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1、(10)申请公布号 CN 102415987 A (43)申请公布日 2012.04.18 CN 102415987 A *CN102415987A* (21)申请号 201010505047.5 (22)申请日 2010.09.25 A61K 9/00(2006.01) A61K 9/107(2006.01) A61K 9/127(2006.01) A61K 9/14(2006.01) A61K 9/51(2006.01) A61K 47/22(2006.01) A61K 47/26(2006.01) A61K 47/34(2006.01) A61K 47/36(2006.01) A61K 。
2、47/42(2006.01) A61K 47/48(2006.01) A61P 9/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (71)申请人 鲁翠涛 地址 100210 北京市朝阳区武圣西里 8 楼 2 门 403 (72)发明人 鲁翠涛 赵子逸 赵应征 (54) 发明名称 实现心血管系统病变部位药物高效递送的方 法 (57) 摘要 本发明涉及一种实现心血管系统病变部位药 物高效递送的方法， 该方法是将药物包载到纳米 粒中， 应用结合微泡的定位超声实现病变部位局 部空化效应， 促进纳米粒渗透进入病变组织内部， 提高纳米粒的靶向性， 降低病变组织的耐药性。 本 发明适用病变。
3、部位范围广， 特别适于心血管系统 内的肿瘤、 局部栓塞、 局部脓肿和局部炎症， 适用 的药物包括中药、 化学药物、 生物技术药物或生物 制品。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 8 页 CN 102415995 A1/1 页 2 1. 一种实现心血管系统病变部位药物高效递送的方法， 其特征在于 ： 将包载药物的纳 米粒通过注射方式进入血液循环， 空心微泡也通过注射方式进入血液循环， 应用临床诊断 治疗使用的超声波定位病变部位， 并促使空心微泡在病变部位爆破产生局部空化效应， 促 进载药纳米粒渗透进入病变组织内部， 提。
4、高载药纳米粒的靶向性， 降低病变组织的耐药性。 2. 如权利要求 1 所述的实现心血管系统病变部位药物高效递送的方法， 其特征在于 ： 所述的药物是指发挥治疗、 预防、 免疫、 诊断应用的中药、 化学药物、 生物技术药物或生物制 品。 3. 如权利要求 1 所述的实现心血管系统病变部位药物高效递送的方法， 其特征在于 ： 所述的纳米粒是指粒径在 10-1000 纳米范围内的药学公知的微粒， 包括纳米球、 纳米囊、 微 乳、 白蛋白纳米粒、 脂质体、 脂质纳米粒、 类脂体、 环糊精包合物、 聚合物胶束、 树状大分子、 药质体。 4. 如权利要求 1 所述的实现心血管系统病变部位药物高效递送的方法。
5、， 其特征在于 ： 所述的包载药物的纳米粒， 药物是通过物理、 化学或生物学方式吸附、 嵌合、 包裹、 包埋或联 接于纳米粒上。 5. 如权利要求 3 或 4 所述的实现心血管系统病变部位药物高效递送的方法， 其特征在 于 ： 所述的纳米粒通过表面修饰提高与病变组织的亲和力， 表面修饰应用的修饰剂包括叶 酸、 聚乙二醇、 泊洛沙姆、 半乳糖、 多糖、 聚唾液酸、 转铁蛋白、 凝集素、 生物素、 短肽、 特异性 结合因子或抗体。 6. 如权利要求 1 所述的实现心血管系统病变部位药物高效递送的方法， 其特征在于 ： 所述的空心微泡是指粒径在200纳米-10微米范围内的能在体温时形成空心结构的微型。
6、囊 泡， 包括以磷脂类化合物为成膜材料的微泡、 以白蛋白为成膜材料的微泡、 以糖类为成膜材 料的微泡、 以非离子表面活性剂为成膜材料的微泡、 以可生物降解的高分子多聚物为成膜 材料的微泡、 氟碳化合物乳剂。 7. 如权利要求 6 所述的实现心血管系统病变部位药物高效递送的方法， 其特征在于 ： 所述的空心微泡粒径在 2 微米至 6 微米范围内。 8. 如权利要求 1 所述的实现心血管系统病变部位药物高效递送的方法， 其特征在于 ： 所述的纳米粒与空心微泡采用分先后次序注射、 分部位注射或混合后注射方式给予。 9. 如权利要求 1 所述的实现心血管系统病变部位药物高效递送的方法， 其特征在于 ：。
7、 所述的空化效应的强弱通过超声波的强度、 超声照射时间、 微泡的注射剂量或微泡浓度进 行调整。 10. 如权利要求 1 所述的实现心血管系统病变部位药物高效递送的方法， 其特征在于 ： 所述的病变为心血管系统内的肿瘤、 局部栓塞、 局部脓肿和局部炎症。 权 利 要 求 书 CN 102415987 A CN 102415995 A1/8 页 3 实现心血管系统病变部位药物高效递送的方法 【技术领域】 0001 本发明属于药物制剂学领域， 更具体地说， 本发明涉及一种用于提高心血管系统 病变部位药物递送效率的方法。 【背景技术】 0002 纳米粒 (nanoparticle， NP) 是大小在 。
8、10nm 1000nm 之间的固态胶体颗粒， 一般 由天然高分子物质或合成高分子物质构成， 可作为传导或输送药物的载体。由于材料和制 备工艺的差异， 可以形成纳米球 (nanosphere) 与纳米囊 (nanocapsule)。广义的纳米粒不 仅包括纳米球、 纳米囊， 还包括固体脂质纳米粒 (solid lipid nanoparticle， SLN)、 纳米脂 质体、 聚合物胶束、 纳米乳、 药质体等纳米粒径范围内的新型载体。载药纳米粒是将药物分 散、 包封于纳米粒内部， 或将药物吸附、 联接在纳米粒表面。 载药纳米粒的制备方法有 ： 乳化 聚合法、 天然高分子聚合法、 液中干燥法、 自动。
9、乳化溶剂扩散法等。 0003 纳米粒通过表面修饰或加入铁磁性物质制成磁性纳米粒， 可以提高体内的靶向 性， 延长体内循环时间。纳米粒可以高效地包载治疗药物， 增加了药物稳定性， 延长了药物 体内作用时间， 也可以改变药物的体内吸收和分布。 0004 但是随着研究深入， 大量实验发现纳米粒具有潜在安全性问题。2003 年 4 月， Service 在 Science 上发表文章开始讨论纳米颗粒的生物效应及其对健康的影响问题。纳 米粒比细胞还小， 很可能侵入人体的自然防御系统， 进入正常细胞内并破坏细胞的功能。 尤 其是具有自组装能力的人工纳米粒进入人体后， 可能对生命过程本身的化学反应发生干 扰。
10、。修饰后的纳米粒对人体的安全隐患更大。长循环纳米粒又称为隐形纳米粒， 虽然延长 了药物体内作用时间， 但纳米粒载体消除太慢， 容易在体内富集， 对机体健康会带来更为严 重的负面影响。 瑞士科学家发现， 磁性纳米粒对人体细胞具有毒性反应， 能大幅度减少培养 液中人体和啮齿动物细胞的活性。 0005 空化效应是指液体中的微小气泡在超声波的作用下产生振荡、 扩大收缩至内爆等 一系列的动力学过程。空化效应能产生一系列的机械和生化作用， 能增加组织的通透性、 提高药物的跨膜转运。肿瘤细胞实验表明， 结合微泡的超声处理能够促进明显增加抗肿 瘤药物进入细胞内效率， 提高药物对肿瘤细胞的杀伤作用 Zhao Y。
11、Z， Lu CT.Factors that affect the efficiency of antisense oligodeoxyribonucleotide transfection by insonated gas-filled lipid microbubbles.Journal of Nanoparticle Research.2008， 10(3) ： 449-454。利用空心微泡的空化效应促进药物进入肿瘤细胞内部、 提高药物抗肿瘤 作用已成为研究热点。 为了更好的发挥超声空化作用， 研究者将治疗药物包载到微泡上， 结 合定位超声发挥治疗作用， 相关专利已有多项， 如 “载药聚乳。
12、酸微泡超声造影剂及其制备方 法” ( 专利申请号 200910111163)、“一种高效低毒的载蓖麻毒素 A 链超声微泡及其制备方 法” ( 专利申请号 200810072473)、“一种包载水溶性药物超声造影剂的制备方法” ( 专利申 请号 200810218295.4) 等。但是在这些专利中， 由于微泡空心结构的限制， 载药空间有限， 药物包封率低， 制备工艺要求高， 不能适用于大多数治疗药物。 说 明 书 CN 102415987 A CN 102415995 A2/8 页 4 【发明内容】 0006 本发明要解决的技术问题是针对现有的载药纳米粒、 载药微泡的不足之处， 提供 一种用于提。
13、高心血管系统病变部位药物递送效率的微粒组合及其应用方式， 该微粒组合结 合了载药纳米粒和超声微泡的优点， 抵消了两者的不足， 将药物包载到纳米粒中， 应用结合 微泡的定位超声实现病变部位局部空化效应， 促进纳米粒渗透进入病变组织内部， 提高纳 米粒的靶向性， 降低纳米粒的毒性。 本发明适用病变部位范围广， 特别适于心血管系统内的 肿瘤、 局部栓塞、 局部脓肿和局部炎症， 适用的药物包括化学药物、 中药和生物制品， 特别适 合于核酸及其衍生物、 细胞或血管因子、 酶与辅酶、 多肽、 蛋白、 多糖、 基因或疫苗药物。 0007 发明人研究发现， 载药纳米粒具有较高的载药量和包封率， 体内稳定性好，。
14、 但存在 较高的安全隐患。而结合超声的微泡具有准确的心血管系统疾病的诊断能力， 但微泡的载 药能力差， 药物包裹在微泡载体上容易影响微泡的声学谐振能力。 实验发现， 将药物包载到 纳米粒中， 应用结合微泡的定位超声实现病变部位局部空化效应， 可以促进纳米粒渗透进 入病变组织内部， 降低纳米粒全身分布产生的潜在安全性风险。 进一步实验发现， 这种组合 应用方式还可以降低肿瘤组织的耐药性， 对于延长抗肿瘤药物的使用寿命具有重大意义。 0008 由此， 本发明的一种实现心血管系统病变部位药物高效递送的微粒组合及其应用 方式， 将包载药物的纳米粒通过注射方式进入血液循环， 空心微泡也通过注射方式进入血。
15、 液循环， 应用临床诊断治疗使用的超声波定位病变部位， 并促使空心微泡在病变部位爆破 产生局部空化效应， 促进载药纳米粒渗透进入病变组织内部， 提高载药纳米粒的靶向性， 降 低病变组织的耐药性。 0009 上述的药物是指发挥治疗、 预防、 免疫、 诊断应用的中药、 化学药物、 生物技术药物 或生物制品。 0010 上述的纳米粒是指粒径在 10-1000 纳米范围内的药学公知的微粒， 包括纳米球、 纳米囊、 微乳、 白蛋白纳米粒、 脂质体、 脂质纳米粒、 类脂体、 环糊精包合物、 聚合物胶束、 树 状大分子、 药质体。 0011 上述的包载药物的纳米粒， 药物是通过物理、 化学或生物学方式吸附、。
16、 嵌合、 包裹、 包埋或联接于纳米粒上。 0012 上述的纳米粒可以通过表面修饰提高与病变组织的亲和力， 表面修饰应用的修饰 剂包括叶酸、 聚乙二醇、 泊洛沙姆、 半乳糖、 多糖、 聚唾液酸、 转铁蛋白、 凝集素、 生物素、 短 肽、 特异性结合因子或抗体。 0013 上述的空心微泡是指粒径在200纳米-10微米范围内的能在体温时形成空心结构 的微型囊泡， 包括以磷脂类化合物为成膜材料的微泡、 以白蛋白为成膜材料的微泡、 以糖类 为成膜材料的微泡、 以非离子表面活性剂为成膜材料的微泡、 以可生物降解的高分子多聚 物为成膜材料的微泡、 氟碳化合物乳剂。 0014 上述的空心微泡粒径在 2 微米至。
17、 6 微米范围内。 0015 上述的纳米粒与空心微泡可以采用分先后次序注射、 分部位注射、 混合后注射方 式给予， 并可以调整注射给予的剂量， 反复应用。 0016 上述的空化效应的强弱可以通过超声波的强度、 超声照射时间、 微泡的注射剂量 或微泡浓度进行调整。 说 明 书 CN 102415987 A CN 102415995 A3/8 页 5 0017 上述的病变为心血管系统内的肿瘤、 局部栓塞、 局部脓肿和局部炎症。 0018 本发明的一种实现心血管系统病变部位药物高效递送的微粒组合及其应用方式， 具有下述优点 ： (1) 具有纳米粒的优点， 如制备方法多样、 使用药物范围广、 载药量大。
18、、 包封 率高、 体内稳定性好等。(2) 改善了纳米粒存在的安全隐患缺点， 利用空心微泡在病变部位 爆破产生局部空化效应， 促进载药纳米粒渗透进入病变组织内部， 从而降低了纳米粒全身 分布及在正常组织蓄积带来的安全风险 ； (3) 发挥微泡结合超声诊断的优势， 利用空心微 泡可以实现心血管系统病变部位的准确定位， 并可以观察病变程度， 从而随时调整给药方 案， 达到高效治疗目的 ； (4) 克服微泡载药的不足， 本发明是将药物包载于纳米粒中， 因此 微泡不需要载药， 从而避免了微泡载药的制备问题 ； (5) 本发明适用病变部位范围广， 特别 适于心血管系统内的肿瘤、 局部栓塞、 局部脓肿和局部。
19、炎症 ； (6) 本发明对于耐药的病变组 织也具有较好的效果， 尤其是耐药的肿瘤组织， 可以延长抗肿瘤药物的使用寿命 ； (7) 适用 的药物范围宽， 包括化学药物、 中药和生物制品， 特别适合于核酸及其衍生物、 细胞或血管 因子、 酶与辅酶、 多肽、 蛋白、 多糖、 基因或疫苗药物 ； (8) 结合微泡空化效应的靶向促渗作 用和纳米粒的长效作用， 可以发挥药物的速效和长效双重作用， 并且降低病变组织的抗药 性， 更适合于心血管系统重大疾病的长期治疗需要。 【具体实施方式】 0019 现结合下列实例来进一步描述本发明。 0020 实施例 1 ： 0021 许多中药植物如灯盏花、 半枝莲、 大黄。
20、、 冬凌草、 五加皮、 红豆杉、 决明子、 忽木等含 有治疗局部炎症、 坏死或脓肿的有效成分。本发明的第一个实施方案以中药植物冬凌草 中具有活性的二萜类化合物冬凌草甲素 (oridonin) 为主药， 应用固体脂质纳米粒 (solid lipid nanoparticles， SLN) 包载， 结合非离子表面活性剂为成膜材料的微泡， 应用同时给 药方式将载药 SLN 与微泡混合后注射到动物体内， 观察药物分布情况。 0022 冬凌草甲素 SLN 制备 ： 单硬脂酸甘油酯 150mg， 十六醇 20mg， 泊洛沙姆 (Poloxamer 188)200mg和硬脂酸棕榈酸甘油酯350mg加热熔融，。
21、 向熔融物中定量加入100mg冬凌草甲素 并快速分散后， 置冰箱冷冻层使之凝固。将凝固的混合物转移至超声管中， 注入 10mL 重蒸 馏水， 用超声波细胞粉碎机超声分散(400W， 6min， 60)， 分散液过0.22m微孔滤膜， 滤液 在室温下冷却， 即得冬凌草甲素 SLN。激光粒径分析仪测定 SLN 的平均粒径为 250nm。 0023 非离子表面活性剂为成膜材料的微泡 ： 超声造影剂 ST68(S 指的是 Span 类表面 活性剂， T 指的是 Tween 类， Span 类和 Tween 类均为非离子表面活性剂 )， 微泡粒径分布 1-10m。 0024 动物实验 ： 健康昆明种大鼠。
22、若干只 (25020g)， 随机分为 2 组， 雌雄各半。A 组 ( 冬凌草甲素 SLN)， 尾静脉注射冬凌草甲素 SLN 溶液 25ml/kg。B 组 ( 冬凌草甲素 SLN+ 微 泡 ST68+ 超声 )， 尾静脉注射冬凌草甲素 SLN 与微泡 ST68 等量混合溶液 50ml/kg， 同时于大 鼠肝脏部位定位超声 (1-MHZ、 2.0W/cm2)60s。两组给药后 8h 吸入乙醚麻醉后处死， 立即取 出肝、 心、 肺、 胃与肾， 用生理盐水冲洗残血， 除去表面的筋膜和结缔组织， 并用滤纸吸干表 面水分， HPLC 测定各组织中药物含量。由各时间点对应的浓度做一曲线， 采用药代动力学 软。
23、件 3P 97 计算各组织药时曲线下面积 (AUC)， 以 te (AUC)靶/(AUC)非靶100计算， 说 明 书 CN 102415987 A CN 102415995 A4/8 页 6 式中 te为靶向效率， (AUC)靶为特定组织的曲线下面积， (AUC)非靶为特定组织外的各组织曲 线下面积之和。 0025 结果见表 1， B 组 ( 冬凌草甲素 SLN+ 微泡 ST68+ 超声 ) 肝中药物的分布明显高于 A 组 ( 冬凌草甲素 SLN)， 表明冬凌草甲素 SLN 结合微泡 ST68 和肝脏定位超声， 显著增加了 肝中药物的浓集， 明显增加了药物的靶向效率， 并降低了正常组织中的药。
24、物分布， 提高了纳 米粒靶向治疗的安全性， 降低了其对其它正常组织的毒副作用。 0026 表 1 不同组织中冬凌草甲素的靶向效率 (n 5) 0027 0028 实施例 2 ： 0029 心血管重大疾病的治疗大部分依赖化学药物， 如肿瘤化疗药物， 具有稳定的化学 结构、 明确的药物作用机制和疗效。 但化学药物多数不具备靶向性， 应用治疗时对机体的毒 副作用大。本发明的第二个实施方案以肿瘤化疗药物表柔比星为主药， 采用 PEG 修饰的磷 脂材料制备的长循环脂质体包载， 结合磷脂微泡， 应用分部位分次序注射方式给予载药长 循环脂质体与磷脂微泡， 并重复操作， 观察肿瘤模型动物治疗效果。 0030 。
25、载药长循环脂质体的制备 ： 二硬脂酰磷脂酰胆碱 (DSPC)5mg、 聚乙二醇接枝的二 硬脂酰磷脂酰乙醇胺 (DSPE-PEG2000)5mg、 胆固醇 2mg、 泊洛沙姆 (Poloxamer 188)100mg、 表柔比星 10mg 加入 10ml 叔丁醇中， 65溶解， 构成有机相。吐温 (Tween 80)5mg 和海藻 糖 100mg 溶于 20ml 70蒸馏水中， 作为水相。在 3000r/min 搅拌条件下， 用预热过的注射 器将有机相缓慢注入水相中， 形成乳状微粒混悬液， 高速均质 (15000r/min) 处理 10min， 装 于西林瓶中， 液氮速冻， 冷冻干燥 (510-。
26、4Pa， 20h) 得到表柔比星脂质体固态冻干品。使用 前， 加入蒸馏水 2ml， 轻微摇动， 即得到表柔比星长循环脂质体溶液， 激光粒径分析仪测定载 药长循环脂质体的平均粒径为 600nm。 0031 磷脂微泡 ： 意大利的 Bracco 公司生产的超声造影剂司诺维 (Sonovue)， 微泡粒径 分布 2-6m。 0032 动物实验 ： 选取 5 周龄雄性裸鼠， 右侧腋下位置、 皮下注射 HL-60 细胞悬液 0.2ml( 每 ml 细胞悬液含有 HL-60 细胞 2107个 )， 无菌环境中饲养。待肿瘤体积增长至 100mm3以上时， 将动物进行分组 ： A组(载药长循环脂质体)， 腹腔。
27、注射载药长循环脂质体溶 液， 剂量 ： 0.1ml/20g。B 组 ( 载药长循环脂质体 + 微泡 Sonovue+ 超声 )， 腹腔注射载药长循 环脂质体溶液， 剂量 ： 0.1ml/20g， 10min后于鼠尾静脉注射微泡Sonovue溶液0.1ml， 同时于 肿瘤部位定位超声 (1-MHZ、 3.0W/cm2)30s。C 组 ( 阴性对照组 )， 未给予载药长循环脂质体 但给予微泡Sonovue溶液和超声处理的肿瘤模型， 超声处理过程同B组。 同时设置空白对照 组， 即未给予药物和超声处理的肿瘤模型裸鼠。 肿瘤裸鼠于1、 3、 5、 7、 9天给药一次， 10天后 说 明 书 CN 10。
28、2415987 A CN 102415995 A5/8 页 7 将瘤体从裸鼠体内剥离， 称重， 计算肿瘤的瘤重相对生长率。 空白对照组一部分动物于实验 开始前将瘤体从裸鼠体内剥离， 称重， 一部分动物于 10 天后将瘤体从裸鼠体内剥离， 称重， 代入以下公式计算。 0033 肿瘤总体重量变化率 (Wtumor， 最终/W tumor， blank)100， 其中 Wtumor， 最终和 Wtumor， blank分别表示各实验组和空白组的肿瘤重量测量值。 0034 正常组织器官重量增长率 (Wbody， 最终-Wtumor， 最终)-(Wbody， 初始-Wtumor， 初始)/Wbody， 。
29、初 始100， 其中Wbody， 初始和Wbody， 最终是动物最初重量和试验后重量， Wtumor， 初始和Wtumor， 最终是动物 肿瘤最初重量和试验后重量。 0035 结果见表 2， B 组 ( 载药长循环脂质体 + 微泡 Sonovue+ 超声 ) 肿瘤重量增加的程 度明显低于A组(载药长循环脂质体)， 而正常组织器官重量增长率明显高于A组(载药长 循环脂质体 )， C 组 ( 阴性对照组 ) 结果与空白对照组结果一致， 表明微泡 Sonovue 与超声 处理， 不具有影响肿瘤和裸鼠生长的药理作用。 从以上结果可见， 结合定位超声和微泡应用 的载药长循环脂质体， 可以更好发挥抗肿瘤药。
30、物的药效， 且减少抗肿瘤药物对正常组织的 毒副作用。 0036 表 2 肿瘤总体重量变化率和正常组织器官重量增长率 (n 5) 0037 0038 0039 实施例 3 ： 0040 生物技术药物如激素、 多肽、 基因或疫苗虽然药理活性强， 但由于分子量大、 热稳 定性差、 体内易被迅速降解等特点， 穿透体内生物屏障能力差， 很容易在体内降解， 从而难 以维持有效治疗。本发明的第三个实施方案以低分子肝素为模型药， 利用化学方法连接到 泊洛沙姆 (Poloxamer 188) 上， 与丙烯酸树脂 (Eudragit)S100 形成聚合物胶束， 结合白蛋 白为成膜材料的微泡， 应用分次序注射方式给。
31、予载药聚合物胶束与白蛋白微泡， 结合重复 超声， 观察血栓模型动物治疗效果。 0041 肝素与泊洛沙姆的连接 ： 取一定量的泊洛沙姆 188 于一干燥的圆底烧瓶中， 加入 适量的丁二酸酐、 4- 二甲氨基吡啶以及三乙胺， 以 30ml 二氧六环为溶剂， 室温下搅拌反应 说 明 书 CN 102415987 A CN 102415995 A6/8 页 8 24h。 然后， 真空抽去二氧六环， 用少量氯仿溶解后缓慢并搅拌倒入大量冷乙醚中， 收集产生 沉淀， 重复氯仿溶解/乙醚沉淀步骤两次。 所得产物室温下进行真空干燥。 取适量合成好的 产物， 以一定量的 2-(N- 吗啉代 )- 乙磺酸缓冲液为溶。
32、剂， 分别加入适量 1- 乙基 -3-(3- 二 甲基氨丙基)碳化二亚胺的盐酸盐、 N-羟基琥珀酰亚胺搅拌反应15min， 然后加入与泊洛沙 姆 188 投料等质量的低分子肝素钠， 室温下反应 24h。反应结束后， 用半透膜 (MWCO 7kD) 透析三天。收集透析袋内的液体， 进行冷冻干燥， 得白色肝素与泊洛沙姆连接物。 0042 聚合物胶束的制备 ： 肝素与泊洛沙姆连接物 100mg， 加入 100mL 蒸馏水溶解作为水 相。另取丙烯酸树脂 (Eudragit)S100 200mg， 加无水乙醇 50mL 制成有机相。将有机相注入 水相中， 不断搅拌 (500r/min)， 转入旋转蒸发仪。
33、中， 35减压蒸发除去乙醇， 即得载药聚合 物胶束溶液， 激光粒径分析仪测定平均粒径为 180nm。 0043 白蛋白微泡 ： 美国Molecular Biosystems公司生产的Optison微泡造影剂(人血 清白蛋白为微泡膜材， 包裹全氟丙烷气体 )， 微泡粒径分布 1-8m。 0044 动物实验 ： 采用直流电刺激法制备大鼠颈动脉血栓， 将健康昆明种大鼠若干只 (25020g) 麻醉后， 固定于动物解剖板上， 剥离出大鼠的颈总动脉， 剥离长度约 13 毫米， 将直流电刺激血栓生成仪的血栓探头上的压板打开， 将剥离好的颈总动脉勾入探头的沟槽 内， 轻轻放下压板， 使血栓探头与动物身体保持。
34、垂直， 将上端软线放入固定支架的夹子内固 定， 调整好高度和方向。 开启直流电源刺激成栓， 当栓塞率达到90时， 建成动物血栓模型。 将动物进行分组 ： A 组 ( 载药聚合物胶束 )， 尾静脉注射载药聚合物胶束溶液， 剂量 ： 0.1ml。 B组(载药聚合物胶束+微泡Optison+超声)， 尾静脉按顺序分别注射载药聚合物胶束溶液 0.1ml和Optison微泡溶液0.1ml， 然后于5min和20min颈动脉血栓部位定位超声(1-MHZ、 1.5W/cm2)20s。C 组 ( 阴性对照组 )， 未给予载药聚合物胶束但给予 Optison 微泡溶液和超 声处理的血栓模型， 超声处理过程同B组。
35、。 30min时观察直流电刺激血栓生成仪显示的栓塞 率， 并按下式计算溶栓率。 0045 溶栓率 ( 初始栓塞率 - 实验后栓塞率 )/ 初始栓塞率 100 0046 表 3 栓塞率和溶栓率结果 (n 5) 0047 0048 结果见表 3， 尽管 C 组 ( 阴性对照组 ) 也有一定的溶栓率， 但 B 组 ( 载药聚合物胶 束 + 微泡 Optison+ 超声 ) 溶栓率明显高于 A 组 ( 载药聚合物胶束 )， 说明结合定位超声和 微泡应用的载药聚合物胶束， 显著提高溶栓药物进入血栓发挥作用的效率。 0049 实施例 4 ： 0050 结合定位超声的微泡爆破不但可以提高药物的递送效率， 而。
36、且有助于降低病变组 织的耐药性。本发明的第四个实施方案以阿霉素为主药， 采用半乳糖修饰的白蛋白制备阿 说 明 书 CN 102415987 A CN 102415995 A7/8 页 9 霉素白蛋白纳米粒， 结合白蛋白微泡， 应用同时给药方式注射阿霉素白蛋白纳米粒与白蛋 白微泡， 并重复操作， 观察耐药肿瘤模型动物的治疗效果。 0051 阿霉素白蛋白纳米粒的制备 ： 精制棉仔油 100ml 加热至 125， 维持恒温。另取半 乳糖白蛋白 250mg 和阿霉素 20mg， 充分混匀， 加入精制棉仔油 30ml 中， 在 4下超声乳化 5min然后以逐滴加入125的精制棉仔油中， 不断搅拌并维持恒。
37、温10min。 然后用冰浴冷却 至 25， 用无水乙醚洗涤 3-4 次， 每次用无水乙醚 60ml， 4000r/min 离心 15min， 沉淀的纳米 粒自然蒸发干燥， 得到载药白蛋白纳米粒， 临用前加入生理盐水配置所需的溶液。 0052 白蛋白微泡 ： 美国Molecular Biosystems公司生产的Optison微泡造影剂(人血 清白蛋白为微泡膜材， 包裹全氟丙烷气体 )， 微泡粒径分布 1-8m。 0053 动物实验 ： 选取 5 周龄雄性裸鼠， 右侧腋下位置、 皮下注射阿霉素耐药的 HL-60 细 胞悬液 0.2ml( 每 ml 细胞悬液含有阿霉素耐药 HL-60 细胞 210。
38、7个 )， 无菌环境中饲养。 待肿瘤体积增长至 100mm3以上时， 将动物进行分组 ： A 组 ( 载药白蛋白纳米粒 )， 按照阿霉 素 2mg/kg 配置载药白蛋白纳米粒溶液， 尾静脉注射给药。B 组 ( 载药白蛋白纳米粒 + 微 泡 Optison+ 超声 )， 按照阿霉素 2mg/kg 配置载药白蛋白纳米粒溶液， 与微泡 Optison 溶液 0.1ml 混匀， 尾静脉注射给药， 同时于肿瘤部位定位超声 (1-MHZ、 3.0W/cm2)60s。C 组 ( 阴性 对照组 )， 未给予载药白蛋白纳米粒但给予微泡 Optison 溶液和超声处理的肿瘤模型， 超声 处理过程同 B 组。同时设。
39、置空白对照组， 即未给予药物和超声处理的肿瘤模型裸鼠。肿瘤 裸鼠于 1、 3、 5、 7、 9 天给药一次， 10 天后将瘤体从裸鼠体内剥离， 称重， 计算肿瘤的瘤重相对 生长率。 空白对照组一部分动物于实验开始前将瘤体从裸鼠体内剥离， 称重， 一部分动物于 10 天后将瘤体从裸鼠体内剥离， 称重， 代入以下公式计算。 0054 阿霉素耐药肿瘤总体重量变化率(Wtumor， 最终/W tumor， blank)100， 其中Wtumor， 最终 和 W tumor， blank分别表示各实验组和空白组的肿瘤重量测量值。 0055 正常组织器官重量增长率 (Wbody， 最终-Wtumor， 最。
40、终)-(Wbody， 初始-Wtumor， 初始)/Wbody， 初 始100， 其中 Wbody， 初始和 Wbody， 最终是动物最初重量和试验后重量。Wtumor， 初始和 Wtumor， 最终是动 物肿瘤最初重量和试验后重量。 0056 表 4 阿霉素耐药的肿瘤总体重量变化率和正常组织器官重量增长率 (n 5) 0057 说 明 书 CN 102415987 A CN 102415995 A8/8 页 10 0058 结果见表 4， B 组 ( 载药白蛋白纳米粒 + 微泡 Optison+ 超声 ) 肿瘤重量增加的程 度明显低于A组(载药白蛋白纳米粒)， 而正常组织器官重量增长率明显高于A组(载药白 蛋白纳米粒 )， C 组 ( 阴性对照组 ) 结果与空白对照组结果一致， 表明微泡 Optison 与超声 处理， 不具有影响阿霉素耐药肿瘤裸鼠生长。 从以上结果可见， 结合定位超声和微泡应用的 载药白蛋白纳米粒， 可以降低耐药肿瘤的抗药性， 提高肿瘤药物的治疗效果， 并且减少抗肿 瘤药物对正常组织的毒副作用。 说 明 书 CN 102415987 A 。