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1、(10)申请公布号 CN 102416024 A (43)申请公布日 2012.04.18 CN 102416024 A *CN102416024A* (21)申请号 201110404475.3 (22)申请日 2011.12.08 A61K 35/76(2006.01) A61K 9/14(2006.01) A61K 47/42(2006.01) A61P 31/04(2006.01) (71)申请人 大连理工大学 地址 116024 辽宁省大连市凌工路 2 号 (72)发明人 徐永平 马永生 金礼吉 李淑英 李晓宇 尤建嵩 曹振辉 谭德猛 (74)专利代理机构 大连理工大学专利中心 21。
2、200 代理人 梅洪玉 (54) 发明名称 一种噬菌体口服微球制剂及其制备方法 (57) 摘要 本发明公开了一种噬菌体口服微球制剂及其 制备方法， 其特征是该噬菌体口服微球制剂包括 噬菌体、 载体材料和固化剂 ； 噬菌体为裂菌活性 成分， 其含量为 106-1011PFU/g ； 载体材料为海藻 酸钠与乳清蛋白 ； 固化剂为二价金属阳离子钙。 本发明还公开了这种噬菌体口服微球制剂的制备 方法。本发明的效果和益处是本发明所述微球制 剂可有效保护噬菌体免受胃酸和消化酶的破坏作 用， 并能使噬菌体在动物肠道环境中有效释放 ； 本发明所述口服噬菌体微球制剂的制备方法是在 常温水相环境中完成的， 条件温。
3、和， 避免了高温、 酸和有机溶剂， 因此微囊化过程中噬菌体的生物 活性能够完全保留。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 2 页 CN 102416032 A1/1 页 2 1. 一种噬菌体口服微球制剂， 包括噬菌体、 载体材料和固化剂， 其特征在于 ： 该噬菌体 为裂菌活性成分， 其含量为 106 1011PFU/g ； 载体材料为海藻酸钠与乳清蛋白 ； 固化剂为二 价金属阳离子钙。 2. 如权利要求 1 所述的噬菌体口服微球制剂， 其特征在于 ： 所述微球的粒径为 200 2000m。 3. 制备权利。
4、要求 1 或 2 所述噬菌体口服微球制剂的方法， 其特征在于包括如下步骤 ： (a) 噬菌体悬液制备 ： 将噬菌体按感染负数为 0.01 10 的比例加入到处对数生长期 的宿主菌培养液中， 37震荡培养 4 8h， 得到含有噬菌体的裂解液 ； 然后将裂解液 4、 6500g 离心 10min， 收集上清液 ； 上清液再经 0.22m 水系滤膜过滤后得到噬菌体悬液 ； (b)配制重量体积比为210乳清蛋白水溶液， 并将溶液pH值调至8.09.0， 然后 加热至 80， 并孵育 30 60min， 冷却至常温后备用 ； (c) 将步骤 (b) 所得的乳清蛋白溶液与重量体积比为 2 5的海藻酸钠溶液。
5、等体积 混合 ； (d)将步骤(a)所得噬菌体悬液加入到步骤(c)所得乳清蛋白/海藻酸钠混合溶液中， 搅拌混匀， 真空脱气除去溶液中的气泡 ； (e) 将步骤 (d) 所得含有噬菌体的乳清蛋白 / 海藻酸钠混合溶液制备成微液滴， 滴入 到 50 200mM 的氯化钙溶液中进行固化反应， 得到包埋有噬菌体的乳清蛋白 / 海藻酸钠微 球。 权 利 要 求 书 CN 102416024 A CN 102416032 A1/4 页 3 一种噬菌体口服微球制剂及其制备方法 技术领域 0001 本发明属于生物药物制剂领域， 具体涉及一种噬菌体口服微球制剂及其制备方 法。 背景技术 0002 长期以来动物细。
6、菌性疾病的防治主要依赖于抗生素， 但随之而来的是药物残留、 细菌耐药性、 环境污染等诸多问题。 因此， 积极寻求一种安全有效的新型抗菌制剂用于动物 疾病防治乃当务之急。 0003 噬菌体是一类细菌性病毒， 其中裂解性噬菌体在感染宿主菌后能快速复制增殖， 并最终破裂菌体细胞从而达到抗菌效果。目前噬菌体在防治动物细菌性疾病方面卓有成 效。与传统的抗生素相比， 噬菌体治疗具有特异性强、 自我复制增殖、 安全无残留以及来源 丰富等优势， 因此被认为是一种理想的抗生素替代品。但目前存在的问题是噬菌体缺乏 合适的给药剂型， 尤其是在治疗动物肠道疾病时， 口服噬菌体的活性易遭胃酸和消化酶的 破坏， 丧失抗菌。
7、活性。目前只能通过口服抗酸剂中和胃酸这种原始的方式进行解决 文 献 1 ： Niu YD， Xu Y， McAllister TA， et al.Comparison of fecal versus rectoanal mucosal swab sampling for detecting Escherichia coli O157 ： H7 in experimentally inoculated cattle used in assessing bacteriophage as a mitigation strategy.J Food Prot， 2008， 71 ： 691-698。因此。
8、， 开发口服噬菌体制剂便成为噬菌体治疗领域亟待解 决的问题， 而对噬菌体进行微囊化包埋， 以制备成口服微球制剂不失为一种理想的策略。 0004 微囊化技术是指将固态、 液态以及气体活性物质包裹在天然或合成高分子材料中 形成微小粒子并在特定条件下释放的技术， 目前已广泛应用于口服药物的控制释放， 酶和 细胞的固定化等领域。但迄今尚未见到关于口服微囊化噬菌体的报道。一些病毒微囊化 的研究则主要集中在口服疫苗方面， 且一般是以聚乳酸 - 羟基乙酸 (PLGA) 为载体材料， 采 用乳化 - 溶剂挥发法 (Emulsion-solvent evaporation) 对病毒活疫苗或灭活疫苗进行 包埋， 。
9、但该方法存在包封率低， 微囊化过程中涉及到有机溶媒， 易导致病毒变性或失活等 问题 文献 2 ： Ramya R， Verma PC， Chaturvedi VK， et al.Poly(lactide-co-glycolide) microspheres ： a potent oral delivery system to elicit systemic immune response against inactivated rabies virusJ.Vaccine， 2009， 27(15) ： 2138-2143.。另外， 一 些利用凝聚法在水相体系中制备出的载病毒微球， 如精胺 - 。
10、硫酸软骨素微球， 虽避免了有 机溶媒的使用， 但最大不足是耐酸性差， 且同样存在包埋效率低的问题， 也难以满足噬菌体 口服给药体系的要求 文献 3 ： Moser CA， Speaker TJ， Offit PA.Effect of water-based microencapsulation on protection against EDIM rotavirus challenge in mice. J Virol， 1998， 72(5) ： 3859-3862.。而最近一项关于噬菌体微囊化的研究是以 PLGA 为 材料， 制备噬菌体的鼻腔给药微球， 也不适用于口服给药体系 文献 4 ：。
11、 Puapermpoonsiri U， Spencer J， van der Walle CF.A freeze-dried formulation of bacteriophage encapsulated in biodegradable microspheresJ.Eur J Pharm Biopharm， 2009， 72(1) ： 说 明 书 CN 102416024 A CN 102416032 A2/4 页 4 26-33.。虽然发明人曾经以壳聚糖 - 海藻酸钠微球为载体有效实现对噬菌体 FelixO1 的 微囊化包埋， 并显著提高了噬菌体在模拟胃酸和胆汁中的稳定性， 但作为口服。
12、控释载体， 壳聚糖 - 海藻酸钠微球的不足之处主要在于海藻酸盐与二价金属离子的凝胶反应是可逆 的， 在胃酸生理环境中， 海藻酸钙微球中作为交联剂的 Ca2+会与非凝胶离子 ( 如 Na+， K+) 发生交换反应， 微球结构的稳定性下降， 随着微囊化噬菌体与胃酸接触时间的延长， H+逐 渐扩散至微球内部， 噬菌体活性也逐渐下降， 结果发现微囊化噬菌体 Felix O1 在 pH 2.4 的模拟胃液中孵育 120min 后效价降到检测限以下 文献 5 ： Ma YS， Pacan JC， Wang Q， et al.Microencapsulation of bacteriophage Felix。
13、 O1 into chitosan-alginate microspheres for oral deliveryJ.Appl Environ Microbiol， 2008， 74(15) ： 4799-4805.。为此， 我们需要开发一种改进型噬菌体口服微球制剂， 以进一步提高微囊化 噬菌体在胃液中的稳定性。 发明内容 0005 本发明提供了一种口服噬菌体微球制剂及制备方法， 以解决噬菌体直接口服后活 性易遭胃酸和消化酶的破坏， 丧失抗菌活性的问题。 0006 为实现上述目的， 本发明采取以下技术方案 ： 0007 一种噬菌体口服微球制剂， 包括噬菌体、 载体材料和固化剂， 其中噬菌体为裂。
14、菌活 性成分， 其含量为 106 1011PFU/g ； 载体材料为海藻酸钠与乳清蛋白 ； 固化剂为二价金属阳 离子钙。其中， 所述噬菌体口服微球的粒径可以为 200 2000m。 0008 本发明还提供了本发明所述口服噬菌体微球制剂的制备方法， 包括如下步骤 ： 0009 (a) 噬菌体悬液制备 ： 将噬菌体按感染负数为 0.01 10 的比例加入到处对数生 长期的宿主菌培养液中， 37震荡培养 4 8h， 得到含有噬菌体的裂解液 ； 然后将裂解液 4、 6500g 离心 10min， 收集上清液 ； 上清液再经 0.22m 水系滤膜过滤后得到噬菌体悬 液 ； 0010 (b)配制重量体积比。
15、为210乳清蛋白水溶液， 并将溶液pH值调至8.09.0， 然后加热至 80， 并孵育 30 60min， 冷却至常温后备用 ； 0011 (c) 将步骤 (b) 所得的乳清蛋白溶液与重量体积比为 2 5的海藻酸钠溶液等 体积混合 ； 0012 (d) 将步骤 (a) 所得噬菌体悬液加入到步骤 (c) 所得乳清蛋白 / 海藻酸钠混合溶 液中， 搅拌混匀， 真空脱气除去溶液中的气泡 ； 0013 (e)将步骤(d)所得含有噬菌体的乳清蛋白/海藻酸钠混合溶液制备成微液滴， 滴 入到 50 200mM 的氯化钙溶液中进行固化反应， 得到包埋有噬菌体的乳清蛋白 / 海藻酸钠 微球。 0014 本发明的。
16、有益效果 ： 0015 1、 本发明所述微球制剂中的载体材料为海藻酸钠和乳清蛋白， 两种材料均具有安 全无毒， 不与核酸及蛋白发生反应， 与噬菌体生物相容性好的特点。 0016 2、 本发明所述微球制剂中的载体材料海藻酸钠 / 乳清蛋白混合凝胶， 可有效保护 噬菌体免受胃酸和消化酶的破坏作用。 0017 3、 本发明所述微球制剂中的噬菌体能在肠道环境中有效释放。 说 明 书 CN 102416024 A CN 102416032 A3/4 页 5 0018 4、 本发明所述口服噬菌体微球制剂的制备方法是在常温水相环境中完成的， 条件 温和， 避免了高温， 酸和有机溶剂， 因此微囊化过程中噬菌体。
17、的生物活性能够完全保留。 0019 5、 本发明所述口服噬菌体微球制剂的制备方法对噬菌体的包埋效率达到 93 99。 附图说明 0020 图 1 载噬菌体乳清蛋白 / 海藻酸钠微球显微镜照片。 0021 图 2 微囊化噬菌体 Felix O1 在模拟胃液中的稳定性。 0022 图 3 微囊化噬菌体 Felix O1 在模拟肠液中的释放特征。 具体实施方式 0023 以下通过具体实施例对本发明的上述内容作进一步详细说明， 但是本发明不受这 些具体实施例的限定， 凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。 0024 实施例 1 ： 口服噬菌体微球的制备 0025 (1) 噬菌体悬液制备 。
18、： 本实施例以沙门氏菌噬菌体 Felix O1 为代表制备噬菌体 悬液。具体步骤简述如下， 从 TSA 平板上挑取鼠伤寒沙门氏菌 Salmonella Typhimurium DT104单菌落一个， 接种到5ml TSB培养基中， 37220rpm振荡培养至菌液进入对数生长期 (OD600 0.8)。取 1ml 上述菌液分别与 100l 效价约为 109PFU/ml 噬菌体 Felix O1 贮 存液混合(感染复数为0.1)， 37孵育1520min， 将此细菌-噬菌体混合液转移至250ml 含 10mM MgSO4的 TSB 培养基中， 37 220rpm 振荡培养 18h， 得到悬浊裂解液。
19、， 4、 6500g 离心 10min， 收集上清液 ； 上清液再经 0.22m 一次性过滤装置过滤， 得到噬菌体悬液。 0026 (2) 将 6g 乳清蛋白粉完全溶解在 100ml 蒸馏水中， 用 1M NaOH 调 pH 至 8.0， 然后 加热至 80并孵育 30min 以充分使之变性， 冷却至常温后备用。 0027 (3) 将步骤 (2) 制备的乳清蛋白溶液与 3的海藻酸钠溶液等体积混合。 0028 (4) 将噬菌体 Felix O1 悬液加入上述乳清蛋白 / 海藻酸钠溶液中， 使溶液中噬菌 体终浓度为 108PFU/ml， 搅拌混匀后真空脱气除去溶液中气泡。 0029 (5) 用振动。
20、喷嘴法将步骤 (4) 所得含有噬菌体的乳清蛋白 / 海藻酸钠混合溶液制 备成微液滴， 滴入到 50mM 的氯化钙溶液中进行固化反应， 即可得到包埋有噬菌体的乳清蛋 白 / 海藻酸钠微球。 0030 实施例 2 ： 口服噬菌体微球的评价 0031 本实施例对实施例 1 制备的口服噬菌体微球的形态特征与粒径大小、 噬菌体的含 量与包埋率、 耐酸特性、 体外释放性能等主要特征进行了评价。 0032 2.1 微球形态特征与粒径大小 0033 用光学显微镜观察微球形态， 并从样品中随机取 50 个微球， 用目镜测微尺测量粒 径， 按下式计算微球的平均粒径 (m) ： 0034 0035 结果如图 1 所。
21、示， 可见乳清蛋白 / 海藻酸钠微球粒径均一， 球形规整， 平均粒径为 88080m。 说 明 书 CN 102416024 A CN 102416032 A4/4 页 6 0036 2.2 噬菌体载药量与包埋率测定 0037 取 1g 湿微球加入 9ml 微球破解液中， 室温下溶解 5min 后， 检测破解液中噬菌体效 价， 计算噬菌体载药量， 表示为 PFU/g 微球。噬菌体包埋率根据下式计算 ： 0038 0039 结果显示乳清蛋白 / 海藻酸钠微球中噬菌体的含量为 108 109PFU/g， 噬菌体平 均包埋率达到 93.35.7。 0040 2.3 微球中噬菌体对酸的耐受性检测 00。
22、41 取 5 只试管， 代表 5 个反应时间点， 分别加入 10ml 模拟胃液 ( 含胃蛋白酶 3.2mg/ ml， pH 2.5)， 并预热至 37。然后分别向每只试管里加入 1g 湿态微球， 37 100r/min 振 荡温育， 分别于 15， 30， 60， 90， 120min 后吸去模拟胃液， 并立即加入 10ml SM 缓冲液终止反 应， 再收集微球样品并加入9ml微球破解液， 室温溶解5min以释放微球中的噬菌体， 然后检 测破解液中噬菌体的效价。实验以 SM 缓冲液作为对照， 共重复 3 次。 0042 检测结果如图 2 所示， 实施例 1 制备的微囊化噬菌体 Felix O1。
23、 经 pH 2.5 的模拟 胃液处理120min后， 效价无显著降低， 表明微囊化噬菌体Felix O1能抵御胃酸和胃蛋白酶 的破坏作用。 0043 2.4 微球中噬菌体的体外释放特征 0044 准确称取 500mg 实施例 1 制备的乳清蛋白 / 海藻酸钠微球， 加入到 50ml 模拟肠液 中 ( 含胰蛋白酶 10mg/ml， KH2PO450mM， pH 6.8)， 37 100r/min 振荡孵育， 然后依次按照实 验指定时间取 100l 样品， 同时补加等温等体积的释放介质， 检测噬菌体效价， 并计算噬 菌体的累计释放百分率。 0045 检测结果如图 3 所示， 微囊化噬菌体 Felix O1 在模拟肠液中孵育 4h 后累积释放 百分率达到 98， 基本完全释放。 说 明 书 CN 102416024 A CN 102416032 A1/2 页 7 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102416024 A CN 102416032 A2/2 页 8 图 3 说 明 书 附 图 CN 102416024 A 。