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1、(10)申请公布号 CN 102791254 A (43)申请公布日 2012.11.21 CN 102791254 A *CN102791254A* (21)申请号 201080058889.9 (22)申请日 2010.12.21 61/289,132 2009.12.22 US A61K 9/06(2006.01) A61K 47/30(2006.01) A61K 47/48(2006.01) (71)申请人 成功大学 地址 中国台湾台南市 申请人 卓医生技公司 (72)发明人 黄玲惠 (74)专利代理机构 北京科龙寰宇知识产权代理 有限责任公司 11139 代理人 孙皓晨 费碧华 (5。
2、4) 发明名称 含胶原蛋白与透明质酸的细胞组织胶体 (57) 摘要 本发明是关于一种含胶原蛋白与透明质酸的 细胞组织胶体， 其中胶原蛋白与透明质酸的重量 比介于 0.01 比 1 与 100 比 1 之间。 (30)优先权数据 (85)PCT申请进入国家阶段日 2012.06.21 (86)PCT申请的申请数据 PCT/US2010/061496 2010.12.21 (87)PCT申请的公布数据 WO2011/087779 EN 2011.07.21 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 7 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说。
3、明书 7 页 1/2 页 2 1. 一种细胞组织胶体， 其包含有胶原蛋白与透明质酸， 且是以整体重量为基础， 该胶原 蛋白与该透明质酸的比例介于 0.01 比 1 与 100 比 1 之间。 2. 如权利要求 1 所述的细胞组织胶体， 其中该透明质酸的浓度为 0.001mg/ml 至 100mg/ml。 3. 如权利要求 2 所述的细胞组织胶体， 其中该透明质酸的浓度为 0.01mg/ml 至 40mg/ ml。 4. 如权利要求 1 所述的细胞组织胶体， 其中该胶原蛋白的浓度为 0.001mg/ml 至 100mg/ml。 5. 如权利要求 1 所述的细胞组织胶体， 其中该胶原蛋白的浓度为 。
4、0.1mg/ml 至 100mg/ ml 以及该透明质酸的浓度为 0.01mg/ml 至 35mg/ml。 6.如权利要求5所述的细胞组织胶体， 其中该胶原蛋白的浓度为3mg/ml至40mg/ml以 及该透明质酸的浓度为 0.2mg/ml 至 20mg/ml。 7. 如权利要求 1 所述的细胞组织胶体， 其进一步包含有营养素以及生物活性剂。 8. 如权利要求 7 所述的细胞组织胶体， 其中该营养素为细胞培养基。 9. 如权利要求 7 所述的细胞组织胶体， 其中该生物活性剂选自于下列生长因子 ： 上皮 生长因子、 纤维母细胞生长因子、 血管内皮生长因子、 结缔组织生长因子、 血小板衍生性生 长因。
5、子、 类胰岛素生长因子、 神经生长因子、 肝细胞生长因子、 细胞聚落刺激因子、 干细胞因 子、 角质细胞生长因子、 颗粒球细胞聚落刺激因子、 颗粒球巨噬细胞聚落刺激因子、 胶质衍 生神经营养因子、 睫状神经营养因子、 内皮单核细胞活化多胜肽、 上皮中性粒细胞活化胜 肽、 红血球生成素、 骨形成蛋白、 大脑衍生神经营养因子、 BRAK、 转化生长因子、 肿瘤坏死因 子及其混合物所构成的群组。 10. 如权利要求 7 所述的细胞组织胶体， 其进一步包含有干细胞。 11. 如权利要求 1 所述的细胞组织胶体， 其进一步包含有一种或多种选自于下列的基 质要素所构成的群组 ： 明胶、 纤维连接蛋白、 弹。
6、性蛋白、 细胞黏合素 (tenacin)、 层黏蛋白、 玻璃连接蛋白、 多胜肽、 硫酸肝素、 软骨素、 硫酸软骨素、 角质素、 硫酸角质素、 硫酸皮肤素、 鹿角菜胶、 肝素、 几丁质、 几丁聚糖、 褐藻胶、 琼脂糖、 琼脂、 纤维素、 甲基纤维素、 羧甲基纤维 素以及肝醣。 12. 如权利要求 6 所述的细胞组织胶体， 其进一步包含有营养素以及生物活性剂。 13. 如权利要求 12 所述的细胞组织胶体， 其中该营养素为细胞培养基。 14. 如权利要求 12 所述的细胞组织胶体， 其中该生物活性剂选自于下列生长因子 ： 上 皮生长因子、 纤维母细胞生长因子、 血管内皮生长因子、 结缔组织生长因子。
7、、 血小板衍生性 生长因子、 类胰岛素生长因子、 神经生长因子、 肝细胞生长因子、 细胞聚落刺激因子、 干细胞 因子、 角质细胞生长因子、 颗粒球细胞聚落刺激因子、 颗粒球巨噬细胞聚落刺激因子、 胶质 衍生神经营养因子、 睫状神经营养因子、 内皮单核细胞活化多胜肽、 上皮中性粒细胞活化胜 肽、 红血球生成素、 骨形成蛋白、 大脑衍生神经营养因子、 BRAK、 转化生长因子、 肿瘤坏死因 子及其混合物所构成的群组。 15. 如权利要求 12 所述的细胞组织胶体， 其进一步包含有干细胞。 16. 如权利要求 6 所述的细胞组织胶体， 其进一步包含有一种或多种选自于下列基质 要素 ： 明胶、 纤维连。
8、接蛋白、 弹性蛋白、 细胞黏合素 (tenacin)、 层黏蛋白、 玻璃连接蛋白、 多 权 利 要 求 书 CN 102791254 A 2 2/2 页 3 胜肽、 硫酸肝素、 软骨素、 硫酸软骨素、 角质素、 硫酸角质素、 硫酸皮肤素、 鹿角菜胶、 肝素、 几 丁质、 几丁聚糖、 褐藻胶、 琼脂糖、 琼脂、 纤维素、 甲基纤维素、 羧甲基纤维素以及肝醣所构成 的群组。 17. 如权利要求 16 所述的细胞组织胶体， 其中明胶的浓度为 0.01mg/ml 至 10mg/ml， 胶 原蛋白的浓度为 6mg/ml 至 40mg/ml， 以及透明质酸的浓度 0.2mg/ml 至 20mg/ml。 1。
9、8. 如权利要求 17 所述的细胞组织胶体， 其中该明胶的浓度为 1mg/ml。 19. 一种输送干细胞于受体的方法， 其包含 提供一细胞植入体， 其包含如权利要求 1 所述的细胞组织胶体， 且干细胞系生长于该 细胞组织胶体中 ； 以及 将该细胞植入体置于受体内的某一位置。 权 利 要 求 书 CN 102791254 A 3 1/7 页 4 含胶原蛋白与透明质酸的细胞组织胶体 0001 交叉参考相关申请案 0002 本申请案主张于 2009 年 12 月 22 日提出申请的美国临时专利申请案第 61/289,132 号的优先权， 所述专利申请案的说明书以引用的方式全文并入本文中。 技术领域 。
10、0003 本发明是关于一种含胶原蛋白与透明质酸的细胞组织胶体。 背景技术 0004 将干细胞疗法用于治疗退化性疾病被视为是一种相当有希望的方法。然而， 欲将 干细胞保留在受术病患(recipient)体内的植入位置(implantation site)并且维持其存 活度以实现组织修复仍具有一定的挑战性。因此， 研发一种能够促使干细胞伴随着高存活 度地移植于特定位置的一种介质(例如细胞组织胶体)是目前相关产学界亟需达到的重要 目标之一。 发明内容 0005 本发明是基于下列不可预期的发现 ： 当干细胞生长于一种含有特定重量比例的胶 原蛋白与透明质酸(又名玻尿酸)的混合物、 细胞培养基以及选择性地。
11、加入明胶(gelatin) 的细胞组织胶体中时， 则干细胞能够表现出更佳的存活力。 0006 因此， 本发明提供一种含有胶原蛋白与透明质酸的细胞组织胶体， 其中以整体重 量为基础， 该胶原蛋白与该透明质酸的比例介于 0.01 比 1 与 100 比 1 之间 ； 该透明质酸的 浓度可为0.001mg/ml至100mg/ml(例如 ： 0.01mg/ml至1mg/ml)， 而该胶原蛋白的浓度可为 0.1mg/ml 至 100mg/ml， 该透明质酸的浓度为 0.01mg/ml 至 35mg/ml ； 更佳的是， 该胶原蛋白 的浓度介于3mg/ml至40mg/ml(诸如6mg/ml或9mg/ml)。
12、， 该透明质酸的浓度为0.2mg/ml至 20mg/ml。 0007 本发明的细胞组织胶体可进一步包含有可供细胞生长的营养素 ( 例如一细 胞培养基 )、 生物活性剂、 一个或多个基质要素以及 / 或干细胞。该生物活性剂可为 一生长因子， 例如上皮生长因子 (epidermal growth factor)、 纤维母细胞生长因子 (broblast growth factor,FGF)、 血管内皮生长因子 (vascular endothelial growth factor,VEGF)、 结缔组织生长因子 (connective tissue growth fcator)、 血小板衍生性 生。
13、长因子 (platelet-derived growth factor,PDGF)、 类胰岛素生长因子 (insulin-like growth factor)、 神经生长因子 (nerve growth factor)、 肝细胞生长因子 (hepatocyte growth factor,HGF)、 细胞聚落刺激因子 (colony-stimulating factor)、 干细胞因子 (stem call factor)、 角质细胞生长因子 (keratinocyte growth factor)、 颗粒球细胞 聚落刺激因子 (granulocyte colony-stimulating 。
14、factor)、 颗粒球巨噬细胞聚落刺激 因子 (granulocyte macrophage colony-stimulating factor)、 胶质衍生神经营养因 子 (glial-derived neurotropic factor)、 睫状神经营养因子 (ciliary neurotrophic 说 明 书 CN 102791254 A 4 2/7 页 5 factor)、 内皮单核细胞活化多胜肽 (endothelial-monocyte activating polypeptide)、 上皮中性粒细胞活化胜肽 (epithelial neutrophil activating 。
15、peptide)、 红血球生成 素 (erythropoietin)、 骨形成蛋白 (bone morphogenetic protein)、 大脑衍生神经营养 因子 (brain-derived neurotrophic factor)、 BRAK、 转化生长因子 -(transforming growth factor beta) 及肿瘤坏死因子 (tumor necrosis factor)。可使用的基质要 素包括， 但不限于 ： 明胶 (gelatin)、 纤维连接蛋白 (bronectin)、 弹性蛋白 (elastin)、 细胞黏合素 (tenacin)、 层黏蛋白 (lamini。
16、n)、 玻璃连接蛋白 (vitronectin)、 多胜肽 (polypeptides)、 硫 酸 肝 素 (heparan sulfate)、 软 骨 素 (chondroitin)、 硫 酸 软 骨 素 (chondroitin sulfate)、 角质素 (keratin)、 硫酸角质素 (keratin sulfate)、 硫酸皮肤素 (dermatan sulfate)、 鹿角菜胶 (carrageenan)、 肝素 (heparin)、 几丁质 (chitin)、 几丁聚 糖 (chitosan)、 褐藻胶 (alginate)、 琼脂糖 (agarose)、 琼脂 (agar)、。
17、 纤维素 (cellulose)、 甲基纤维素 (methyl cellulose)、 羧甲基纤维素 (carboxyl methyl cellulose) 以及肝醣 (glycogen)。当该细胞组织胶体含有明胶时， 明胶的浓度可介于 0.01mg/ml 至 100mg/ml 之 间(诸如1mg/ml)。 较佳的， 该胶原蛋白以及该透明质酸于该含有明胶的细胞组织胶体中的 浓度分别介于 6mg/ml 至 40mg/ml 之间以及 0.2mg/ml 至 20mg/ml 之间。 0008 本发明亦提供一种输送细胞 ( 例如干细胞 ) 于受体的方法， 其包含有提供一含有 上述该细胞组织胶体的细胞植入。
18、体， 且细胞生长于该细胞组织胶体中 ； 将该细胞植入体置 于受体内的某一位置。 使用该细胞组织胶体制备一种用于细胞输送的细胞植入体的方法也 属于本发明的范畴。 具体实施方式 0009 下文特举本发明一些实施例作详细说明如后。 本发明的其他目的或特征将呈现于 后述实施例以及随附的权利要求书中。 0010 在此所述为一种含有胶原蛋白与透明质酸的细胞组织胶体， 该胶原蛋白与该透明 质酸的重量比例介于0.01比1与100比1之间， 并且可选择性地包括一个或多个其他成分， 诸如基质要素、 生物活性剂以及可供细胞生长的营养素。 0011 胶原蛋白 0012 任何自然产生的胶原蛋白或是其他具有功能性的胶原蛋。
19、白的变异体均可被用来 制备本发明的组织胶体。目前已经发现至少有 28 种带有不同遗传讯息的胶原蛋白。胶 原蛋白容易从富含胶原蛋白的组织中单独分离或纯化出来， 富含胶原蛋白的组织有诸如 皮肤、 肌腱、 韧带以及人类或动物的骨头。分离及纯化胶原蛋白的方法为本领域技术人 员皆可得知的方法， 可参见所附的文献 ： US 第 5,512,291 号专利、 US 第 2004/0138695 号 专利、 Methods in Enzymology,vol.82,pp.33-64,1982、 The Preparation of Highly purified Insoluble Collagen,Ones。
20、on,I.,et al.,Am.Leather Chemists Assoc.,Vol. LXV,pp.440-450,1970、 US 第 6,090,996 号专利。胶原蛋白也可通过重组技术制备而成， 此 类重组技术可见于一般文献(诸如Advanced Tissue Sciences(La Jolla,Calif.)， 或者自 商业渠道购得 ( 例如 Fibergen 或 South San Francisco,Calif.)。 0013 以下利用一实例进行阐述。将小牛的深屈肌腱移除脂肪与筋膜 (fascia) 后， 将其 以水清洗并冷冻， 而后切成复数个厚度均为 0.5 毫米的肌腱薄片。。
21、取适量的肌腱薄片置入 说 明 书 CN 102791254 A 5 3/7 页 6 50 毫升的水中， 于室温下进行第一次萃取， 所需时间为 24 小时， 其中水溶性的部份会被去 除， 而后该等肌腱薄片置入一酸性溶液 ( 例如 0.2N 氢氯酸溶液 ) 中， 于一适当温度下 ( 例 如室温下 ) 进行萃取一段时间 ( 例如 12 小时至 24 小时 ) ； 随后将酸性溶液除去， 并以水冲 洗该等肌腱薄片洗去残留的酸 ； 经冲洗后的肌腱薄片再置入一碱性溶液中 ( 例如 0.75M 氢 氧化钠溶液 ) 于一适当温度下 ( 例如室温下 ) 一段时间 ( 例如 12 小时至 24 小时 ) ； 将碱性。
22、 溶液去除后， 该等肌腱薄片以一酸性溶液 ( 例如 0.1N 氢氯酸溶液 ) 调整 pH 值为 4 至 7( 例 如 pH 值为 5)， 再重复以水清洗该等肌腱薄片直至残留的碱完全去除 ； 该等肌腱薄片以醇类 溶剂(例如异丙醇)进行脱脂一段时间(例如16小时)， 轻轻将萃取剂倒出， 然后再以醇类 溶剂 ( 例如异丙醇 ) 于适当温度下 ( 例如室温下 ) 进一步进行萃取一段时间 ( 例如 12 小 时至 24 小时 )， 以形成一含胶原蛋白的溶液， 该含胶原蛋白的溶液置于一干净的无菌操作 台中风干而形成胶原蛋白粉末。 该胶原蛋白粉末可分散于一酸性溶液(例如0.5M或0.25M 醋酸水溶液 ) 。
23、中形成一混合物， 且存在有一蛋白质水解酶 ( 例如胰蛋白酶或胃蛋白酶 )， 于 4下培养一段时间 ； 所述的混合物经由 100 目的不锈钢筛网过滤后， 呈溶解状态的胶原蛋 白则于 5% 氯化钠溶液形成沉淀 ； 胶原蛋白沉淀物可再度溶解于前述的酸性溶液中而形成 胶原蛋白溶液， 并且经由 100 目的不锈钢筛网过滤以去除其中的不溶物。而后将该胶原蛋 白溶液于蒸馏水中进行透析以去除其中的酸类。 0014 透明质酸 0015 该用语 “透明质酸(hyaluronan)” 是指存在于自然界中、 具有阴离子且未经硫酸化 的葡萄糖胺聚糖(glycosaminoglycan)， 其包含N-乙酰葡萄糖胺(N-a。
24、cetylglucosamine)、 D- 葡萄糖醛酸 (D-glucuronic acid) 及其衍生物的双醣分子重复单元。自然存在的透明 质酸 ( 也可称之为玻尿酸 ) 可以利用现有的技术自天然的物质来源中分离出， 例如 B 型链 球菌的胶囊、 鸡冠、 软骨、 关节液、 脐带、 皮肤组织以及眼球的玻璃质， 可参考如 Guillermo Lago et al.Carbohydrate Polymers 62(4):321-326,2005 以及 Ichika Amagai et al.Fisheries Science 75(3):805-810,2009等文献。 除此之外， 透明质酸亦可经。
25、由商业渠 道购得， 例如 Genzyme Corporation、 Lifecore Biomedical,LLC 以及 Hyaluron Contract Manufacturing。 0016 天然透明质酸的衍生物包括， 但不限于 ： 透明质酸酯 (hyaluronan esters)、 经己 二酸二酰肼修饰的透明质酸 (adipic dihydrazide-modified hyaluronan)、 透明质酸胺 产物 (hyaluronan amide products)、 交联透明质酸 (cross-linked hyaluronic acid)、 琥珀酸半酯 (hemiesters 。
26、of succinic acid) 及其重金属盐类、 部分或整体的透明质 酸酯、 硫化透明质酸 (sulphated hyaluronic acid)、 N- 硫化透明质酸 (N-sulphated hyaluronic acid)、 以及经胺基或二胺基修饰的透明质酸 (amine or diamine-modified hyaluronic acid)。可通过对一个或多个以上的官能基 ( 例如 ： 羧基、 氢氧基、 还原端基 团、 N- 乙酰基 ) 进行化学修饰以获得上述物质。其中对羧基进行修饰的方式可通过酯化 反应或经过碳二亚胺 (carbodiimide) 及双酰肼 (bishydraz。
27、ide) 等中间物的反应达成 ； 氢 氧基的修饰包括， 但不限于 ： 硫酸化反应、 酯化反应、 异脲偶合 (isourea coupling) 反应、 溴化氰活化 (cyanogen bromide) 反应、 过碘酸盐氧化 (periodate oxidation) 反应 ； 对 还原端基团进行修饰可通过还原胺化反应 (reductive amination) 达成， 亦可连结一磷 脂 (phospholipid)、 一染料 ( 例如 ： 荧光基团或发色基团 ) 或一适用于制备亲和性基质的 说 明 书 CN 102791254 A 6 4/7 页 7 试剂。天然透明质酸的衍生物可通过使用交联剂。
28、进行交联反应， 该交联剂例如 ： 双环氧化 物 (bisepoxide)、 二乙烯基砜 (divinylsulfone)、 碳二亚胺 (biscarbodiimide)、 小型同 质双功能链接剂 (small homobifunctional linker)、 甲醛、 环己基异氰化物 (cyclohexyl isocyanide) 以及离胺酸醚酯、 金属阳离子、 酰肼交联反应或其混合物 ； 或者可通过内酯 化 (internal esterification)、 光交联反应 (photocross-linking) 或表面电浆处理 (surface plasma treatment)。 001。
29、7 用于细胞生长的营养素 0018 该用语 “营养素 (nutrient)” 是指细胞生长的必要营养来源， 其可以是氨基酸、 维 生素、 矿物质、 碳源 ( 如葡萄糖 )、 脂肪酸或其混合物。于一实例中， 在本发明的细胞组织胶 体中所使用的营养素为细胞培养基， 该细胞培养基例如 ： MEM 培养基 (Minimum Essential Medium)、 BME培养基(Basal Medium Eagle)、 DMEM培养基(Dulbecco s Modified Eagle s medium),Ham s F-10培养基(Ham s Nutrient Mixtures F-10)、 Ham s。
30、 F-12培养基(Ham s Nutrient Mixtures F-12)、 M199 培养基 (Medium 199)、 RPMI 培养基 (RPMI medium)、 Ames 培 养 基 (Ames Media)、 BGJb 培 养 基 BGJb Medium(Fitton-Jackson Modification)、 Click 培养基 (Click s medium)、 CMRL-1066 培养基 (CMRL-1066 Medium)、 Fischer 培养 基 (Fischer s Medium)、 GMEM 培养基 (Glasgow Minimum Essential Medi。
31、um)、 IMDM 培养 基 (Iscove s Modified Dulbecco s Medium)、 L-15 培养基 (L-15Medium)、 McCoy s 5A 培养基 (McCoy s 5A Modified Medium)、 NCTC 培养基 (NCTC Medium)、 Swim s S-77 培养 基 (Swim s S-77Medium)、 Waymouth 培养基 (Waymouh Medium) 或 William s Medium E 培 养基 (William s Medium E)。 0019 生物活性剂 0020 任何增进细胞存活力、 促进细胞增生或诱导细胞。
32、分化的试剂 ( 例如 ： 胜肽、 多 胜肽、 寡糖、 多糖或小分子 ) 均可用于制备本发明的细胞组织胶体。于一实例中， 该生 物活性剂为生长因子， 诸如上皮生长因子、 纤维母细胞生长因子、 血管内皮生长因子、 结 缔组织生长因子、 血小板衍生性生长因子、 类胰岛素生长因子、 神经生长因子、 肝细胞 生长因子、 细胞聚落刺激因子、 干细胞因子、 血清素 (serotonin)、 温韦伯式因子 (von Willebrand factor)、 转化生长因子 (transforming growth factor)、 角质细胞生长因子、 颗粒球细胞聚落刺激因子、 颗粒球 / 巨噬细胞聚落刺激因子 (。
33、granulocyte/macrophage colony-stimulating factor)、 胶质衍生神经营养因子、 睫状神经营养因子、 内皮单核细胞 活化多胜肽、 上皮中性粒细胞活化胜肽、 红血球生成素、 骨形成蛋白、 大脑衍生神经营养因 子 ； 在另一实例中， 该生物活性剂可为细胞激素 (cytokine) 或趋化激素 (chemokine)， 其包 含但不限于 ： 介白素 -2(interleukin-2,IL-2)、 胸表达趋化素 ( 例如 ： BRAK)、 肾表达趋化 素(例如CXCL14) ； 该生物活性剂亦可为细胞分化因子， 诸如甲氟烯素(dexamethasone)、 。
34、丙 酮酸钠 (sodium pyruvate)、 维生素 C 磷酸盐 (ascorbic acid-2-phosphate)、 维生素 A 酸 (retinoic acid)、 脯氨酸 (proline)、 胰岛素、 运铁蛋白 (transferrin)、 亚硒酸 (selenous acid)、 亚麻油酸 (linoleic acid)、 小牛血清蛋白 (bovine serum albumin) 以及转化生长 因子 -3(TGF-3)。 0021 于一较佳的实施例中， 该细胞分化因子为一化合物。其中， 可参见 US 专利 第 5,908,784 号 专 利， 该 化 合 物 可 促 进 间。
35、 叶 干 细 胞 (mesenchymal stem cell) 的 说 明 书 CN 102791254 A 7 5/7 页 8 软 骨 生 成 作 用 (chondrogenesis) ； 而 该 化 合 物 若 为 甲 氟 烯 索 (dexamethasone)、 维 生 素 C(ascorbic acid) 及 - 甘 油 磷 酸 酯 (-glycerol phosphate) 时，则 可 促 进 骨 生 成 作 用 (osteogenesis) ； 该 化 合 物 若 为 胰 岛 素、 异 丁 基 - 甲 基 黄 嘌 呤 (isobutyl-methyl xanthine)、甲 氟 。
36、烯 索 及 美 洒 辛 (indomethacin) 时，则 可 促 进 脂 肪 生 成 作 用 (adipogenesis) ； 该 化 合 物 若 为 活 化 素 A(activin-A) 及 骨 形 成 蛋 白 -4(bone morphogenetic protein-4,BMP-4) 时，则 可 促 进 心 肌 分 化 作 用 (cardiomyogenic differentiation) ； 该 化 合 物 若 为 内 皮 细 胞 基 础 培 养 基 (endothelial basal medium-2,EBM-2)、 甲氟烯素及血管内皮生长因子时， 则可促进 内皮细胞分化作用。
37、 (endothelial cell differentiation) ； 该化合物若为血小板衍 生性生长因子 -BB(PDGF-BB) 时， 则可促进平滑肌细胞分化作用 (smooth muscle cell differentiation) ； 该化合物若为碱性纤维母细胞生长因子 (bFGF)、 上皮细胞生长因 子 (epithelial growth factor,EGF)、 B27 营 养 补 给 物 (B27supplement)、 二 甲 基 亚 砜 (dimethyl sulfoxide,DMSO)、 丁基羟苯甲醚 (butylated hydroxyanisole)、 氟斯柯 。
38、林 (forskolin)、 丙戊酸 (valproic acid)、 氯化钾 (KCl)、 K252a 蛋白及 N2 营养补给 物 (N2supplement)， 则可促进神经诱导机制 (neural induction) ； 该化合物若为甲氟烯 素、 肝细胞生长因子、 纤维母细胞生长因子 -4(FGF-4) 时， 则可促进内胚层品系分化作用 (endodermal lineage differentiation)。 该生物活性剂亦可以是一种中草药或是中草药 内部的活性成分。 0022 基质要素 0023 一种基质要素可为一种辅助将细胞维持在植入位置的化合物， 其可以是一种于 细胞外基质中发。
39、现的胞外因子 (extracellular factor)。该基质要素例如， 但不限于 ： 明 胶、 纤维连接蛋白弹性蛋白、 细胞黏合素 (tenacin)、 层黏蛋白、 玻璃连接蛋白、 多胜肽、 硫酸 肝素、 软骨素、 硫酸软骨素、 角质素、 硫酸角质素、 硫酸皮肤素、 鹿角菜胶、 肝素、 几丁质、 几丁 聚糖、 褐藻胶、 琼脂糖、 琼脂、 纤维素、 甲基纤维素、 羧甲基纤维素、 肝醣及其衍生物。此外， 该基质要素可以是纤维蛋白 (brin)、 纤维蛋白原 (fibrinogen)、 凝血酶 (thrombin)、 多聚 谷氨酸 (polyglutamic acid)、 合成巨分子或交联剂 。
40、； 其中该合成巨分子系可为丙烯酸酯 (acrylate)、 聚乳酸 (polylactic acid)、 聚乙醇酸 (polyglycolic acid) 或聚乳酸 - 乙 醇酸 poly(lactic-co-glycolic acid)， 而该交联剂系可为京尼平 (genipin)、 戊二醛 (glutaraldehyde)、 甲醛 (formaldehyde)、 环氧化合物 (epoxide)。较佳的， 用于此处所描 述的组织胶体中的该基质要素具有较高的分子量， 借此使得胶体的黏度增加。 0024 内嵌细胞的组织胶体的制备 0025 此处所述的该组织胶体可通过将前述各成分以一理想的重量比例。
41、混合， 并且将混 合物置于适当的环境中以形成胶体。为了制备一内部嵌埋有细胞的胶体， 可将细胞与该等 胶体成分混合， 其中细胞可为自哺乳类动物 ( 例如 ： 牛、 猪、 老鼠、 马、 狗、 猫、 绵羊、 猴子及人 类 ) 体内获得的干细胞。该干细胞例如， 但不限于 ： 胎盘干细胞 (placenta-derived stem cells)、 骨髓干细胞 (bone marrow-derived stem cells)、 基质细胞 (stromal cells)、 间 叶干细胞、 组织先驱细胞 (tissue progenitor cells)、 胚细胞 (blast cells) 或纤维母细 胞。
42、 ； 其中该基质细胞可为脂肪衍生基质细胞 (adipose-derived stromal cells)。 0026 藉此， 该组织胶体则可制备完成且其内部嵌埋有细胞， 该组织胶体可植入一理想 说 明 书 CN 102791254 A 8 6/7 页 9 的位置以实现组织修复及其他医疗上的用途。 0027 相信在本领域技术人员基于前述的描述， 都可将本发明充分的利用而不需进一步 的详细描述。因此， 下文所举实施例仅仅只是作为范例， 并非用以在任何方面限制本发明。 在此引用的所有文献作为参照并入本案。 0028 实施例 1 ： 含有胶原蛋白及透明质酸的组织胶体中的干细胞存活度 0029 绒毛膜绒。
43、毛 (chorionic villi) 可从人类的足月胎盘获得， 经由机械方式将其切 碎后并以胶原蛋白酶处理， 而获得含有胎盘间叶干细胞的材料。该含有胎盘间叶干细胞的 材料系分别依序由孔径为 300m、 100m、 37m 的筛网过筛， 然后以 percoll 密度梯度离 心法(percoll density gradient centrifugation)收集干细胞。 将该干细胞以105-107细 胞数 /ml 的浓度悬浮于内含有 2x 低量葡萄糖且添加有 20% 胎牛血清以及 200U/ml 紫菌素 (gentamycin)的DMEM培养基(购自Gibco BRL,Life Technol。
44、ogies)， 并且混合于不同份量 的透明质酸以形成一悬浮液。将自猪皮中取得的胶原蛋白溶解于 0.01N 氢氯酸溶液中以形 成一具有pH 4至7的胶原蛋白溶液。 该胶原蛋白溶液与干细胞悬浮液以相等体积混合以形 成混合溶液， 该混合溶液可含有 6mg/ml 的胶原蛋白以及 0.05mg/ml、 0.2mg/ml 或 0.5mg/ml 的透明质酸， 或者含有 9mg/ml 胶原蛋白以及 0.2mg/ml 透明质酸。实验过程中并使用具有 等量干细胞数目且分别含有 6mg/ml 以及 9mg/ml 胶原蛋白的混合溶液作为对照组。上述任 何混合溶液均置于 37 C 的培养箱中 30 分钟， 以使得其内部。
45、的胶原蛋白开始进行固化， 以 形成一内嵌干细胞的组织胶体。该组织胶体于 37 C 下且流通有 5% 二氧化碳的环境中进 行培养， 所需天数最多 14 天。在不同时间点 ( 如培养第 1 天、 培养第 7 天及培养第 14 天 ) 的细胞存活度通过锥蓝染色法(trypan blue staining)测定， 细胞存活度试验的测试结果 如表 1 所示。 0030 表 1 在含有胶原蛋白及透明质酸的组织胶体中， 干细胞存活度的结果比较表 0031 0032 由表 1 可知， 胶原蛋白与透明质酸在该组织胶体的重量比例对于维持干细胞在该 组织胶体中生长时的存活度是极为重要的。 0033 实施例 2 ： 。
46、含有胶原蛋白、 透明质酸及明胶的组织胶体中的干细胞存活度 0034 如实施例 1 所述的该干细胞悬浮液及胶原蛋白溶液以等体积比例与浓度为 2mg/ ml或10mg/ml的明胶混合， 以形成内嵌干细胞的组织胶体。 胶原蛋白、 透明质酸及明胶的终 说 明 书 CN 102791254 A 9 7/7 页 10 浓度如表 2 所示。 0035 该组织胶体系于 37 C 下且流通有 5% 二氧化碳的环境中进行培养， 所需天数最 多 14 天。在不同时间点 ( 如培养第 1 天、 培养第 7 天及培养第 14 天 ) 的细胞存活度是以 如同实施例 1 所述的试验方法进行测试， 表 2 为生长于上述组织胶。
47、体中活细胞个数百分比 的数值结果比较。 0036 表 2 在含有胶原蛋白、 透明质酸及明胶的组织胶体中， 干细胞存活度的结果比较 表 0037 0038 其他实施例 0039 本发明所揭露的所有特征应可以任何结合方式实现。 本发明所揭露的每一特征应 可以相同、 均等或相似目的的取代物所取代。因此， 除非有明确的指定， 否则所揭露的每一 个特征仅仅只是均等物或相似特征的一个种类的一实施例。 0040 由上述内容可知， 任何所属本领域技术人员， 将可轻易从本发明所揭露的内容中 了解到本发明的特征， 在不偏离随附权利要求书所界定的本发明的精神与范围下， 当可在 此进行各种改变、 取代以及修正。 因此， 其他实施例亦落于本发明权利要求书所要求保护的 范围之内。 说 明 书 CN 102791254 A 10 。