一种靶向示踪的多模式诊断纳米影像药物 技术领域 本发明属医学诊断药物领域， 涉及纳米影像药物， 具体涉及一种靶向示踪的多模 式诊断纳米影像药物。本发明包括荧光 / 磁性多模式纳米药物的合成及表征， 体外细胞毒 性检测， 癌细胞内吞效率， 活体内受体介导的跨越血脑屏障功能评价， 纳米影像药物对原位 脑肿瘤的被动及主动受体介导靶向效率， 以及在脑肿瘤多模式示踪过程中的应用。
背景技术
脑神经胶质瘤是脑肿瘤中最常见 ( 总发生率的 69％ ) 和最致命 ( 平均 5 年存活率 为 5％ ) 的一类肿瘤， 其具有高恶性和高复发性特点。 手术切除是目前治疗脑胶质瘤的最主 要手段。但由于脑胶质瘤的弥漫性和浸润性等特点， 手术前对肿瘤的无创精确定位及手术 过程中对肿瘤的准确切除变得十分困难。
磁共振显像 (MRI) 是目前手术前脑胶质瘤定位的主要手段。但临床上使用 MRI 准 确描绘肿瘤的边界受到现有钆造影剂循环时间短、 无靶向特异性和血脑屏障穿透能力差等 因素的限制。研究显示， 多数早期胶质瘤和 20-30％的晚期胶质瘤血脑屏障并未明显破坏， 现有造影剂对此类肿瘤难以有效地实现准确示踪。
有 研 究 发 现 多 肽 angiopep-2 做 为 低 密 度 脂 蛋 白 受 体 相 关 蛋 白 (LRP) 的 配 体 表现出比转铁蛋白 (transferrin) 和抑肽酶 (ApoE) 等脑靶向配体更强的跨血脑屏障 效 率 [Demeule， M et al， J.Pharmacol.Exp.Ther.2008， 324， 1064 ； Demeule， M et al， J.Neurochem.2008， 106， 1534 ； Ke， W et al， Biomaterials 2009， 30， 6976]。更重要的是， LRP 不仅在脑毛细血管内皮细胞上表达， 它在胶质瘤中也高度表达 [Maletinska， L et al， Cancer Res.2000， 60， 2300]。现有技术表明多肽 angiopep-2 作为靶向基团能够有效地提 高基因药物对完好 BBB 的穿越效率 [Jiang， C.et al， Biomaterials， 2008， 29， 238 ； Jiang， C.et al.， Biomaterials， 2009， 30， 6976] 并取得良好的治疗效果。因此标记有 angiopep-2 的影像药物有望通过受体介导作用穿越血脑屏障并对实现对脑胶质瘤的靶向性示踪。
树枝状大分子 (dendrimers) 具有高度支化、 结构规整、 单分散、 多位点修饰， 有单 一的分子量等特点。聚乙二胺树枝状大分子 (PAMAM dendrimer) 做为一种新的药物载体可 以标记多个影像基团或靶向基团 ( 标记位点的多少取决于 PAMAM 的代数 ) 以达到更高的靶 向性和成像灵敏度。已有文献报道 ： 标记有钆配合物的低代数树枝状高分子， 包括 G2( 二 代， 直径 ： 3nm)、 G3( 三代， 5nm) 和 G4( 四代， 6nm) 其在体内循环时间较短并通过肾脏快速排 泄出体外， 但由于减少了血管外渗， 与小分子造影剂如 Gd-DTPA( 二乙烯三胺五乙酸螯合的 钆剂 )， Gd-DOTA(1， 4， 7， 10- 四氮杂环十二烷 -1， 4， 7， 10- 四乙酸螯合的钆剂 ) 相比， 它们 能更好地显示血管结构 ； 中等代数的树枝状高分子造影剂， 包括 Gd-DTPA 标记的 G5( 五代， 7nm) 和 G6( 六代， 9nm) 树枝状高分子， 其体内循环时间延长到 30 分钟以上并通过肾脏和肝 胆管共同排泄出体外 ； 而对于 G7( 七代， 11nm) 和 G8( 八代， 13nm) 等高代数树枝状高分子而 言， 其几乎完全是通过肝胆系统排泄 ； 更高代数的树枝状高分子则被肝脾等的网状内皮系 统所捕获而很难用于影像示踪用途。近年来， 近红外荧光 (Near-Infrared Fluorescence) 探针在生物医学领域的应用 悄然兴起。活体组织对波长范围在 700 ～ 1000nm 的近红外光吸收较弱， 因此近红外荧光能 够穿透较深的组织， 从而得到灵敏度更高， 且信噪比更好的图像。与光学成像技术相比， 磁 共振成像 (MRI) 具有高空间 / 时间分辨率， 无探测深度和角度限制， 易临床转化等优点， 但 灵敏度较低。
综上所述， 研制一类在手术前可对脑肿瘤的位置、 形态及边缘无创示踪的， 并且在 手术过程中可实现影像指导下脑肿瘤准确切除的影像药物对胶质瘤的早期诊断和治疗将 具有重要的意义 ； 构建能够在完整血脑屏障条件下对脑肿瘤实现准确示踪的影像药物对胶 质瘤的早期诊断和手术准确切除显得尤为重要。
目前尚未见有关以 angiopep-2 为 BBB 跨越基团同时标记有光学和顺磁性双功能 影像基团的纳米探针的报道。 发明内容 本发明的目的在于克服现有技术的不足， 提供一种靶向示踪的多模式诊断纳米影 像药物， 尤其涉及具有跨越血脑屏障 (B B B) 能力并标记有光学和磁性双功能影像基团的 纳米影像药物， 其用于原位脑胶质瘤的无创动态示踪， 尤其对血脑屏障未受破坏条件下的 神经胶质瘤具有靶向示踪功能。
本发明所述的血脑屏障未受破坏条件下的神经胶质瘤包括血脑屏障未破坏的毛 细胞型星形细胞瘤 (I 级 ) ； 低度弥漫型星形细胞瘤 (II 级 ) ； 间变型星形细胞瘤 (III 级 ) 和多型性胶质母细胞瘤 (IV 级 )。
具体而言， 本发明的一种靶向示踪的多模式诊断纳米影像药物， 其特征在于， 选择 G5 做为探针载体优化目标影像药物的血循环时间和被动靶向性 (enhanced permeability and retention effect)， 通过下述方法制备 ：
将近红外荧光基团 Cy5.5( 羰花青类近红外荧光染料 5.5) 和 Gd-DOTA 顺磁性基团 标记在 G5 树枝状高分子上， 通过双功能的聚乙二醇 PEG 连接 angiopep-2 多肽和 G5 树枝状 高分子， 制成具有跨越血脑屏障 (BBB) 能力并标记有光学和磁性双功能影像基团的纳米影 像药物。
本发明的纳米影像药物能达到较好的肿瘤示踪信噪比和灵敏度。
本发明中， 具有跨 BBB 功能的目标纳米探针 Den-angio 和不具备跨 BBB 功能的参 比探针合成路线如下 ：
标记 angiopep-2 靶头的纳米探针合成路线未标记 angiopep-2 靶头的参比纳米探针合成路线
本发明所述的目标影像药物的结构为 Den-(NIRP)x-(MRI CA)y-(PEG-angiopep-2)z，
其中， Den ： 代表作为影像药物载体的树枝状高分子， 本发明的一个实施例中， Den 为 2-8 代的聚酰胺胺树枝状高分子 ；
NIRP 为近红外荧光基团， x 代表标记在载体上荧光基团数目， NIRP 以酰胺键形式 标记到树枝状高分子上 ； 所述近红外荧光基团包括 IR783、 Cy5.5 等在内的羰花青类近红外 荧光染料 ；
MRI CA 为 T1 加权磁共振造影基团， y 代表标记在载体上磁共振基团数目 ； 所述 CA 以酰胺键形式标记到树枝状高分子上 ； 所述 MRI CA 为包括 Gd-DOTA 在内的钆金属配合物。
PEG 为 聚 乙 二 醇， angiopep-2 为 可 跨 越 血 脑 屏 障 并 靶 向 脑 肿 瘤 的 肽 链 ； 树枝 状高分子和 angiopep-2 多肽通过双功能化的 PEG 桥连在一起 ； z 代表标记在载体上的 PEG-angiopep-2 数目。
本发明中， 双功能化 PEG 的两端分别是伯胺基和马来酰亚胺 ； 所述 PEG 上伯胺基与
3-(2- 吡啶二巯基 ) 丙酸 N- 羟基琥珀酰亚胺酯反应得到修饰有吡啶二巯基的 PEG ； PEG 上 的马来酰亚胺与树枝状高分子上伯胺基反应得到 Den-PEG 中间产物 ；
本发明中， angiopep-2 肽链其氨基酸序列为 TFFYGGSRGKRNNFKTEEY， 在其 C 端引 入半胱氨酸得到序列为 TFFYGGSRGKRNNFKTEEYC 的新肽链 ； 新肽链半胱氨酸上的巯基与标 记在树枝状高分子上的 2- 吡啶二巯基缩合得到通过 PEG 桥连的 Den-PEG-angiopep-2 化合 物。
本发明中， 标记在影像纳米药物上的 angiopep-2 可特异性识别脑血管内皮细胞 和脑胶质瘤细胞上低密度脂蛋白相关受体， 是实现跨血脑屏障的和肿瘤靶向性的关键。
本发明中， 多模式指磁共振成像和近红外荧光光学成像， 诊断药物可被磁共振成 像和光学成像同时无创监测。
本发明中， 纳米药物上标记的 angiopep-2 肽链可与脑血管内皮细胞上表达的 低密度脂蛋白相关受体结合， 并通过受体介导的内吞作用实现跨 BBB 功能 ； 纳米药物由 angiopep-2 肽链引导跨越 BBB 后， 可与脑肿瘤细胞上高表达的低密度脂蛋白相关受体结合 实现探针的肿瘤主动靶向作用。
本发明中， 近红外荧光基团 Cy5.5( 羰花青类近红外荧光染料 5.5) 和 Gd-DOTA 顺 磁性基团被标记在 G5 树枝状高分子上， 具有跨 BBB 功能的 angiopep-2 多肽和树枝状高分 子则通过双功能的聚乙二醇 PEG 连接在一起。 PEG 链不但改善了纳米探针的水溶性， 适当提 高了其血液循环时间， 同时也尽可能减少了树枝状大分子由于立体位阻效应对 angiopep-2 肽链的血脑屏障跨越效率的影响。由于探针上标记了红色荧光基团 rhodamine( 罗丹明 )， 当用荧光显微镜观察离体细胞或组织切片时， 很容易追踪此纳米探针。 本发明还具有如下优点 ：
本发明中采用的光学成像的优点恰好克服 MRI 在示踪灵敏度方面的限制， 而 MR 高 分辩率的优点又弥补了光学成像的不足。因此本发明的多功能分子影像探针技术， 尤其是 将 MR 和光学成像相结合的分子影像探针技术， 既能克服单一成像技术灵敏度或分辨率的 限制， 同时还能通过影像对比得到更丰富的生理和病理信息。与氧化铁产生的 MR 负向信号 相比， 钆配合物产生的 MR 正向信号较少受到病变组织干扰， 且解剖结构清晰、 分辨率高。本 发明以 Gd-DOTA 配合物作为磁共振成像基团， 由于所述的 Gd-DOTA 配合物具有良好的热力 2+ 2+ 学稳定性， 不易与生理内源性的 Zn ， Ca 等离子发生交换并游离出毒性的 Gd3+ 离子。
附图说明
图 1 是 C-angiopep-2 的 ESI-MS 图谱，
其中， 多肽 TFFYGGSRGKRNNFKTEEYC 分子量 ： 2404.6Da。
图 2 是 C-angiopep-2 的分析型 HPLC 图谱，
其中， 色谱方法 ： 色谱柱 ： YMC HPLC COLUMN 150×4.6mml.D ； 流动相 A ： 0.1％ TFA 乙腈溶液 ； 流动相 B ： 0.1％ TFA 水溶液 ； 流速 ： 0.7mL/min ； 时间 ： 45 分钟， 在 214 和 280nm 处 探测 ； 洗脱程序 ： 在 0 到 26 分钟， 洗脱程序从 90％到 65％的 B 线性变化后， 27-32 分钟， 维 持 10％的 B 冲洗柱子， 最后， 用 90％的 B 冲洗柱子至平衡。
图 3 是 C-angiopep-2 的 1H NMR 核磁图。
图 4 是化合物 2 的 1H NMR 核磁图。图 5 是化合物 3 的 1H NMR 核磁图。
图 6 是化合物 4 的 1H NMR 核磁图，
其中， 苯丙氨酸芳香族质子峰在 7.4-6.6ppm。
图 7 是 G5 的 1H NMR 核磁图， 其中， G5 的光谱在 3.3-2.2ppm。 1
图 8 是化合物 7 的 H NMR 核磁图， 其中， PEG 的 O-CH2 基团光谱在 3.7ppm。 1
图 9 是化合物 8 的 H NMR 核磁图。
图 10 是纳米探针的流体动力学粒径分布和 Zeta 电位图，
其中， 用动态光散射的方法来测定纳米探针的流体动力学粒径分布 (A) 和 Zeta 电位 (B)， Den-Angio 和 Den-PEG 的平均粒径分别是 14.2nm 和 9.3nm， 平均 Zeta 电位是 +11.6mV 和 +16.7mV。
图 11 表明纳米探针对人类脑胶质瘤 U87MG 肿瘤细胞的细胞毒性，
其中， Den-Angio 和 Den-PEG 对人类脑胶质瘤 U87MG 肿瘤细胞的细胞毒性均比未 修饰的 G5 明显低， 数据用平均值 ± 方差表示 ( 每个浓度的实验 n ＝ 8)。
图 12 是细胞摄取纳米探针及竞争实验的共聚焦荧光显微镜成像，
其中， Den-Angio 通过 LRP- 受体介导的细胞内吞而高效进入人脑胶质瘤 U87MG 肿 瘤细胞， (A) 对用 2μM Den-Angio 在 4℃培养了 15 分钟的活细胞以及先用 2μM RAP 处理 半小时再用 Den-Angio 处理 15 分钟 ( 均在 4℃ ) 的活细胞进行共聚焦荧光显微镜成像， 标 尺： 20ìm， 用 2μM Den-Angio 或者 Den-PEG 在 37℃处理了 1 小时 (B) 和 24 小时 (C) 的活 细胞的共聚焦荧光显微镜图像 ； (D) 用纳米探针 37℃处理过的活细胞的时间依赖的荧光强 度； 荧光强度用 NIH Image J 软件来定量 ； 数据用平均值 ± 方差表示， n ＞ 32， 标尺 ： 方差。 图 13 表明荷瘤裸鼠注射纳米探针后光学和磁共振成像的 T/N 信号比，
其中， 体内的磁共振和光学成像均证实， Den-Angio 相对于 Den-PEG 有更高的 T/ N 信号比 ； 纳米探针经尾静脉注射后， 体内的时间依赖的标准化的肿瘤和周围正常脑组织 的近红外荧光强度比 (A) 和 T1 加权的磁共振信号比 (B)(T/N 比值 ) ； T/N 值用注射前的比 值标准化， 数据用平均值 ± 方差表示 (n ＝ 3) ； 注射剂量磁共振显像 1.2mg/mouse( 相当于 3+ 0.05mmol[Gd ]/mouse)， 而光学显像 0.4mg/mouse。
图 14 是正常小鼠中， 两种纳米探针在各个时间点 T1 加权的磁共振图像， 以及表明 皮层和海马时间依赖的 T1 加权磁共振信号在各个时间点的变化，
其中， Den-Angio 在血脑屏障完整的正常小鼠中表现出比 Den-PEG 更高的大脑摄 取率 ； (A) 正常小鼠大脑在纳米探针注射前和注射后 30 分钟， 2 小时和 24 小时代表性的 T1 3+ 加权磁共振图像 (1.2mg/mouse， 相当于 0.05mmol[Gd ]/mouse) ； 红色箭头指向脑室， 白色 箭头指向海马 ； (B)&(C) 时间依赖的 T1 加权的磁共振信号在正常小鼠尾静脉注射纳米探针 前、 后在皮层和海马区域的变化 (n ＝ 4)。
图 15 是荷瘤小鼠激光共聚焦荧光显微镜图像，
其中， 共聚焦荧光显微镜图像显示， Den-Angio 比 Den-PEG 显示出更好的脑肿瘤 成像能力 ； 图片显示的是脑部种植有 U87MG 肿瘤的荷瘤裸鼠在尾静脉注射 (4nmol/mouse) Den-Angio( 上排 ) 和 Den-PEG( 下排 )24h 后的荧光显微镜图片 ； 罗丹明标记的探针显示出 红色荧光， 细胞核的 DAPI 染色显示出蓝色荧光 ； 组织切片的核染色有助于界定肿瘤和正常 脑组织的边界。
具体实施方式
通过下述实施例将有助于进一步理解本发明， 但并不限制本发明的内容。
实施例 1 半胱氨酸修饰的可穿越 BBB 多肽 angiopep-2 的合成
为了将具有 BBB 穿越能力的 angiopep-2 修饰到 G5 树枝状高分子上， 同时也不影 响其与低密度脂蛋白相关受体结合的特异性， 采用 Boc 保护的固相多肽合成方法合成 C 端 修饰有一个半胱氨酸残基的 angiopep-2 ： TFFYGGSRGKRNNFKTEEYC(MW ＝ 2402Da)。
1. 称 取 0.156g Boc-L-Cys(pMeBzl)-PAM 树 脂 ( 取 代 度 0.8mmol/g， 约 0.125mmol)， 用 DMF(N， N- 二甲基甲酰胺 ) 溶胀 20 分钟， 并洗涤数次 ；
2. 连续用 TFA( 三氟乙酸 ) 脱保护 2 次， 加量至浸没树脂， 每次搅拌 1 分钟， DMF 洗 涤数次 ；
3. 称取所需氨基酸 1.1mmol， 用 2ml 的 HBTU( 苯并三氮唑 -N， N， N’ ， N’ - 四甲基脲 六氟磷酸盐 ) 和 0.5ml 的 DIEA(N， N- 二异丙基乙胺 ) 溶解， 加入树脂中， 恒温振荡器上反应 20 分钟 ；
4. 用 DMF 洗涤。挑取芝麻大小的树脂进行 NT( 茚三酮 ) 检测确定是否反应完全， NT 检测液 ： A 液为 8ml 苯酚加 2ml 乙醇， B 液为吡啶， C 液为 1g 茚三酮加 10ml 乙醇， NT 检 测： 挑取的树脂中加入 A 液 10ul， B 液 20ul， C 液 10ul， 120℃电烤约 1 分钟， 若树脂变蓝则 反应不完全， 需要重新称取此氨基酸进行反应 ； 若树脂仍为黄色， 则反应完全， 重复 2、 3、 4；
依 次 反 应 的 氨 基 酸 分 别 是 Boc-Tyr(Br-Z)( 有 保 护 基 团 的 酪 氨 酸 )、 Boc-Glu(OcHex)( 有保护基团的谷氨酸 )、 Boc-Glu(OcHex)、 Boc-Thr(Bzl)( 有保护基团的 苏氨酸 )、 Boc-Lys(Cl-Z)( 有保护基团的赖氨酸 )、 Boc-Phe( 有保护基团的苯丙氨酸 )、 Boc-Asn(Xan)-OH( 有保护基团的天冬氨酸 )、 Boc-Asn(Xan)-OH、 Boc-Arg(Tos)-OH( 有保 护基团的精氨酸 )、 Boc-Lys(Cl-Z)、 Boc-Gly( 有保护基团的甘氨酸 )、 Boc-Arg(Tos)-OH、 Boc-Ser(Bzl)( 有 保 护 基 团 的 丝 氨 酸 )、 Boc-Gly、 Boc-Gl y、 Boc-Tyr(Br-Z)、 Boc-Phe、 Boc-Phe、 Boc-Thr(Bzl)， 得到的未去保护的线状肽链为 ： H-Thr(Bzl)-Phe-Phe-Tyr(Br-Z)Gly-Gly-Ser(Bzl)-Arg(Tos)-Gly-Lys(Cl-Z)-Arg(Tos)-Asn(Xan)-Asn(Xan)-Phe-Lys(Cl -Z)-Thr(Bzl)-Glu(OcHex)-Glu(OcHex)-Tyr(Br-Z)-Cys(PMeBzl)-OH ；
5. 同上， 用 TFA 脱保护两次， 用甲醇洗涤树脂数次， 再用之浸泡树脂 15 ～ 20 分钟， 抽干甲醇 ( 约 30 分钟 )， 放入塑料筒中， 并加入适量的 p-cresol(4- 甲基苯酚 )、 加入磁子， 挂到切割仪上， 并使塑料筒浸没入液氮中， 抽真空， 通 HF( 氢氟酸 )， 待 HF 在塑料筒中冷凝约 2ml， 关闭 HF， 在冰水浴中磁力搅拌 1 小时， 抽吸 HF( 约 30 分钟 )， 冰乙醚沉淀产物， 用砂芯 漏斗过滤得沉淀， 适量 50％乙腈溶解， 旋蒸去乙腈， 冻干， 得到粗产物约 280mg。
6. 称取 100mg 粗产物， 适量蒸馏水溶解， 制备型 HPLC( 高效液相色谱仪 ) 纯化、 冻 3+ 干， 产物的纯度通过分析型 HPLC 证实 ； ESI-MS 中有一个单一的 802.5[M ] 峰， 计算分子量 + 1 为 2404.6[M+H ]， ESI-MS 和分析型 HPLC 结果如图 1、 2 所示 ； C-angiopep-2 的 HNMR 核磁图 如图 3 所示。
制 备 型 HPLC 纯 化 方 法 ： 制备柱 ： SymmetryR 300A C187μm 19×300mm steal Column ； 流动相 A ： 5％乙腈， 流动相 B ： 35％乙腈 ； 洗脱程序 ： 0-60 分钟 0％ B-100％ B ； 流速 ： 10ml/min ； 柱温 ： 25℃ ； 检测 ： UV 214nm 和 280nm。分析型 HPLC 方法 ： 如图 2 所示。
实施例 2 化合物 1 的合成
2.1mg(6.8×10-6mol， 1.3 倍 ) 的 SPDP(N- 琥珀酰亚胺基 3-(2- 吡啶基二硫 ) 丙酸 酯溶于 300μL 的 DMF 中， 缓慢逐滴加入磁力搅拌下的 1.0mL 的 10.4mg(5.2×10-6mol， 分子 2k 2k 量认为是 2KDa)NH2-PEG -Malemide( 氨基 - 聚乙二醇 - 马来酰亚胺 ) 的 1X PBS(pH 7.4) 溶液中。常温下反应 45 分钟后， 形成一端是马来酰亚胺， 另一端是 3-(2- 吡啶基二硫 ) 丙 酸酯的 PEG 衍生物。
实施例 3 化合物 2 的合成
将以上反应液直接加入 1.0mL 的 11.6mg(4×10-7mol) 的树枝状大分子 PAMAM G5 的 1X PBS(pH 7.4 ～ 8.0) 溶液中。 常温下搅拌 1 小时后， 形成化合物 2， 其中 SPDP 通过 PEG 连接到 G5 树枝状高分子表面。用分子量为 10， 000Da 的滤膜超滤管离心纯化 (4000 转 / 分 钟， 30 分钟 ×3 次 ) 得到目标产物。G5 和 PEG 之间的摩尔比通过化合物 2 的 1H NMR 图谱 中的质子积分来计算。化合物 2 中 SPDP 的标记水平通过 DTT( 二硫苏糖醇 ) 实验来定量。 简化的操作过程为 ： 过量的 DTT 加入化合物 2 的 PBS 溶液中， 搅拌 15 分钟， 测量上述溶液在 343nm 处的吸光度。SPDP 和 G5 之间的摩尔比通过公式 R ＝ ΔA343/8080×Cdendrimer 来计算， R 代表摩尔比， ΔA343 代表 DTT 加入前后 343nm 处吸光度的变化， Cdendrimer 代表 G5 的摩尔浓 度， 数值 8080 代表吡啶 -2- 硫酮在 343nm 处的消光系数。实验结果表明平均每个 G5 上标 记有 8 个 SPDP。化合物 2 的 1H NMR 核磁图如图 4 所示。
实施例 4 化合物 3 的合成
0.4mg(8×10-7mol， 2.0 倍 .) 的 rhodamine-NHS( 罗丹明 -N- 羟基琥珀酰亚胺酯 ) -7 和 1.2mg(8.0×10 mol， 2.0 倍 ) 的 Cy5.5-NHS 溶解在 50μL 无水 DMF 中， 然后缓慢逐滴加 入 1.0mL 化合物 2 的 HEPES(4- 羟乙基哌嗪乙磺酸 ) 缓冲液 (0.1M， pH 8.3)。常温下搅拌 1 小时， 荧光基团标记的 G5 用分子量 10， 000Da 的超滤管纯化 (4000 转 / 分钟 )， 并浓缩到约 -5 2.0mL 0.5M 的 HEPES 中 (pH 8.3)。50.7mg(5.12×10 mol， 128 倍 .)DOTA-NHS 白色粉末逐 渐加入到上述溶液中， pH 计监测溶液的 pH 值， 并用 5.0M NaOH( 氢氧化钠 ) 调节溶液 pH 值 在 8.5 左右。常温下避光搅拌 4 小时后， 混合物用分子量 10， 000Da 的离心超滤管纯化得到 罗丹明、 Cy5.5 和 DOTA 修饰的紫色树枝状大分子 3 溶液。通过对 1H NMR 光谱计算得出每个 G5 分子上标记了约 94 个 DOTA 螯合剂。另外， 根据朗伯 - 比尔定律， 平均有 1.4 个罗丹明和 1.1 个 Cy5.5 标记到化合物 3 上。罗丹明和 Cy5.5 在水溶液中的吸光系数分别为 (ε552 ＝ 60， 000M-1cm-1) 和 (ε675 ＝ 250， 000M-1cm-1)。化合物 3 的 1H NMR 核磁图如图 5 所示。
实施例 5 化合物 4 的合成
将化合物 3 溶解在 2mL 的 PBS 溶液中， 同时逐滴加入溶解于 200μL DMF 中的 -6 Cysteine-angiopep-2(12mg， 5.2×10 mol， 13 倍 .)。 室温下避光搅拌过夜。 Angiopep-2 标 1 记的 G5 化合物经超滤纯化后， 化合物 4 中的多肽 angiopep-2 标记率通过 H NMR 谱图加以 计算。化合物四种， 平均有 5.6 个 angiopep-2 标记到一个 G5 分子上。
化合物 4 的 1H NMR 核磁图如图 6 所示。
实施例 6 化合物 5 的合成
12.7mg Gd2(CO3)3(6×10-5mol， 64 倍 .) 加入溶于 2mL 化合物 4 溶液中。此悬浊液 在 60℃下避光搅拌 12 小时。多余的 Gd2(CO3)3 离心除去 (2000 转 / 分钟， 8 分钟 )， 上清液经超滤纯化后， 获得 Den-Angio 化合物， 产率大约为 82％ ( 根据 G5 计算 )。
实施例 7 化合物 6 的合成
0.4mg(8×10-7mol， 2.0 倍 .)rhodamine-NHS 溶于 50μL 无水 DMF 中， 并缓慢逐滴加 -7 入到 1mL 11.6mg(4×10 mol)G5(0.1M HEPES) 中 (pH 8.3)。常温下搅拌 1 小时后， 混合液 -7 离心超滤纯化得到罗丹明标记的 G5 树枝状高分子。 1.2mg(8.0×10 mol， 2.0 倍 )Cy5.5-NHS 溶于 50μL 无水 DMF 中， 同上述反应一样加入到 G5 的 1mL0.1MHEPES 溶液中。常温下搅拌 1 小时后， 连接有双荧光基团的树枝状大分子经超滤纯化得到化合物 6 的紫色溶液。通过吸 光光度法计算平均有 1.5 个罗丹明和 1.1 个 Cy5.5 标记到一个化合物 6 分子上。化合物 6 的 1H NMR 核磁图如图 7 所示。
实施例 8 化合物 7 的合成
化 合 物 6 溶 解 在 2.0mL 1X PBS(pH7.4) 中，加 入 溶 于 2.0mL PBS 中 的 10.4mg(5.2×10-6mol， 13 倍 .)PEG2K-NHS。常温下搅拌 1 小时后， 产物经超滤纯化得到紫色 -7 化合物 7 溶液 ( 产率是 82％， 约 18.9mg， 3.28×10 mol)。化合物 7 中 G5 和 PEG 间的摩尔 1 比通过它们在 H NMR 光谱中的质子积分定量。
化合物 7 的 1H NMR 核磁图如图 8 所示。 实施例 9 化合物 8 的合成
3.28×10-7mol 化 合 物 7 溶 于 2mL 0.5M HEPES 缓 冲 液 中 (pH 8.3)。 41.6mg(4.2×10-5mol， 128 倍 ) 的 DOTA-NHS 以固体形式加入以上溶液中。pH 计监测反应体 系 pH 值， 并用 5.0M NaOH 溶液调节在 8.5 左右。反应液在常温下搅拌过夜， 离心超滤纯化 1 后得到产率为 92％的化合物 8。标记到 G5 上的 DOTA 数量通过 H NMR 谱中的质子积分来 定量， 约为 95 个。
化合物 8 的 1H NMR 核磁图如图 9 所示。
实施例 10 化合物 9 的合成
9.5mg(1.93×10-5mol， 64 倍 .)Gd2(CO3)3 加入到溶于 4mL 0.1M HEPES(pH 8.3) 的 -7 3.0×10 mol( 基于 G5 的摩尔数 ) 的化合物 8 中。此悬浊液在 60℃下避光搅拌 12 小时。多 余的 Gd2(CO3)3 经离心沉淀除去， 上清液经离心超滤纯化， 产率为 95％ ( 基于 G5 的摩尔数 )。
实施例 11 纳米探针粒径分布和 Zeta 电位的测定
纳米探针和未修饰的 G5 树枝状大分子在水溶液中的粒径通过动态光散射的方法 测定。溶于蒸馏水的 2.0mg/ml 的牛血清白蛋白标准溶液对设备进行校准。样品用孔径为 0.45μm 的滤膜纯化后并用 1X PBS 稀释到 100g/mL。纳米探针的粒径和分布通过动态光散 射仪加以测定。在测定纳米探针的表面电荷时， 纳米探针溶液用 0.45μm 的滤头过滤并稀 释到 10mM 的 NaCl 溶液中。
Den-Angio 和 Den-PEG 的平均直径是 14.2nm 和 9.3nm， 平均 Zeta 电位是 +11.6 和 +16.7mV。
纳米探针的粒径分布和 Zeta 电位如图 10 所示。
实施例 12 用 ICP-AES 测定纳米探针中的 Gd3+ 含量
纳米探针中的 Gd3+ 含量用 Hitachi P-4010 型号 ICP-AES(Inductively Coupled Plasma Atomic Emission Spectroscopy， 电感耦合等离子体发射光谱仪 ) 进行测定， 射频 3+ 能量为 1100W， 喷雾器气流速度为 0.9L/min。准备好用 3％硝酸溶解的 Gd 浓度分别为 1，
5， 10， 20， 50， 100， 200ppm 的标准溶液， 标绘相应的色谱峰来绘制标准曲线以对应 Gd3+ 含量。 0.1mM 的纳米探针母液用 3％的硝酸稀释 100 倍。样品的 Gd3+ 含量通过对 Gd3+ 标准曲线拟 合得到。实验结果显示， Gd3+-DOTA 配合物在探针 Den-Angio 和 Den-PEG 中的含量均平均达 95 个。
实施例 13 检测纳米探针的驰豫率
纳米探针和商品化的磁共振造影剂 Gd3+-DOTA 的纵向驰豫率根据方程 r1p ＝ (1/ Tsample-1/TPBS)/[Gd]. 来计算。其中 r1p 为纵向磁豫率， Tsample 为溶液的纵向磁豫时间， TPBS 为 PBS 溶液的磁豫时间。将探针稀释成四种不同浓度的 PBS 溶液 (pH 7.4)， 其 T1 值在 4.7T 3+ 的磁共振上测定。根据 ICP-AES 测定的 Gd 浓度描绘出纳米探针的 (1/Tsample-1/TPBS) 值， 从而得出纳米探针的驰豫率。Gd3+-DOTA， Den-Angio 和 Den-PEG 的纵向驰豫率分别为 4.7， -1 -1 6.9 and 7.4mM s 。
实施例 14 体外细胞毒性实验
1. 细胞培养人类胶质母细胞瘤 U87MG 细胞系用最低基础培养基在 75-cm2 培养瓶 中单层培养， 即用加有 10％胎牛血清 (FBS)、 2mM L- 谷氨酰胺、 1％青、 链霉素 (Invitrogen， Carlsbad， CA) 的 Alpha 1X 培养基 (MEM， Mediatech， Manassas， VA)， 置于有充分湿气的含 5％ CO2 的 37℃培养箱中培养。当细胞长满 80％的面积时可以消化收集， 以使细胞保持在 指数增长状态。
2. 体外细胞毒性实验 MTT(3-(4， 5- 二甲基噻唑 -2)-2， 5- 二苯基四氮唑溴盐 ) 细 胞增殖实验用来测定用纳米探针和未修饰的 G5 对照处理后的细胞的活力。处于指数增长 期的细胞单层用 0.25％胰酶消化收集， 得到单细胞悬液。用血细胞计数器和普通光学显微 镜 (OLYMPUS BH-2) 来计数细胞。优化细胞数量以使得在整个 MTT 实验中， 细胞处于指数增 长期。因此， 用适量细胞培养液重悬细胞， 在 96 孔板的每个孔中加入含有约 2×103 个细胞 的 100μL 单细胞悬液。 每个浓度准备了 8 个复孔。 细胞贴壁 24 小时后， 用纳米探针或者未 修饰的 G5 来处理这些细胞。 样品溶液用 -HV 的 0.22μm 注射器式滤器过滤除菌， 并 细胞用 PBS 且终浓度的梯度范围在 0.05-10μM。在 37℃， 5％ CO2 的培养箱中培养 4 天后， 冲洗干净， 然后用 MTT 来测定细胞的活力。用纳米探针和 G5 处理过的细胞的活力用未处理 过的细胞的值来进行标准化。图 11 显示了细胞毒性。
实施例 15 活细胞摄取纳米探针的共聚焦荧光显微镜成像
为了避免固定过程中出现的假阳性， 所有的实验都在活的 U87MG 细胞中进行。细 4 胞 (2×10 ) 培养在 35mm 的玻璃底培养皿 (14mm 小孔， MatTek， Ashland， MA) 中， 大概长满 皿底的 50％， 用 2ml 溶解有 2μM 纳米探针的 10％ FBS 培养液在 4℃或 37℃培养细胞一定 的时间。孵育结束后， 用 HBSS(Hank’ s Balance Salt Solution， Hank’ s 平衡盐溶液 ) 洗 涤三次， 并加入 1ml 无酚红培养基。立即用共聚焦荧光显微镜观察细胞。
实施例 16 体外细胞摄取纳米探针的竞争实验
培养在 35mm 玻璃底培养皿中的活 U87MG 细胞先用溶解有 2μM 低密度脂蛋白受 体缔合性蛋白 (RAP) 的常规培养液在 4℃培养 30 分钟， RAP 用作 LRP( 低密度脂蛋白受体 相关蛋白 ) 受体的通用拮抗剂。孵育结束后， 洗涤细胞并加入溶解有 2μM RAP 和 2μM Den-Angio 的培养液继续在 4℃培养 15 分钟。孵育结束后， 细胞用 HBSS 洗涤三次， 并用共 聚焦荧光显微镜观察。细胞摄取纳米探针及竞争实验的共聚焦荧光显微镜成像结果如图 12 所示。
实施例 17 小鼠模型和肿瘤原位种植
所有的动物实验都依照复旦大学伦理委员会评估和认可的指南进行。人源 U87MG 胶质细胞瘤细胞 (1.0×106 细胞重悬于 5μl PBS) 在有小鼠衔接器的立体定位仪的协助下 被接种到裸鼠的右侧纹状体 ( 前囟点旁开 1.8mm， 往前 0.6mm， 深 3mm)。接种后 14-18 天， 颅 内肿瘤长到直径 0.2-0.5mm 大小， 即进行显像实验。
实施例 18 体内和离体的光学显像研究
光学显像研究在柯达公司的活体光学成像系统上进行， 设置感光滤光片为 630nm， 而发射谱带通滤色片为 700nm。成像前， 小鼠用氯胺酮 (25mg/kg) 和乙酰丙嗪 (2.5mg/kg) 的混合麻醉剂麻醉， 并且脸朝上固定在成像板上。X 线显像 ( 曝光时间 30 秒 )， 白光摄影 ( 曝光时间 0.2 秒 ) 和近红外荧光显像 ( 曝光时间 15 秒 ) 分别在一样的大小的视野 (FOV) 下摄取 (FOV ＝ 12.8cm， f/stop ＝ 4， Bin ＝ high resolution)， 时间点包括注射前和全身 注射纳米探针后的几个选定的时间点， 每只小鼠注射 4.0nmol 的纳米探针 ( 基于 G5 的摩尔 数 )。X 线成像和近红外荧光成像叠加起来来确定位于颅内部分的大小。时间依赖的肿瘤 和周围正常脑组织的荧光强度比 (T/N 比值 ) 用纳米探针注射前的值进行标准化。最后， 小 鼠被处死并心脏灌流 PFA 进行预固定。小鼠的大脑被小心地剥离出来， 而主要的脏器包括 心、 肝、 脾、 肺、 肾和肌肉则用组织切片器 (Braintree Scientific Inc.， Braintree， MA) 切 成约厚 1-2mm。荧光显微镜下肿瘤和周围正常脑组织的荧光强度由 ImageJ 软件 (National Institutes of Health， Bethesda， MD) 定量。
实施例 19 磁共振成像
体内磁共振成像在 Bruker Biospec 47/30 磁共振仪上进行。实验前， 小鼠尾静 脉用自制的导管系统置管， 该导管系统用一个小的 T 形接头 (Cole-Parmer， Vernon Hills， IL) 连接， 使得纳米探针溶液在装置中的死容积最小化 ( 小于 50μL)。麻醉的小鼠的头被 固定在自制的螺线管线圈里， 小鼠在磁体中的体温通过一个温度调节装置加热板维持， 呼 吸则通过 Bruke PhysioGard 系统进行持续监控。小鼠被安置在磁共振线圈里后， 异氟烷 (0.5-2％ ) 和 100％的氧气一起给予， 并且持续的呼吸监测随时进行调整。 每只老鼠从尾静 3+ 脉注射 0.05mmol/kg[Gd ]， 总共 0.25mL 体积的纳米探针 PBS 溶液， 收集注射前、 后脑部动态 T1 加权像。 观察 T1 加权的磁共振信号在注射后 0-120 分钟和 24 小时的增强情况。 冠状为的 脑部影像以 1mm 厚来获取图像， 使用了一个自旋回波脉冲序列， 视野 (FOV)2cm×2cm， 矩阵 128×128， TR ＝ 300ms， TE ＝ 11ms， NA ＝ 8。3D 的 T1 加权像用一个快速小角度激发成像序 列 (FLASH) 来获得， flip angle ＝ 45°， FOV ＝ 1.5cm×1.5cm×1.5cm， 矩阵 128×128×32， TR ＝ 35ms， TE ＝ 6.2ms， NA ＝ 8。感兴趣区 (ROI) 在时间点的增强强度 (IE) 通过以下公式 表示 IE ＝ (RI(t)-RI(0))/RI(0)×100％， 其中， RI(t) 对应于在各个时间点测定的标准化 的信号强度， 而 RI(0) 是纳米探针注射前标准化的信号强度。时间依赖的肿瘤和周围正常 脑组织之间的荧光强度比 (T/N 比值 ) 用纳米探针注射前的值进行标准化。
光学和磁共振成像的 T/N 信号比变化如图 13 所示。
两种纳米探针在各个时间点 T1 加权的磁共振像， 以及皮层和海马时间依赖的 T1 加权磁共振信号在各个时间点的变化如图 14 所示。
实施例 18 冰冻大脑切片共聚焦显微镜成像体内成像后， 常规处理小鼠大脑， 浸在 4％ PFA( 多聚甲醛 ) 中 12 小时， 再放入 30％ 的蔗糖溶液中脱水至沉底， 然后冰冻切片厚 15μm， 包埋切片并用 Leica TCS SP2 激光共聚 焦显微镜 (Leica Inc.， Wetzlar， Germany) 观察， 所用的镜头是 HCXPL APO CS 40×1.25oil immersion lens 和 HCPL APO CS 10×0.40immersion lens。罗丹明用 543nm 激光激发， 发 射光则用 560nm 带通滤色片的光电倍增管检测。同时， 用 405nm 激光激发 DAPI， 发射光则 用具有 490nm 二色分光镜和 420-480nm 带通滤色片的二级光电倍增管检测。同时， 共聚焦 Z 轴方向进行 0.8μm 厚的扫描。图 15 显示了冰冻切片的激光共聚焦荧光显微镜图像。
实施例 19 组织学成像
用纳米探针处理过的小鼠大脑被离体并浸没在 formalin( 福尔马林 ) 和 PFA 的混 合液中 ( 体积 1 ∶ 9 混合 ) 固定适当时间。固定好的组织用石蜡包埋并切成 3-4μm 厚。切 片进行 H&E 染色， 并用 Leica MZ75 高性能立体显微镜 2.5X 和 5.0X 的物镜观察。
背景技术
脑神经胶质瘤是脑肿瘤中最常见 ( 总发生率的 69％ ) 和最致命 ( 平均 5 年存活率 为 5％ ) 的一类肿瘤， 其具有高恶性和高复发性特点。 手术切除是目前治疗脑胶质瘤的最主 要手段。但由于脑胶质瘤的弥漫性和浸润性等特点， 手术前对肿瘤的无创精确定位及手术 过程中对肿瘤的准确切除变得十分困难。
磁共振显像 (MRI) 是目前手术前脑胶质瘤定位的主要手段。但临床上使用 MRI 准 确描绘肿瘤的边界受到现有钆造影剂循环时间短、 无靶向特异性和血脑屏障穿透能力差等 因素的限制。研究显示， 多数早期胶质瘤和 20-30％的晚期胶质瘤血脑屏障并未明显破坏， 现有造影剂对此类肿瘤难以有效地实现准确示踪。
有 研 究 发 现 多 肽 angiopep-2 做 为 低 密 度 脂 蛋 白 受 体 相 关 蛋 白 (LRP) 的 配 体 表现出比转铁蛋白 (transferrin) 和抑肽酶 (ApoE) 等脑靶向配体更强的跨血脑屏障 效 率 [Demeule， M et al， J.Pharmacol.Exp.Ther.2008， 324， 1064 ； Demeule， M et al， J.Neurochem.2008， 106， 1534 ； Ke， W et al， Biomaterials 2009， 30， 6976]。更重要的是， LRP 不仅在脑毛细血管内皮细胞上表达， 它在胶质瘤中也高度表达 [Maletinska， L et al， Cancer Res.2000， 60， 2300]。现有技术表明多肽 angiopep-2 作为靶向基团能够有效地提 高基因药物对完好 BBB 的穿越效率 [Jiang， C.et al， Biomaterials， 2008， 29， 238 ； Jiang， C.et al.， Biomaterials， 2009， 30， 6976] 并取得良好的治疗效果。因此标记有 angiopep-2 的影像药物有望通过受体介导作用穿越血脑屏障并对实现对脑胶质瘤的靶向性示踪。
树枝状大分子 (dendrimers) 具有高度支化、 结构规整、 单分散、 多位点修饰， 有单 一的分子量等特点。聚乙二胺树枝状大分子 (PAMAM dendrimer) 做为一种新的药物载体可 以标记多个影像基团或靶向基团 ( 标记位点的多少取决于 PAMAM 的代数 ) 以达到更高的靶 向性和成像灵敏度。已有文献报道 ： 标记有钆配合物的低代数树枝状高分子， 包括 G2( 二 代， 直径 ： 3nm)、 G3( 三代， 5nm) 和 G4( 四代， 6nm) 其在体内循环时间较短并通过肾脏快速排 泄出体外， 但由于减少了血管外渗， 与小分子造影剂如 Gd-DTPA( 二乙烯三胺五乙酸螯合的 钆剂 )， Gd-DOTA(1， 4， 7， 10- 四氮杂环十二烷 -1， 4， 7， 10- 四乙酸螯合的钆剂 ) 相比， 它们 能更好地显示血管结构 ； 中等代数的树枝状高分子造影剂， 包括 Gd-DTPA 标记的 G5( 五代， 7nm) 和 G6( 六代， 9nm) 树枝状高分子， 其体内循环时间延长到 30 分钟以上并通过肾脏和肝 胆管共同排泄出体外 ； 而对于 G7( 七代， 11nm) 和 G8( 八代， 13nm) 等高代数树枝状高分子而 言， 其几乎完全是通过肝胆系统排泄 ； 更高代数的树枝状高分子则被肝脾等的网状内皮系 统所捕获而很难用于影像示踪用途。近年来， 近红外荧光 (Near-Infrared Fluorescence) 探针在生物医学领域的应用 悄然兴起。活体组织对波长范围在 700 ～ 1000nm 的近红外光吸收较弱， 因此近红外荧光能 够穿透较深的组织， 从而得到灵敏度更高， 且信噪比更好的图像。与光学成像技术相比， 磁 共振成像 (MRI) 具有高空间 / 时间分辨率， 无探测深度和角度限制， 易临床转化等优点， 但 灵敏度较低。
综上所述， 研制一类在手术前可对脑肿瘤的位置、 形态及边缘无创示踪的， 并且在 手术过程中可实现影像指导下脑肿瘤准确切除的影像药物对胶质瘤的早期诊断和治疗将 具有重要的意义 ； 构建能够在完整血脑屏障条件下对脑肿瘤实现准确示踪的影像药物对胶 质瘤的早期诊断和手术准确切除显得尤为重要。
目前尚未见有关以 angiopep-2 为 BBB 跨越基团同时标记有光学和顺磁性双功能 影像基团的纳米探针的报道。 发明内容 本发明的目的在于克服现有技术的不足， 提供一种靶向示踪的多模式诊断纳米影 像药物， 尤其涉及具有跨越血脑屏障 (B B B) 能力并标记有光学和磁性双功能影像基团的 纳米影像药物， 其用于原位脑胶质瘤的无创动态示踪， 尤其对血脑屏障未受破坏条件下的 神经胶质瘤具有靶向示踪功能。
本发明所述的血脑屏障未受破坏条件下的神经胶质瘤包括血脑屏障未破坏的毛 细胞型星形细胞瘤 (I 级 ) ； 低度弥漫型星形细胞瘤 (II 级 ) ； 间变型星形细胞瘤 (III 级 ) 和多型性胶质母细胞瘤 (IV 级 )。
具体而言， 本发明的一种靶向示踪的多模式诊断纳米影像药物， 其特征在于， 选择 G5 做为探针载体优化目标影像药物的血循环时间和被动靶向性 (enhanced permeability and retention effect)， 通过下述方法制备 ：
将近红外荧光基团 Cy5.5( 羰花青类近红外荧光染料 5.5) 和 Gd-DOTA 顺磁性基团 标记在 G5 树枝状高分子上， 通过双功能的聚乙二醇 PEG 连接 angiopep-2 多肽和 G5 树枝状 高分子， 制成具有跨越血脑屏障 (BBB) 能力并标记有光学和磁性双功能影像基团的纳米影 像药物。
本发明的纳米影像药物能达到较好的肿瘤示踪信噪比和灵敏度。
本发明中， 具有跨 BBB 功能的目标纳米探针 Den-angio 和不具备跨 BBB 功能的参 比探针合成路线如下 ：
标记 angiopep-2 靶头的纳米探针合成路线未标记 angiopep-2 靶头的参比纳米探针合成路线
本发明所述的目标影像药物的结构为 Den-(NIRP)x-(MRI CA)y-(PEG-angiopep-2)z，
其中， Den ： 代表作为影像药物载体的树枝状高分子， 本发明的一个实施例中， Den 为 2-8 代的聚酰胺胺树枝状高分子 ；
NIRP 为近红外荧光基团， x 代表标记在载体上荧光基团数目， NIRP 以酰胺键形式 标记到树枝状高分子上 ； 所述近红外荧光基团包括 IR783、 Cy5.5 等在内的羰花青类近红外 荧光染料 ；
MRI CA 为 T1 加权磁共振造影基团， y 代表标记在载体上磁共振基团数目 ； 所述 CA 以酰胺键形式标记到树枝状高分子上 ； 所述 MRI CA 为包括 Gd-DOTA 在内的钆金属配合物。
PEG 为 聚 乙 二 醇， angiopep-2 为 可 跨 越 血 脑 屏 障 并 靶 向 脑 肿 瘤 的 肽 链 ； 树枝 状高分子和 angiopep-2 多肽通过双功能化的 PEG 桥连在一起 ； z 代表标记在载体上的 PEG-angiopep-2 数目。
本发明中， 双功能化 PEG 的两端分别是伯胺基和马来酰亚胺 ； 所述 PEG 上伯胺基与
3-(2- 吡啶二巯基 ) 丙酸 N- 羟基琥珀酰亚胺酯反应得到修饰有吡啶二巯基的 PEG ； PEG 上 的马来酰亚胺与树枝状高分子上伯胺基反应得到 Den-PEG 中间产物 ；
本发明中， angiopep-2 肽链其氨基酸序列为 TFFYGGSRGKRNNFKTEEY， 在其 C 端引 入半胱氨酸得到序列为 TFFYGGSRGKRNNFKTEEYC 的新肽链 ； 新肽链半胱氨酸上的巯基与标 记在树枝状高分子上的 2- 吡啶二巯基缩合得到通过 PEG 桥连的 Den-PEG-angiopep-2 化合 物。
本发明中， 标记在影像纳米药物上的 angiopep-2 可特异性识别脑血管内皮细胞 和脑胶质瘤细胞上低密度脂蛋白相关受体， 是实现跨血脑屏障的和肿瘤靶向性的关键。
本发明中， 多模式指磁共振成像和近红外荧光光学成像， 诊断药物可被磁共振成 像和光学成像同时无创监测。
本发明中， 纳米药物上标记的 angiopep-2 肽链可与脑血管内皮细胞上表达的 低密度脂蛋白相关受体结合， 并通过受体介导的内吞作用实现跨 BBB 功能 ； 纳米药物由 angiopep-2 肽链引导跨越 BBB 后， 可与脑肿瘤细胞上高表达的低密度脂蛋白相关受体结合 实现探针的肿瘤主动靶向作用。
本发明中， 近红外荧光基团 Cy5.5( 羰花青类近红外荧光染料 5.5) 和 Gd-DOTA 顺 磁性基团被标记在 G5 树枝状高分子上， 具有跨 BBB 功能的 angiopep-2 多肽和树枝状高分 子则通过双功能的聚乙二醇 PEG 连接在一起。 PEG 链不但改善了纳米探针的水溶性， 适当提 高了其血液循环时间， 同时也尽可能减少了树枝状大分子由于立体位阻效应对 angiopep-2 肽链的血脑屏障跨越效率的影响。由于探针上标记了红色荧光基团 rhodamine( 罗丹明 )， 当用荧光显微镜观察离体细胞或组织切片时， 很容易追踪此纳米探针。 本发明还具有如下优点 ：
本发明中采用的光学成像的优点恰好克服 MRI 在示踪灵敏度方面的限制， 而 MR 高 分辩率的优点又弥补了光学成像的不足。因此本发明的多功能分子影像探针技术， 尤其是 将 MR 和光学成像相结合的分子影像探针技术， 既能克服单一成像技术灵敏度或分辨率的 限制， 同时还能通过影像对比得到更丰富的生理和病理信息。与氧化铁产生的 MR 负向信号 相比， 钆配合物产生的 MR 正向信号较少受到病变组织干扰， 且解剖结构清晰、 分辨率高。本 发明以 Gd-DOTA 配合物作为磁共振成像基团， 由于所述的 Gd-DOTA 配合物具有良好的热力 2+ 2+ 学稳定性， 不易与生理内源性的 Zn ， Ca 等离子发生交换并游离出毒性的 Gd3+ 离子。
附图说明
图 1 是 C-angiopep-2 的 ESI-MS 图谱，
其中， 多肽 TFFYGGSRGKRNNFKTEEYC 分子量 ： 2404.6Da。
图 2 是 C-angiopep-2 的分析型 HPLC 图谱，
其中， 色谱方法 ： 色谱柱 ： YMC HPLC COLUMN 150×4.6mml.D ； 流动相 A ： 0.1％ TFA 乙腈溶液 ； 流动相 B ： 0.1％ TFA 水溶液 ； 流速 ： 0.7mL/min ； 时间 ： 45 分钟， 在 214 和 280nm 处 探测 ； 洗脱程序 ： 在 0 到 26 分钟， 洗脱程序从 90％到 65％的 B 线性变化后， 27-32 分钟， 维 持 10％的 B 冲洗柱子， 最后， 用 90％的 B 冲洗柱子至平衡。
图 3 是 C-angiopep-2 的 1H NMR 核磁图。
图 4 是化合物 2 的 1H NMR 核磁图。图 5 是化合物 3 的 1H NMR 核磁图。
图 6 是化合物 4 的 1H NMR 核磁图，
其中， 苯丙氨酸芳香族质子峰在 7.4-6.6ppm。
图 7 是 G5 的 1H NMR 核磁图， 其中， G5 的光谱在 3.3-2.2ppm。 1
图 8 是化合物 7 的 H NMR 核磁图， 其中， PEG 的 O-CH2 基团光谱在 3.7ppm。 1
图 9 是化合物 8 的 H NMR 核磁图。
图 10 是纳米探针的流体动力学粒径分布和 Zeta 电位图，
其中， 用动态光散射的方法来测定纳米探针的流体动力学粒径分布 (A) 和 Zeta 电位 (B)， Den-Angio 和 Den-PEG 的平均粒径分别是 14.2nm 和 9.3nm， 平均 Zeta 电位是 +11.6mV 和 +16.7mV。
图 11 表明纳米探针对人类脑胶质瘤 U87MG 肿瘤细胞的细胞毒性，
其中， Den-Angio 和 Den-PEG 对人类脑胶质瘤 U87MG 肿瘤细胞的细胞毒性均比未 修饰的 G5 明显低， 数据用平均值 ± 方差表示 ( 每个浓度的实验 n ＝ 8)。
图 12 是细胞摄取纳米探针及竞争实验的共聚焦荧光显微镜成像，
其中， Den-Angio 通过 LRP- 受体介导的细胞内吞而高效进入人脑胶质瘤 U87MG 肿 瘤细胞， (A) 对用 2μM Den-Angio 在 4℃培养了 15 分钟的活细胞以及先用 2μM RAP 处理 半小时再用 Den-Angio 处理 15 分钟 ( 均在 4℃ ) 的活细胞进行共聚焦荧光显微镜成像， 标 尺： 20ìm， 用 2μM Den-Angio 或者 Den-PEG 在 37℃处理了 1 小时 (B) 和 24 小时 (C) 的活 细胞的共聚焦荧光显微镜图像 ； (D) 用纳米探针 37℃处理过的活细胞的时间依赖的荧光强 度； 荧光强度用 NIH Image J 软件来定量 ； 数据用平均值 ± 方差表示， n ＞ 32， 标尺 ： 方差。 图 13 表明荷瘤裸鼠注射纳米探针后光学和磁共振成像的 T/N 信号比，
其中， 体内的磁共振和光学成像均证实， Den-Angio 相对于 Den-PEG 有更高的 T/ N 信号比 ； 纳米探针经尾静脉注射后， 体内的时间依赖的标准化的肿瘤和周围正常脑组织 的近红外荧光强度比 (A) 和 T1 加权的磁共振信号比 (B)(T/N 比值 ) ； T/N 值用注射前的比 值标准化， 数据用平均值 ± 方差表示 (n ＝ 3) ； 注射剂量磁共振显像 1.2mg/mouse( 相当于 3+ 0.05mmol[Gd ]/mouse)， 而光学显像 0.4mg/mouse。
图 14 是正常小鼠中， 两种纳米探针在各个时间点 T1 加权的磁共振图像， 以及表明 皮层和海马时间依赖的 T1 加权磁共振信号在各个时间点的变化，
其中， Den-Angio 在血脑屏障完整的正常小鼠中表现出比 Den-PEG 更高的大脑摄 取率 ； (A) 正常小鼠大脑在纳米探针注射前和注射后 30 分钟， 2 小时和 24 小时代表性的 T1 3+ 加权磁共振图像 (1.2mg/mouse， 相当于 0.05mmol[Gd ]/mouse) ； 红色箭头指向脑室， 白色 箭头指向海马 ； (B)&(C) 时间依赖的 T1 加权的磁共振信号在正常小鼠尾静脉注射纳米探针 前、 后在皮层和海马区域的变化 (n ＝ 4)。
图 15 是荷瘤小鼠激光共聚焦荧光显微镜图像，
其中， 共聚焦荧光显微镜图像显示， Den-Angio 比 Den-PEG 显示出更好的脑肿瘤 成像能力 ； 图片显示的是脑部种植有 U87MG 肿瘤的荷瘤裸鼠在尾静脉注射 (4nmol/mouse) Den-Angio( 上排 ) 和 Den-PEG( 下排 )24h 后的荧光显微镜图片 ； 罗丹明标记的探针显示出 红色荧光， 细胞核的 DAPI 染色显示出蓝色荧光 ； 组织切片的核染色有助于界定肿瘤和正常 脑组织的边界。
具体实施方式
通过下述实施例将有助于进一步理解本发明， 但并不限制本发明的内容。
实施例 1 半胱氨酸修饰的可穿越 BBB 多肽 angiopep-2 的合成
为了将具有 BBB 穿越能力的 angiopep-2 修饰到 G5 树枝状高分子上， 同时也不影 响其与低密度脂蛋白相关受体结合的特异性， 采用 Boc 保护的固相多肽合成方法合成 C 端 修饰有一个半胱氨酸残基的 angiopep-2 ： TFFYGGSRGKRNNFKTEEYC(MW ＝ 2402Da)。
1. 称 取 0.156g Boc-L-Cys(pMeBzl)-PAM 树 脂 ( 取 代 度 0.8mmol/g， 约 0.125mmol)， 用 DMF(N， N- 二甲基甲酰胺 ) 溶胀 20 分钟， 并洗涤数次 ；
2. 连续用 TFA( 三氟乙酸 ) 脱保护 2 次， 加量至浸没树脂， 每次搅拌 1 分钟， DMF 洗 涤数次 ；
3. 称取所需氨基酸 1.1mmol， 用 2ml 的 HBTU( 苯并三氮唑 -N， N， N’ ， N’ - 四甲基脲 六氟磷酸盐 ) 和 0.5ml 的 DIEA(N， N- 二异丙基乙胺 ) 溶解， 加入树脂中， 恒温振荡器上反应 20 分钟 ；
4. 用 DMF 洗涤。挑取芝麻大小的树脂进行 NT( 茚三酮 ) 检测确定是否反应完全， NT 检测液 ： A 液为 8ml 苯酚加 2ml 乙醇， B 液为吡啶， C 液为 1g 茚三酮加 10ml 乙醇， NT 检 测： 挑取的树脂中加入 A 液 10ul， B 液 20ul， C 液 10ul， 120℃电烤约 1 分钟， 若树脂变蓝则 反应不完全， 需要重新称取此氨基酸进行反应 ； 若树脂仍为黄色， 则反应完全， 重复 2、 3、 4；
依 次 反 应 的 氨 基 酸 分 别 是 Boc-Tyr(Br-Z)( 有 保 护 基 团 的 酪 氨 酸 )、 Boc-Glu(OcHex)( 有保护基团的谷氨酸 )、 Boc-Glu(OcHex)、 Boc-Thr(Bzl)( 有保护基团的 苏氨酸 )、 Boc-Lys(Cl-Z)( 有保护基团的赖氨酸 )、 Boc-Phe( 有保护基团的苯丙氨酸 )、 Boc-Asn(Xan)-OH( 有保护基团的天冬氨酸 )、 Boc-Asn(Xan)-OH、 Boc-Arg(Tos)-OH( 有保 护基团的精氨酸 )、 Boc-Lys(Cl-Z)、 Boc-Gly( 有保护基团的甘氨酸 )、 Boc-Arg(Tos)-OH、 Boc-Ser(Bzl)( 有 保 护 基 团 的 丝 氨 酸 )、 Boc-Gly、 Boc-Gl y、 Boc-Tyr(Br-Z)、 Boc-Phe、 Boc-Phe、 Boc-Thr(Bzl)， 得到的未去保护的线状肽链为 ： H-Thr(Bzl)-Phe-Phe-Tyr(Br-Z)Gly-Gly-Ser(Bzl)-Arg(Tos)-Gly-Lys(Cl-Z)-Arg(Tos)-Asn(Xan)-Asn(Xan)-Phe-Lys(Cl -Z)-Thr(Bzl)-Glu(OcHex)-Glu(OcHex)-Tyr(Br-Z)-Cys(PMeBzl)-OH ；
5. 同上， 用 TFA 脱保护两次， 用甲醇洗涤树脂数次， 再用之浸泡树脂 15 ～ 20 分钟， 抽干甲醇 ( 约 30 分钟 )， 放入塑料筒中， 并加入适量的 p-cresol(4- 甲基苯酚 )、 加入磁子， 挂到切割仪上， 并使塑料筒浸没入液氮中， 抽真空， 通 HF( 氢氟酸 )， 待 HF 在塑料筒中冷凝约 2ml， 关闭 HF， 在冰水浴中磁力搅拌 1 小时， 抽吸 HF( 约 30 分钟 )， 冰乙醚沉淀产物， 用砂芯 漏斗过滤得沉淀， 适量 50％乙腈溶解， 旋蒸去乙腈， 冻干， 得到粗产物约 280mg。
6. 称取 100mg 粗产物， 适量蒸馏水溶解， 制备型 HPLC( 高效液相色谱仪 ) 纯化、 冻 3+ 干， 产物的纯度通过分析型 HPLC 证实 ； ESI-MS 中有一个单一的 802.5[M ] 峰， 计算分子量 + 1 为 2404.6[M+H ]， ESI-MS 和分析型 HPLC 结果如图 1、 2 所示 ； C-angiopep-2 的 HNMR 核磁图 如图 3 所示。
制 备 型 HPLC 纯 化 方 法 ： 制备柱 ： SymmetryR 300A C187μm 19×300mm steal Column ； 流动相 A ： 5％乙腈， 流动相 B ： 35％乙腈 ； 洗脱程序 ： 0-60 分钟 0％ B-100％ B ； 流速 ： 10ml/min ； 柱温 ： 25℃ ； 检测 ： UV 214nm 和 280nm。分析型 HPLC 方法 ： 如图 2 所示。
实施例 2 化合物 1 的合成
2.1mg(6.8×10-6mol， 1.3 倍 ) 的 SPDP(N- 琥珀酰亚胺基 3-(2- 吡啶基二硫 ) 丙酸 酯溶于 300μL 的 DMF 中， 缓慢逐滴加入磁力搅拌下的 1.0mL 的 10.4mg(5.2×10-6mol， 分子 2k 2k 量认为是 2KDa)NH2-PEG -Malemide( 氨基 - 聚乙二醇 - 马来酰亚胺 ) 的 1X PBS(pH 7.4) 溶液中。常温下反应 45 分钟后， 形成一端是马来酰亚胺， 另一端是 3-(2- 吡啶基二硫 ) 丙 酸酯的 PEG 衍生物。
实施例 3 化合物 2 的合成
将以上反应液直接加入 1.0mL 的 11.6mg(4×10-7mol) 的树枝状大分子 PAMAM G5 的 1X PBS(pH 7.4 ～ 8.0) 溶液中。 常温下搅拌 1 小时后， 形成化合物 2， 其中 SPDP 通过 PEG 连接到 G5 树枝状高分子表面。用分子量为 10， 000Da 的滤膜超滤管离心纯化 (4000 转 / 分 钟， 30 分钟 ×3 次 ) 得到目标产物。G5 和 PEG 之间的摩尔比通过化合物 2 的 1H NMR 图谱 中的质子积分来计算。化合物 2 中 SPDP 的标记水平通过 DTT( 二硫苏糖醇 ) 实验来定量。 简化的操作过程为 ： 过量的 DTT 加入化合物 2 的 PBS 溶液中， 搅拌 15 分钟， 测量上述溶液在 343nm 处的吸光度。SPDP 和 G5 之间的摩尔比通过公式 R ＝ ΔA343/8080×Cdendrimer 来计算， R 代表摩尔比， ΔA343 代表 DTT 加入前后 343nm 处吸光度的变化， Cdendrimer 代表 G5 的摩尔浓 度， 数值 8080 代表吡啶 -2- 硫酮在 343nm 处的消光系数。实验结果表明平均每个 G5 上标 记有 8 个 SPDP。化合物 2 的 1H NMR 核磁图如图 4 所示。
实施例 4 化合物 3 的合成
0.4mg(8×10-7mol， 2.0 倍 .) 的 rhodamine-NHS( 罗丹明 -N- 羟基琥珀酰亚胺酯 ) -7 和 1.2mg(8.0×10 mol， 2.0 倍 ) 的 Cy5.5-NHS 溶解在 50μL 无水 DMF 中， 然后缓慢逐滴加 入 1.0mL 化合物 2 的 HEPES(4- 羟乙基哌嗪乙磺酸 ) 缓冲液 (0.1M， pH 8.3)。常温下搅拌 1 小时， 荧光基团标记的 G5 用分子量 10， 000Da 的超滤管纯化 (4000 转 / 分钟 )， 并浓缩到约 -5 2.0mL 0.5M 的 HEPES 中 (pH 8.3)。50.7mg(5.12×10 mol， 128 倍 .)DOTA-NHS 白色粉末逐 渐加入到上述溶液中， pH 计监测溶液的 pH 值， 并用 5.0M NaOH( 氢氧化钠 ) 调节溶液 pH 值 在 8.5 左右。常温下避光搅拌 4 小时后， 混合物用分子量 10， 000Da 的离心超滤管纯化得到 罗丹明、 Cy5.5 和 DOTA 修饰的紫色树枝状大分子 3 溶液。通过对 1H NMR 光谱计算得出每个 G5 分子上标记了约 94 个 DOTA 螯合剂。另外， 根据朗伯 - 比尔定律， 平均有 1.4 个罗丹明和 1.1 个 Cy5.5 标记到化合物 3 上。罗丹明和 Cy5.5 在水溶液中的吸光系数分别为 (ε552 ＝ 60， 000M-1cm-1) 和 (ε675 ＝ 250， 000M-1cm-1)。化合物 3 的 1H NMR 核磁图如图 5 所示。
实施例 5 化合物 4 的合成
将化合物 3 溶解在 2mL 的 PBS 溶液中， 同时逐滴加入溶解于 200μL DMF 中的 -6 Cysteine-angiopep-2(12mg， 5.2×10 mol， 13 倍 .)。 室温下避光搅拌过夜。 Angiopep-2 标 1 记的 G5 化合物经超滤纯化后， 化合物 4 中的多肽 angiopep-2 标记率通过 H NMR 谱图加以 计算。化合物四种， 平均有 5.6 个 angiopep-2 标记到一个 G5 分子上。
化合物 4 的 1H NMR 核磁图如图 6 所示。
实施例 6 化合物 5 的合成
12.7mg Gd2(CO3)3(6×10-5mol， 64 倍 .) 加入溶于 2mL 化合物 4 溶液中。此悬浊液 在 60℃下避光搅拌 12 小时。多余的 Gd2(CO3)3 离心除去 (2000 转 / 分钟， 8 分钟 )， 上清液经超滤纯化后， 获得 Den-Angio 化合物， 产率大约为 82％ ( 根据 G5 计算 )。
实施例 7 化合物 6 的合成
0.4mg(8×10-7mol， 2.0 倍 .)rhodamine-NHS 溶于 50μL 无水 DMF 中， 并缓慢逐滴加 -7 入到 1mL 11.6mg(4×10 mol)G5(0.1M HEPES) 中 (pH 8.3)。常温下搅拌 1 小时后， 混合液 -7 离心超滤纯化得到罗丹明标记的 G5 树枝状高分子。 1.2mg(8.0×10 mol， 2.0 倍 )Cy5.5-NHS 溶于 50μL 无水 DMF 中， 同上述反应一样加入到 G5 的 1mL0.1MHEPES 溶液中。常温下搅拌 1 小时后， 连接有双荧光基团的树枝状大分子经超滤纯化得到化合物 6 的紫色溶液。通过吸 光光度法计算平均有 1.5 个罗丹明和 1.1 个 Cy5.5 标记到一个化合物 6 分子上。化合物 6 的 1H NMR 核磁图如图 7 所示。
实施例 8 化合物 7 的合成
化 合 物 6 溶 解 在 2.0mL 1X PBS(pH7.4) 中，加 入 溶 于 2.0mL PBS 中 的 10.4mg(5.2×10-6mol， 13 倍 .)PEG2K-NHS。常温下搅拌 1 小时后， 产物经超滤纯化得到紫色 -7 化合物 7 溶液 ( 产率是 82％， 约 18.9mg， 3.28×10 mol)。化合物 7 中 G5 和 PEG 间的摩尔 1 比通过它们在 H NMR 光谱中的质子积分定量。
化合物 7 的 1H NMR 核磁图如图 8 所示。 实施例 9 化合物 8 的合成
3.28×10-7mol 化 合 物 7 溶 于 2mL 0.5M HEPES 缓 冲 液 中 (pH 8.3)。 41.6mg(4.2×10-5mol， 128 倍 ) 的 DOTA-NHS 以固体形式加入以上溶液中。pH 计监测反应体 系 pH 值， 并用 5.0M NaOH 溶液调节在 8.5 左右。反应液在常温下搅拌过夜， 离心超滤纯化 1 后得到产率为 92％的化合物 8。标记到 G5 上的 DOTA 数量通过 H NMR 谱中的质子积分来 定量， 约为 95 个。
化合物 8 的 1H NMR 核磁图如图 9 所示。
实施例 10 化合物 9 的合成
9.5mg(1.93×10-5mol， 64 倍 .)Gd2(CO3)3 加入到溶于 4mL 0.1M HEPES(pH 8.3) 的 -7 3.0×10 mol( 基于 G5 的摩尔数 ) 的化合物 8 中。此悬浊液在 60℃下避光搅拌 12 小时。多 余的 Gd2(CO3)3 经离心沉淀除去， 上清液经离心超滤纯化， 产率为 95％ ( 基于 G5 的摩尔数 )。
实施例 11 纳米探针粒径分布和 Zeta 电位的测定
纳米探针和未修饰的 G5 树枝状大分子在水溶液中的粒径通过动态光散射的方法 测定。溶于蒸馏水的 2.0mg/ml 的牛血清白蛋白标准溶液对设备进行校准。样品用孔径为 0.45μm 的滤膜纯化后并用 1X PBS 稀释到 100g/mL。纳米探针的粒径和分布通过动态光散 射仪加以测定。在测定纳米探针的表面电荷时， 纳米探针溶液用 0.45μm 的滤头过滤并稀 释到 10mM 的 NaCl 溶液中。
Den-Angio 和 Den-PEG 的平均直径是 14.2nm 和 9.3nm， 平均 Zeta 电位是 +11.6 和 +16.7mV。
纳米探针的粒径分布和 Zeta 电位如图 10 所示。
实施例 12 用 ICP-AES 测定纳米探针中的 Gd3+ 含量
纳米探针中的 Gd3+ 含量用 Hitachi P-4010 型号 ICP-AES(Inductively Coupled Plasma Atomic Emission Spectroscopy， 电感耦合等离子体发射光谱仪 ) 进行测定， 射频 3+ 能量为 1100W， 喷雾器气流速度为 0.9L/min。准备好用 3％硝酸溶解的 Gd 浓度分别为 1，
5， 10， 20， 50， 100， 200ppm 的标准溶液， 标绘相应的色谱峰来绘制标准曲线以对应 Gd3+ 含量。 0.1mM 的纳米探针母液用 3％的硝酸稀释 100 倍。样品的 Gd3+ 含量通过对 Gd3+ 标准曲线拟 合得到。实验结果显示， Gd3+-DOTA 配合物在探针 Den-Angio 和 Den-PEG 中的含量均平均达 95 个。
实施例 13 检测纳米探针的驰豫率
纳米探针和商品化的磁共振造影剂 Gd3+-DOTA 的纵向驰豫率根据方程 r1p ＝ (1/ Tsample-1/TPBS)/[Gd]. 来计算。其中 r1p 为纵向磁豫率， Tsample 为溶液的纵向磁豫时间， TPBS 为 PBS 溶液的磁豫时间。将探针稀释成四种不同浓度的 PBS 溶液 (pH 7.4)， 其 T1 值在 4.7T 3+ 的磁共振上测定。根据 ICP-AES 测定的 Gd 浓度描绘出纳米探针的 (1/Tsample-1/TPBS) 值， 从而得出纳米探针的驰豫率。Gd3+-DOTA， Den-Angio 和 Den-PEG 的纵向驰豫率分别为 4.7， -1 -1 6.9 and 7.4mM s 。
实施例 14 体外细胞毒性实验
1. 细胞培养人类胶质母细胞瘤 U87MG 细胞系用最低基础培养基在 75-cm2 培养瓶 中单层培养， 即用加有 10％胎牛血清 (FBS)、 2mM L- 谷氨酰胺、 1％青、 链霉素 (Invitrogen， Carlsbad， CA) 的 Alpha 1X 培养基 (MEM， Mediatech， Manassas， VA)， 置于有充分湿气的含 5％ CO2 的 37℃培养箱中培养。当细胞长满 80％的面积时可以消化收集， 以使细胞保持在 指数增长状态。
2. 体外细胞毒性实验 MTT(3-(4， 5- 二甲基噻唑 -2)-2， 5- 二苯基四氮唑溴盐 ) 细 胞增殖实验用来测定用纳米探针和未修饰的 G5 对照处理后的细胞的活力。处于指数增长 期的细胞单层用 0.25％胰酶消化收集， 得到单细胞悬液。用血细胞计数器和普通光学显微 镜 (OLYMPUS BH-2) 来计数细胞。优化细胞数量以使得在整个 MTT 实验中， 细胞处于指数增 长期。因此， 用适量细胞培养液重悬细胞， 在 96 孔板的每个孔中加入含有约 2×103 个细胞 的 100μL 单细胞悬液。 每个浓度准备了 8 个复孔。 细胞贴壁 24 小时后， 用纳米探针或者未 修饰的 G5 来处理这些细胞。 样品溶液用 -HV 的 0.22μm 注射器式滤器过滤除菌， 并 细胞用 PBS 且终浓度的梯度范围在 0.05-10μM。在 37℃， 5％ CO2 的培养箱中培养 4 天后， 冲洗干净， 然后用 MTT 来测定细胞的活力。用纳米探针和 G5 处理过的细胞的活力用未处理 过的细胞的值来进行标准化。图 11 显示了细胞毒性。
实施例 15 活细胞摄取纳米探针的共聚焦荧光显微镜成像
为了避免固定过程中出现的假阳性， 所有的实验都在活的 U87MG 细胞中进行。细 4 胞 (2×10 ) 培养在 35mm 的玻璃底培养皿 (14mm 小孔， MatTek， Ashland， MA) 中， 大概长满 皿底的 50％， 用 2ml 溶解有 2μM 纳米探针的 10％ FBS 培养液在 4℃或 37℃培养细胞一定 的时间。孵育结束后， 用 HBSS(Hank’ s Balance Salt Solution， Hank’ s 平衡盐溶液 ) 洗 涤三次， 并加入 1ml 无酚红培养基。立即用共聚焦荧光显微镜观察细胞。
实施例 16 体外细胞摄取纳米探针的竞争实验
培养在 35mm 玻璃底培养皿中的活 U87MG 细胞先用溶解有 2μM 低密度脂蛋白受 体缔合性蛋白 (RAP) 的常规培养液在 4℃培养 30 分钟， RAP 用作 LRP( 低密度脂蛋白受体 相关蛋白 ) 受体的通用拮抗剂。孵育结束后， 洗涤细胞并加入溶解有 2μM RAP 和 2μM Den-Angio 的培养液继续在 4℃培养 15 分钟。孵育结束后， 细胞用 HBSS 洗涤三次， 并用共 聚焦荧光显微镜观察。细胞摄取纳米探针及竞争实验的共聚焦荧光显微镜成像结果如图 12 所示。
实施例 17 小鼠模型和肿瘤原位种植
所有的动物实验都依照复旦大学伦理委员会评估和认可的指南进行。人源 U87MG 胶质细胞瘤细胞 (1.0×106 细胞重悬于 5μl PBS) 在有小鼠衔接器的立体定位仪的协助下 被接种到裸鼠的右侧纹状体 ( 前囟点旁开 1.8mm， 往前 0.6mm， 深 3mm)。接种后 14-18 天， 颅 内肿瘤长到直径 0.2-0.5mm 大小， 即进行显像实验。
实施例 18 体内和离体的光学显像研究
光学显像研究在柯达公司的活体光学成像系统上进行， 设置感光滤光片为 630nm， 而发射谱带通滤色片为 700nm。成像前， 小鼠用氯胺酮 (25mg/kg) 和乙酰丙嗪 (2.5mg/kg) 的混合麻醉剂麻醉， 并且脸朝上固定在成像板上。X 线显像 ( 曝光时间 30 秒 )， 白光摄影 ( 曝光时间 0.2 秒 ) 和近红外荧光显像 ( 曝光时间 15 秒 ) 分别在一样的大小的视野 (FOV) 下摄取 (FOV ＝ 12.8cm， f/stop ＝ 4， Bin ＝ high resolution)， 时间点包括注射前和全身 注射纳米探针后的几个选定的时间点， 每只小鼠注射 4.0nmol 的纳米探针 ( 基于 G5 的摩尔 数 )。X 线成像和近红外荧光成像叠加起来来确定位于颅内部分的大小。时间依赖的肿瘤 和周围正常脑组织的荧光强度比 (T/N 比值 ) 用纳米探针注射前的值进行标准化。最后， 小 鼠被处死并心脏灌流 PFA 进行预固定。小鼠的大脑被小心地剥离出来， 而主要的脏器包括 心、 肝、 脾、 肺、 肾和肌肉则用组织切片器 (Braintree Scientific Inc.， Braintree， MA) 切 成约厚 1-2mm。荧光显微镜下肿瘤和周围正常脑组织的荧光强度由 ImageJ 软件 (National Institutes of Health， Bethesda， MD) 定量。
实施例 19 磁共振成像
体内磁共振成像在 Bruker Biospec 47/30 磁共振仪上进行。实验前， 小鼠尾静 脉用自制的导管系统置管， 该导管系统用一个小的 T 形接头 (Cole-Parmer， Vernon Hills， IL) 连接， 使得纳米探针溶液在装置中的死容积最小化 ( 小于 50μL)。麻醉的小鼠的头被 固定在自制的螺线管线圈里， 小鼠在磁体中的体温通过一个温度调节装置加热板维持， 呼 吸则通过 Bruke PhysioGard 系统进行持续监控。小鼠被安置在磁共振线圈里后， 异氟烷 (0.5-2％ ) 和 100％的氧气一起给予， 并且持续的呼吸监测随时进行调整。 每只老鼠从尾静 3+ 脉注射 0.05mmol/kg[Gd ]， 总共 0.25mL 体积的纳米探针 PBS 溶液， 收集注射前、 后脑部动态 T1 加权像。 观察 T1 加权的磁共振信号在注射后 0-120 分钟和 24 小时的增强情况。 冠状为的 脑部影像以 1mm 厚来获取图像， 使用了一个自旋回波脉冲序列， 视野 (FOV)2cm×2cm， 矩阵 128×128， TR ＝ 300ms， TE ＝ 11ms， NA ＝ 8。3D 的 T1 加权像用一个快速小角度激发成像序 列 (FLASH) 来获得， flip angle ＝ 45°， FOV ＝ 1.5cm×1.5cm×1.5cm， 矩阵 128×128×32， TR ＝ 35ms， TE ＝ 6.2ms， NA ＝ 8。感兴趣区 (ROI) 在时间点的增强强度 (IE) 通过以下公式 表示 IE ＝ (RI(t)-RI(0))/RI(0)×100％， 其中， RI(t) 对应于在各个时间点测定的标准化 的信号强度， 而 RI(0) 是纳米探针注射前标准化的信号强度。时间依赖的肿瘤和周围正常 脑组织之间的荧光强度比 (T/N 比值 ) 用纳米探针注射前的值进行标准化。
光学和磁共振成像的 T/N 信号比变化如图 13 所示。
两种纳米探针在各个时间点 T1 加权的磁共振像， 以及皮层和海马时间依赖的 T1 加权磁共振信号在各个时间点的变化如图 14 所示。
实施例 18 冰冻大脑切片共聚焦显微镜成像体内成像后， 常规处理小鼠大脑， 浸在 4％ PFA( 多聚甲醛 ) 中 12 小时， 再放入 30％ 的蔗糖溶液中脱水至沉底， 然后冰冻切片厚 15μm， 包埋切片并用 Leica TCS SP2 激光共聚 焦显微镜 (Leica Inc.， Wetzlar， Germany) 观察， 所用的镜头是 HCXPL APO CS 40×1.25oil immersion lens 和 HCPL APO CS 10×0.40immersion lens。罗丹明用 543nm 激光激发， 发 射光则用 560nm 带通滤色片的光电倍增管检测。同时， 用 405nm 激光激发 DAPI， 发射光则 用具有 490nm 二色分光镜和 420-480nm 带通滤色片的二级光电倍增管检测。同时， 共聚焦 Z 轴方向进行 0.8μm 厚的扫描。图 15 显示了冰冻切片的激光共聚焦荧光显微镜图像。
实施例 19 组织学成像
用纳米探针处理过的小鼠大脑被离体并浸没在 formalin( 福尔马林 ) 和 PFA 的混 合液中 ( 体积 1 ∶ 9 混合 ) 固定适当时间。固定好的组织用石蜡包埋并切成 3-4μm 厚。切 片进行 H&E 染色， 并用 Leica MZ75 高性能立体显微镜 2.5X 和 5.0X 的物镜观察。
结果显示， 本发明能克服单一成像技术灵敏度或分辨率的限制， 同时还能通过影 像对比得到更丰富的生理和病理信息。14102406949 A CN 102406952
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