Two new dammaran sapogenins from leaves of Panax notoginseng. Planta Medica, 45(3): 167-171.） 。 0013 以下通过实施例对本发明作进一步详细的说明， 但本发明的保护范围不受具体实 施例的任何限制， 而是由权。
11、利要求加以限定。 0014 实施例 1 ： 本发明所涉及化合物 Gypensapogenin A 片剂的制备 ： 0015 取20克化合物Gypensapogenin A， 加入制备片剂的常规辅料180克， 混匀， 常规压 说 明 书 CN 102895240 A 4 3/4 页 5 片机制成 1000 片。 0016 实施例 2 ： 本发明所涉及化合物 Gypensapogenin A 胶囊剂的制备 ： 0017 取 20 克化合物 Gypensapogenin A， 加入制备胶囊剂的常规辅料如淀粉 180 克， 混 匀， 装胶囊制成 1000 片。 0018 下面通过药效学实验来进一步说明。
12、其药物活性。 0019 实验例 1 ： 本发明药物对成纤维细胞 NIH/3T3 增殖的抑制作用 0020 一、 实验方法 ： 0021 NIH/3T3 细胞株购自引自 ATCC（American Type Culture Collection） 的中科院 上海细胞所细胞库。 0022 将对数生长期的亚融合的 NIH/3T3 细胞用 0.25% 胰酶消化， 洗涤， 离心后， 用 DMEM 培养液 （含 10%FCS） 制成 1104cell/ml 的细胞悬液， 台盼蓝染色鉴定存活率大于 95%， 按每 孔 100 ul 加入 96 孔板中， 在 37、 5%CO2培养 24h 同步处理后， 弃上。
13、清， 加入含有不同稀释 浓度药物的 DMEM 培养液 （含 10%FCS） 200 ul， 培养 48h， 每孔加入 MTT 溶液孵育 4h。弃去培 养液， 加入150 ulDMSO， 振荡10分钟， 使结晶溶解， 酶标仪490 nm处读取OD值， 结果以OD490 表示。 0023 二、 实验结果 ： 0024 1、 形态学观察 0025 NIH/3T3 在用药前伸展良好， 折光性较弱， 有方向性， 呈放射状， 细胞增殖的速度 快 ； 而加药物 24h 后， 成纤维细胞数目减少， 形状变得不规则， 突起变短， 细胞排列混乱， 细 胞 内代谢产物增多。 0026 MTT 法检测本发明药物对 N。
14、IH/3T3 细胞增殖的抑制作用 0027 表 1 ： MTT 法检测本发明药物对 NIH/3T3 增殖的抑制作用 0028 0029 注 ： *， 与细胞阴性对照 P0.05 ； *， 与细胞阴性对照 P0.01 0030 结果 ： 本发明药物在 10 ug/ml-40 ug/ml 的浓度范围内对成纤维细胞 NIH/3T3 在 10% 小牛血清的刺激下的细胞增殖有显著的抑制作用。表明本发明药物体外对纤维细胞的 增殖有显著抑制作用。 0031 实验例 2 ： 本发明药物对转化生长因子 -1（TGF-1） 诱导的成纤维细胞增殖的 抑制作用 0032 TGF-1是促进细胞增殖和胶原生成的强活性因子。
15、， 在细胞中加入 TGF-110ng/ 说 明 书 CN 102895240 A 5 4/4 页 6 ml 刺激细胞增殖， 在检测药物对 TGF-1 诱导的细胞增殖的抑制作用， 以分析判断本发明 药物的作用机理。 0033 表 2 ： MTT 法检测本发明药物对 TGF 诱导 NIH/3T3 增殖的抑制作用 0034 0035 注 ： *， 与细胞 +TGF 对照 P0.05 ； *， 与细胞 +TGF 对照 P0.01 0036 结果 ： 本发明药物在 10-40ug/ml 两个浓度区间内对成纤维细胞 NIH/3T3 在 TGF-1的诱导下的细胞增殖有显著的抑制作用。表明本发明药物体外对纤维细胞增殖的 抑制作用可能是通过干预 TGF 信号通路实现的。 0037 结论 ： Gypensapogenin A 对成纤维细胞 NIH/3T3 在 10% 小牛血清的刺激下的细胞 增殖有显著的抑制作用 ； Gypensapogenin A 对成纤维细胞 NIH/3T3 在 TGF-1的诱导下的 细胞增殖有显著的抑制作用。Gypensapogenin A 可以用来制备抗肝纤维化药物。 说 明 书 CN 102895240 A 6 。