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1、(10)申请公布号 CN 102917688 A (43)申请公布日 2013.02.06 CN 102917688 A *CN102917688A* (21)申请号 201180028503.4 (22)申请日 2011.06.08 1009676.6 2010.06.10 GB A61K 9/107(2006.01) A61K 47/06(2006.01) A61K 47/22(2006.01) A61K 9/00(2006.01) A61K 39/00(2006.01) (71)申请人 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 地址 比利时里克森萨特 (72)发明人 V. 德库佩雷 V. 曼库索 。

2、(74)专利代理机构 中国专利代理(香港)有限公 司 72001 代理人 刘健 万雪松 (54) 发明名称 新方法 (57) 摘要 本发明提供了用于生产亚微米水包油乳液的 方法， 所述方法包括下述步骤 ： a. 制备亚微米水 包油乳液 ； b. 通过无菌级过滤器， 预过滤所述水 包油乳液 ； c.通过与步骤b)的过滤器分离的无菌 级过滤器， 过滤根据步骤 b) 滤过的水包油乳液。 (30)优先权数据 (85)PCT申请进入国家阶段日 2012.12.10 (86)PCT申请的申请数据 PCT/EP2011/059489 2011.06.08 (87)PCT申请的公布数据 WO2011/1544。

3、44 EN 2011.12.15 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 5 页 1/2 页 2 1. 一种用于生产亚微米水包油乳液的方法， 所述方法包括下述步骤 ： a. 制备亚微米水包油乳液 ； b. 通过无菌级过滤器， 预过滤所述水包油乳液 ； c. 通过与步骤 b) 的过滤器分离的无菌级过滤器， 过滤根据步骤 b) 滤过的水包油乳 液。 2. 如权利要求 1 所述的方法， 所述方法包括步骤 ： a. 制备亚微米水包油乳液 ； b. 通过无菌级过滤器， 预过滤所述水包油乳液 ； c。

4、. 通过与步骤 b) 的过滤器分离的过滤器， 过滤根据步骤 b) 预滤过的水包油乳液 ； 和 d. 通过与步骤 b) 或 c) 的过滤器分离的过滤器， 过滤根据步骤 c) 滤过的水包油乳液。 3. 根据权利要求 2 所述的方法， 所述方法包括步骤 ； a. 制备亚微米水包油乳液 ； b. 预过滤所述水包油乳液 ； c. 通过无菌级过滤器， 过滤根据步骤 b) 预滤过的水包油乳液 ； d. 通过与步骤 b) 或步骤 c) 的过滤器分离的过滤器， 过滤根据步骤 c) 滤过的水包油 乳液 ； e. 通过与步骤 b)、 c) 和 / 或 d) 的过滤器分离的无菌级过滤器， 过滤根据步骤 d) 滤过 的。

5、水包油乳液。 4. 根据任一项前述权利要求所述的方法， 其中一个或多个过滤器膜包含聚醚砜， 例如 亲水性聚醚砜。 5. 根据权利要求 1-4 中任一项所述的方法， 其中所述无菌级过滤器具有约 0.2m、 例 如 0.22m 的孔径。 6. 根据权利要求 2、 4 或 5 中任一项所述的方法， 其中在步骤 c) 中使用的过滤器具有 下述孔径 ： 无菌级至约 2m， 例如约 2m、 约 1.5m、 约 1m、 约 0.9m、 约 0.8m、 约 0.9m、 约 0.7m、 约 0.6m、 约 0.5m、 0.45m 或无菌级， 例如约 0.2m， 例如 0.22m。 7. 根据权利要求 3-5 中。

6、任一项所述的方法， 其中在步骤 b) 和 / 或步骤 d) 中使用的过 滤器可具有下述孔径 ： 无菌级过滤器 ( 约 0.2m) 至约 2m， 尤其是无菌级过滤器至约 1m， 例如， 约 2m、 约 2.5m、 约 1m、 约 0.9m、 约 0.8m、 约 0.9m、 约 0.7m、 约 0.6m、 约 0.5m、 0.45m 或无菌级， 例如约 0.2m， 例如 0.22m。 8. 根据任一项前述权利要求所述的方法， 其中每个过滤器的分压是约 1 至约 1.5 巴， 例如约 1 巴。 9. 根据任一项前述权利要求所述的方法， 其中在 15至 30、 16至 29、 17至 28、 16至 。

7、27、 16至 28、 或约 22 4进行过滤。 10. 根据任一项前述权利要求所述的方法， 其中所述水包油乳液包含 2% 至 15% (v/v) 的油。 11. 根据权利要求所述的方法， 其中所述亚微米水包油乳液包含4%至6% (v/v)的油。 12. 根据任一项前述权利要求所述的方法， 其中所述水包油乳液包含 8-12% (v/v) 的 油。 13. 根据任一项前述权利要求所述的方法， 其中所述亚微米水包油乳液包含角鲨烯和 权 利 要 求 书 CN 102917688 A 2 2/2 页 3 一种或多种表面活性剂。 14. 根据权利要求中任一项所述的方法， 其中所述亚微米水包油乳液包含角鲨。

8、烯、 母 育酚和表面活性剂。 15. 根据权利要求 14 所述的方法， 其中所述母育酚是 - 生育酚。 16. 根据权利要求 13-15 中任一项所述的方法， 其中所述表面活性剂是聚氧乙烯脱水 山梨糖醇单油酸酯 ( 吐温 80/ 聚山梨酯 80)。 17. 根据权利要求 16 所述的方法， 其中所述亚微米水包油乳液包含角鲨烯、 聚氧乙烯 脱水山梨糖醇单油酸酯 ( 吐温 80) 和脱水山梨糖醇三油酸酯 ( 司盘 85)。 18. 根据权利要求 13 所述的方法， 其中所述亚微米水包油乳液包含角鲨烯、 聚氧乙烯 烷基醚亲水性非离子表面活性剂和疏水性非离子表面活性剂。 权 利 要 求 书 CN 10。

9、2917688 A 3 1/5 页 4 新方法 技术领域 0001 本发明涉及改进的用于生产亚微米水包油乳液的方法， 具体地， 涉及亚微米水包 油乳液的过滤。 背景技术 0002 生 产 方 法 公 开 在 ： Ott 等 人 , 2000 (The Adjuvant MF59: A 10-year Perspective. Vaccine Adjuvants: Preparation methods and Research Protocols Methods in Molecular medicine, 第42卷, 第12章, 第211-228页, Ott等人, 1995 (MF59Des。

10、ign and Evaluation of a Safe and Potent Adjuvant for Human Vaccines: Vaccine Design, the Subunit and Adjuvant Approach Pharmaceutical Biotechnology 第 6 卷 Powell 和 Newman 编， WO06/100110A1，以 及 Lidgate 等 人 , 1992 (Sterile Filtration of a Parenteral Emulsion. Pharmaceuticals Research 9(7): 860-863)。 000。

11、3 水包油乳液可以作为佐剂用于疫苗 / 免疫原性组合物中。由于这些乳液被施用给 人类， 所述乳液必须是无菌的。 用作佐剂的水包油乳液是亚微米乳液， 且油微滴足够小以穿 过 0.2m 过滤器进行无菌过滤。本发明的一个目的是， 提供一种用于生产亚微米水包油乳 液的方法， 尤其是水包油乳液的过滤。 发明内容 0004 本发明涉及一种用于生产亚微米水包油乳液的方法， 尤其是亚微米水包油乳液的 过滤。 0005 本发明提供了用于生产亚微米水包油乳液的方法， 所述方法包括下述步骤 ： a. 制备亚微米水包油乳液 ； b. 通过无菌级过滤器， 预过滤所述水包油乳液 ； c. 通过与步骤 b) 的过滤器分离的。

12、无菌级过滤器， 过滤根据步骤 b) 滤过的水包油乳 液。 具体实施方式 0006 水包油乳液， 尤其是亚微米水包油乳液， 可以用作免疫学佐剂。 肠胃外地施用包含 与抗原 （诸如流感抗原） 相组合的所述水包油乳液的疫苗组合物， 因而， 所述水包油乳液必 须是无菌的。 本发明人已经证实， 为了生产无菌的亚微米水包油乳液， 通过单个无菌级过滤 器过滤乳液是不够的。 本发明人已经证实， 为了提供无菌的水包油乳液， 在用无菌级过滤器 过滤之前， 必须预过滤水包油乳液。 0007 因此， 本发明提供了一种用于生产亚微米水包油乳液的方法， 所述方法包括下述 步骤 ： a. 制备亚微米水包油乳液 ； b. 通。

13、过无菌级过滤器， 预过滤所述水包油乳液 ； 说 明 书 CN 102917688 A 4 2/5 页 5 c. 通过与步骤 b) 的过滤器分离的无菌级过滤器， 过滤根据步骤 b) 滤过的水包油乳 液。 0008 在本发明的另一个实施方案中， 提供了一种用于生产亚微米水包油乳液的方法， 所述方法包括下述步骤 ： a. 制备亚微米水包油乳液 ； b. 通过无菌级过滤器， 预过滤所述水包油乳液 ； c. 通过与步骤 b) 的过滤器分离的过滤器， 过滤根据步骤 b) 预滤过的水包油乳液 ； 和 d. 通过与步骤 b) 或 c) 的过滤器分离的无菌级过滤器， 过滤根据步骤 c) 滤过的水包 油乳液。 0。

14、009 在该具体实施方案中， 在步骤 c) 中使用的过滤器可以具有这样的孔 ： 所述孔的大 小范围是从无菌级过滤器的孔径 ( 即约 0.2m) 至约 2m 的孔径。具体地， 在上述实施方案 中在步骤 c) 中使用的过滤器的孔径范围是从无菌级过滤器的孔径至约 1m 的大小。例如， 在步骤 b) 中使用的过滤器的孔径是约 2m、 约 2.5m、 约 1m、 约 0.9m、 约 0.8m、 约 0.9m、 约 0.7m、 约 0.6m、 约 0.5m、 0.45m 或无菌级， 例如约 0.2m， 例如 0.22m。 0010 亚微米水包油乳液是这样的水包油乳液 ： 其中平均微滴尺寸小于 1m。测量微。

15、滴 尺寸的方法是技术人员众所周知的， 例如动态光散射。通过本领域技术人员已知的方法， 例如但不限于高压匀浆化， 例如使用微射流机， 可以生产亚微米水包油乳液。在本发明的 一个具体实施方案中， 亚微米水包油乳液具有小于约 220nm (0.2m)、 尤其是约 120nm 至约 180nm 的平均油微滴尺寸。 0011 “无菌级过滤器” 是指， 在大于或等于 1x107/cm2有效过滤面积的挑战水平， 用微生 物挑战以后， 产生无菌流出液的过滤器。无菌级过滤器是本发明领域的技术人员众所周知 的， 且具有约 0.2m 的孔径， 因而包括具有约 0.22m 孔径的过滤器。 0012 所述过滤器的膜可以。

16、由技术人员已知的任意合适的材料制成， 例如， 但不限于 ： 醋 酸纤维素、 聚醚砜 (PES)、 聚偏氟乙烯 (PVDF)、 聚四氟乙烯 (PTFE)。在本发明的一个具体实 施方案中， 一个或多个或所有本发明的过滤器膜包含聚醚砜， 例如亲水性聚醚砜。 0013 在本发明的另一个实施方案中， 提供了如本文所述的方法， 所述方法包括步骤 ； a. 制备亚微米水包油乳液 ； b. 预过滤所述水包油乳液 ； c. 通过无菌级过滤器， 过滤根据步骤 b) 预滤过的水包油乳液 ； d. 通过与步骤 b) 或步骤 c) 的过滤器分离的过滤器， 过滤根据步骤 c) 滤过的水包油 乳液 ； e. 通过与步骤 b。

17、)、 c) 和 / 或 d) 的过滤器分离的无菌级过滤器， 过滤根据步骤 d) 滤过 的水包油乳液。 0014 在该具体实施方案中， 在步骤 b) 和 / 或步骤 d) 中使用的过滤器可以具有这样的 孔 ： 所述孔的大小范围是从无菌级过滤器 ( 约 0.2m) 至约 2m， 尤其是无菌级过滤器至约 1m。例如， 在步骤 b) 和 / 或步骤 d) 中使用的过滤器的孔径是约 2m、 约 2.5m、 约 1m、 约 0.9m、 约0.8m、 约0.9m、 约0.7m、 约0.6m、 约0.5m、 0.45m或无菌级， 例如约0.2m， 例 如 0.22m。在步骤 b) 和 d) 中使用的过滤器可以。

18、具有彼此相同的孔隙率， 或具有彼此不同 的孔径。 说 明 书 CN 102917688 A 5 3/5 页 6 0015 在本发明的一个具体实施方案中， 提供了本发明的方法， 其中每个过滤器的分压 是约 1 至约 1.5 巴， 例如约 1 巴。 0016 在另一个实施方案中， 提供了本发明的方法， 其中在约 15至约 30、 约 16至 约 29、 约 17至约 28、 约 16至约 27、 约 16至约 28、 或 22 4的温度进行 过滤。 0017 在本发明的一个实施方案中， 所述亚微米水包油乳液包含约 2% 至约 15%、 约 4% 至 约 12% 的油、 约 5% 至约 10%、 约。

19、 4% 至约 6%、 约 8% 至约 12%、 例如约 5% 或 10% (v/v) 的油。 0018 为了使任意水包油组合物适合对人施用， 所述油相必须包含可代谢的油 ( 即可生 物降解的 )。所述油可以是任意植物油、 鱼油、 动物油或合成油， 其对受体无毒， 且能够通过 代谢进行转化。坚果、 种子和谷物是植物油的常见来源。合成油也是合适的。因此， 本发明 的水包油乳液包含可代谢的油， 在一个具体实施方案中， 本发明的水包油乳液包含角鲨烯 ( 例如约 4% 至 6% v/v)。 0019 本发明的水包油乳液还可以包含母育酚。母育酚是本领域众所周知的， 且描述在 EP0382271中。 具体地。

20、， 所述母育酚是-生育酚或其衍生物， 诸如-生育酚琥珀酸盐(也 称作维生素 E 琥珀酸盐 )。 0020 在本发明的一个具体实施方案中， 提供了包含角鲨烯(例如约5% v/v)和-生 育酚 ( 例如约 5% v/v) 的本发明的水包油乳液。 0021 本发明的水包油乳液包含一种或多种表面活性剂。 合适的表面活性剂是技术人员 众所周知的， 包括但不限于 ： 聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯(吐温80、 聚山梨酯80)、 脱水 山梨糖醇三油酸酯 ( 司盘 85)、 磷脂酰胆碱 ( 卵磷脂 )、 聚氧乙烯 (12) 鲸蜡硬脂酰醚和辛苯 昔醇-9 (TRITON X-100)。 在本发明的一个具体实施方案。

21、中， 水包油乳液包含聚氧乙烯脱水 山梨糖醇单油酸酯 ( 吐温 80、 聚山梨酯 80)。在另一个实施方案中， 本发明的水包油乳液包 含聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯 ( 吐温 80) 和其它表面活性剂， 尤其是脱水山梨糖醇三 油酸酯 ( 司盘 85)。 0022 在本发明的一个具体实施方案中， 所述水包油乳液包含可代谢的油 ( 例如角鲨 烯 )、 母育酚 ( 例如 - 生育酚 ) 和表面活性剂 ( 例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯 吐 温 80、 聚山梨酯 80)。 0023 在本发明的另一个实施方案中， 本发明的水包油乳液包含可代谢的油 ( 例如角鲨 烯 )、 表面活性剂 ( 例如聚氧乙烯脱水。

22、山梨糖醇单油酸酯 聚山梨酯 80) 和任选的第二种 表面活性剂 ( 例如脱水山梨糖醇三油酸酯 司盘 85)。 0024 在本发明的另一个实施方案中， 本发明的水包油乳液包含可代谢的油 ( 例如角鲨 烯 )、 聚氧乙烯烷基醚亲水性非离子表面活性剂 ( 例如聚氧乙烯 (12) 鲸蜡硬脂酰醚 ) 和疏 水性非离子表面活性剂 ( 例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯 ( 聚山梨酯 80) 或脱水 山梨糖醇三油酸酯 司盘 85)。 0025 在本文中与本发明的 “疫苗组合物” 有关的实施方案也适用于与本发明的 “免疫原 性组合物” 有关的实施方案， 反之亦然。 0026 在每种情况下， 发明人在本文中意图任。

23、选地用术语 “由组成” 、“由构成” 分别替代术语 “包含” 、“包括” 。 0027 与数字值x有关的术语 “约” 是指x5% 或 10%。 说 明 书 CN 102917688 A 6 4/5 页 7 实施例 0028 方法 乳化方法 通过混合注射用水、 磷酸盐缓冲盐水和吐温， 在罐 2 中制备水相。通过混合生育酚和角 鲨烯， 在罐 1 中制备油相。搅拌两相， 直到得到均质。用氮冲洗整个装置， 以避免生育酚氧 化。 0029 用膜泵给高压匀浆器供料。以需要的流量比， 一起进料两相。使两相第 1 次穿过 高剪切匀浆器， 在这里得到粗乳液。 然后， 与高剪切匀浆器连通地， 产物进入高压匀浆器，。

24、 在 这里得到细乳液。 0030 在混合装置的出口处， 将产物收获在罐 3 中 ( 第 1 次穿过 )。当罐 2 和 1 空时， 将 来自罐 3 的乳液导向混合装置的入口， 进行第 2 次穿过。在第 2 次穿过结束时， 将产物收获 在罐 2 中。当罐 3 空时， 将来自罐 2 的乳液导向混合装置的入口， 进行第 3 次穿过。将乳液 收获在罐 3 中， 并在过滤以前在氮下保藏。 0031 过滤方法 在 1 巴最大压力， 在 18-26之间的温度， 在包含组合的 0.5/0.2m 膜的 2 个除菌过滤 器上进行过滤， 持续最大3小时的接触时间。 为了证实过滤方法的效率， 必须以107 CFU/cm。

25、 膜的浓度， 用悬浮在乳液中的缺陷短波单胞菌 （B. diminuta） 挑战所述过滤器膜。为了找 到最佳构造， 测试了几种装置。 0032 在第一种装置中， 以 107 CFU /cm 膜的浓度， 给所述产品接种缺陷短波单胞菌细 菌， 并在 1 巴最大压力， 在 18-26之间的温度， 在 2 个 0.5/0.2m 过滤器上进行过滤。接种 的产品和过滤器之间的接触时间最大为 3 小时。 0033 或者， 首先在 0.5m 平膜上预滤所述产品。然后以 107 CFU /cm 膜的浓度， 给所 述产品接种缺陷短波单胞菌细菌， 并在 1 巴最大压力， 在 18-26之间的温度， 在 0.2m 或 。

26、0.5/0.2m或0.2/0.2m平膜上进行过滤。 接种的产品和过滤器之间的接触时间最大为1.5 小时。 0034 最后， 首先在含有 0.5 和 0.2m 过滤器的封装体 （capsule） 上预滤所述产品。然 后以 107 CFU /cm 膜的浓度， 给所述产品接种缺陷短波单胞菌细菌， 并在 1 巴最大压力， 在 18-26之间的温度， 在 0.2m 封装体上进行过滤。接种的产品和过滤器之间的接触时间最 大为 3 小时。 0035 在所有情况下， 在最后一个除菌膜之后收获滤液， 并在 0.45m 收集过滤器上过滤 整个体积， 以便鉴别缺陷短波单胞菌的存在。将 0.45m 过滤器铺在 TSA。

27、 板上， 并在 30温 育 7 天。然后在第 2、 3、 4 和 7 天目检该板。如果观察到菌落， 对它们计数并鉴别。 0036 结果 在没有预滤或使用 0.5m 预滤的情况下， 在堵塞之前穿过过滤器的体积小于达到 19.14 ml/cm（满足 107 CFU/cm 的 BCT 要求所需） 的目标保留体积所需的最小保留体积。 当使用含有 0.5/0.2 膜的封装体作为预滤器进行预滤时， 保留体积增加至最多 19.4 ml/ cm， 且根本没有观察到传代 （passage） 。 说 明 书 CN 102917688 A 7 5/5 页 8 (1) 为了满足 BCT 条件 (107 CFU/cm)， 保留体积必须高于 19.14 ml/cm。 0037 结论 这些结果证实， 就乳液而言， 进行包含至少一个 0.2m 过滤器的预滤， 会提高除菌过滤 器的能力， 且是证实得到无菌流出液的必要条件。 说 明 书 CN 102917688 A 8 。