过氧化物酶体增殖物激活受体 （PPAR） 的配体剂 本申请是中国专利申请第 200880112928.1 号的分案申请， 第 200880112928.1 号 的专利申请其申请日是 2008 年 10 月 24 日， 发明名称是 “过氧化物酶体增殖物激活受体 (PPAR) 的配体剂” 。
技术领域
本发明涉及对预防及 / 或治疗与过氧化物酶体增殖物激活受体相关的疾病有效 的过氧化物酶体增殖物激活受体 (PPAR) 的配体剂。本发明还进一步涉及用于预防及 / 或 治疗上述疾病的医药组合物及 / 或饮食品。 背景技术
过氧化物酶体增殖物激活受体 (Peroxisome proliferator-activatedreceptor ： PPAR) 属于维持脂质及糖代谢的担负基因组表达调控的核受体家族的控制配体依赖性转录 的因子， 已知存在 PPARα、 PPARγ、 PPARδ(PPARβ) 的 3 种亚型。
已确认 PPARα 主要在肝脏、 心肌等中表达并调节脂质代谢， 特别是在肝脏中高表 达。作为 PPARα 的配体， 已知有棕榈酸、 油酸、 亚油酸、 花生四烯酸等的脂肪酸类， 苯扎贝 特、 氯贝特等的贝特类抗高脂血症药等的合成化合物， 还已知通过激活肝脏的 PPARα、 促进 脂质代谢来体现出血液中的脂质降低作用 ( 非专利文献 1， 2)。
PPARγ 主要在脂肪组织中表达， 参与小型脂肪细胞的分化， 且具有诱导引起胰岛 素抵抗的 TNFα 及游离脂肪酸的产生、 分泌亢进的肥大脂肪细胞的细胞凋亡， 从而改善胰 岛素抵抗、 降低血糖值的作用等。作为 PPARγ 的配体， 已知有 α- 亚麻酸、 二十碳五烯酸、 二十二碳六烯酸等的不饱和脂肪酸， 曲格列酮、 匹格列酮、 罗格列酮等的噻唑烷二酮类糖尿 病治疗药等的合成化合物， 通过抑制肥大脂肪细胞的过量形成， 使胰岛素敏感性的小型脂 肪细胞增加， 从而改善胰岛素抵抗、 降低血糖值 ( 非专利文献 1， 2)。
PPARδ 因在组织内普遍表达， 所以难于进行功能预测， 其生理作用不明了， 但在最 近， 证实了其在骨格肌细胞中高表达， 进而在骨格肌细胞、 脂肪 组织内参与脂肪酸代谢相 关的基因表达， 具有促进脂肪酸代谢的功能。另外， 可知 PPARδ 配体除了抑制肥胖小鼠模 型的高脂餐负荷所引起的体重增加以外， 还显示出改善胰岛素抵抗的效果。 而且， 还证实了 使骨格肌中 PPARδ 过表达的重组小鼠不易产生高脂餐负荷所引起的肥胖和胰岛素抵抗， 还可使脂肪细胞小型化 ( 非专利文献 1)。
作为 PPARδ 的配体， 已报道有二高 -γ- 亚麻酸、 花生四烯酸、 二十碳五烯酸等的 多不饱和脂肪酸类， 前列腺素 A1、 前列腺素 D2 等的类花生酸类， 半合成前列腺素的前列腺 环素等 ( 非专利文献 2)。
其他， 作为 PPAR 配体， 已报道有没食子酸酯、 没食子单宁类、 槲皮酮类、 黄酮、 异黄 酮、 儿茶素、 表儿茶素等的多酚类 ( 专利文献 1)。
专利文献 1 日本特开 2002-80362 号公报
专利文献 2 日本特开 2003-95968 号公报专利文献 3 日本特开 2006-42816 号公报
专利文献 4 日本特开 2003-26694 号公报
专利文献 5 日本特开 2005-8572 号公报
专利文献 6 日本特开 2006-16330 号公报
专利文献 7 日本特开 2005-126405 号公报
专利文献 8 日本特开 2006-20606 号公报
专利文献 9 日本特开 2006-230225 号公报
专利文献 10 日本特开 2006-22095 号公报
专利文献 11 日本特开 2006-520804 号公报
专利文献 12WO97/28149
非专利文献 1 日本临床， 2005 年， 63 卷 557 ～ 583 项
非专利文献 2Journal of Medicinal Chemistry， 2000 年， 43 卷， 527 ～ 550 页
非专利文献 3Journal of Periodontology， 2006 年， 77 卷， 271 ～ 279 页
非专利文献 4Phytother.Res.， 2007 年， 21 卷， 391 ～ 394 页
非 专 利 文 献 5Journal of Agr icultural and Food Chemistry， 54， 335-341(2006)
非专利文献 6Annals of Medicine， 2005 年， 37 卷， 270 ～ 275 页 非专利文献 7Exp.Biol.Med.， 2005 年， 230 卷， 225 ～ 234 页发明内容 如上所述， PPAR 配体 ( 本说明书中， 也记为 “PPAR 的配体剂” ) 通过使脂质代谢、 糖 代谢亢进， 可期待预防及 / 或改善肥胖及肥胖引起的胰岛素抵抗、 更有高脂血症、 高血压、 糖尿病改善等。但是， 对于已有的 PPAR 配体， 除了因担心医药品的长期投给所引起的副作 用等以外， 来自食品的多酚类等又不能得到充分的 PPAR 配体作用 ( 本说明书中， 也记为 “配 体活性” )， 作为 PPAR 配体剂的功效也不一定令人满意。
本发明的目的在于提供安全、 具有优异的 PPAR 配体作用的 PPAR 配体剂。
本发明者为得到即使长期摄取也安全而副作用少的 PPAR 配体， 不断探索各种植 物提取物中的 PPAR 配体的结果， 成功地得到了具有优异的 PPAR 配体作用的特定的食用植 物的提取物。 而且还发现， 其配体作用的特性因溶剂种类等的不同而不同， 从而完成了本发 明。
本发明中， 作为优选方式包含以下的方式。
[ 方式 1]
一种过氧化物酶体增殖物激活受体 (PPAR) 的配体剂， 其特征在于， 含有作为有效 成分的选自以下的植物 ： 锯叶棕、 刺五加、 巴西莓、 豆蔻、 欧白芷、 番石榴、 黑刺李、 木半夏、 川 芎、 大麻、 西洋接骨木、 亮叶杨桐、 西番莲、 滨海前胡、 茴芹、 穗花牡荆、 印度人参、 帚石楠、 单 子山楂、 亚麻、 阿魏蘑、 刺槐、 无梗五加中的 1 种或 2 种以上的植物提取物。
[ 方式 2]
根据方式 1 所述的配体剂， 其中， PPAR 为 PPARδ。
[ 方式 3]
根据方式 1 或 2 所述的配体剂， 其中， 植物选自西洋接骨木、 亮叶杨桐、 西番莲、 滨 海前胡、 茴芹、 穗花牡荆、 印度人参、 帚石楠、 单子山楂、 亚麻、阿魏蘑、 刺槐、 无梗五加中的 1 种或 2 种以上。
[ 方式 4]
根据方式 1 ～ 3 中任一项所述的配体剂， 其中， 提取物为醇或醇水溶液提取物。
[ 方式 5]
根据方式 4 所述的配体剂， 其中， 醇为乙醇。
[ 方式 6]
根据方式 1 或 2 所述的配体剂， 其中， 植物选自亚麻、 阿魏蘑、 无梗五加、 大麻中的 1 种或 2 种以上。
[ 方式 7]
根据方式 1、 2 或 6 所述的配体剂， 其中， 提取物为热水提取物。
[ 方式 8]
一种医药组合物， 其特征在于， 其用于预防及 / 或治疗与过氧化物酶体增殖物激 活受体相关的疾病， 含有选自以下植物 ： 锯叶棕、 刺五加、 巴西莓、 豆蔻、 欧白芷、 番石榴、 黑 刺李、 木半夏、 川芎、 大麻、 西洋接骨木、 亮叶杨桐、 西番莲、 滨海前胡、 茴芹、 穗花牡荆、 印度 人参、 帚石楠、 单子山楂、 亚麻、 阿魏蘑、 刺槐、 无梗五加中的 1 种或 2 种以上的植物提取物和 药学上允许的添加剂。
[ 方式 9]
根据方式 8 所述的医药组合物， 其中， 与过氧化物酶体增殖物激活受体相关的疾 病选自肥胖、 高脂血症、 高血压、 糖尿病中的 1 种或 2 种以上的疾病。
[ 方式 10]
一种饮食品， 其特征在于， 含有选自以下的植物 ： 锯叶棕、 刺五加、 巴西莓、 豆蔻、 欧 白芷、 番石榴、 黑刺李、 木半夏、 川芎、 大麻、 西洋接骨木、 亮叶杨桐、 西番莲、 滨海前胡、 茴芹、 穗花牡荆、 印度人参、 帚石楠、 单子山楂、 亚麻、 阿魏蘑、 刺槐、 无梗五加中的 1 种或 2 种以上 的植物提取物和作为饮食物允许的添加剂。
[ 方式 11]
根据方式 10 所述的饮食品， 其用于预防及 / 或改善与过氧化物酶体增殖物激活受 体相关的疾病。
[ 方式 12]
一种抗肥胖剂， 其特征在于， 含有作为有效成分的选自西洋接骨木、 茴芹、 单子山 楂及亮叶杨桐中的 1 种或 2 种以上的植物提取物。
[ 方式 13]
一种用于预防及 / 或治疗与过氧化物酶体增殖物激活受体相关的疾病的方法， 其 特征在于， 所述方法包括向需要该预防及 / 或治疗的个体投给含有选自以下植物 ： 锯叶棕、 刺五加、 巴西莓、 豆蔻、 欧白芷、 番石榴、 黑刺李、 木半夏、 川芎、 大麻、 西洋接骨木、 亮叶杨桐、 西番莲、 滨海前胡、 茴芹、 穗花牡荆、 印度人参、 帚石楠、 单子山楂、 亚麻、 阿魏蘑、 刺槐、 无梗 五加中的 1 种或 2 种以上的植物提取物的医药组合物。
[ 方式 14]一种用于制造医药组合物的应用， 其为用于制造用于预防及 / 或治疗与过氧化物 酶体增殖物激活受体相关的疾病的医药组合物的应用， 其特征在于， 所述医药组合物包含 选自以下植物 ： 锯叶棕、 刺五加、 巴西莓、 豆蔻、 欧白芷、 番石榴、 黑刺李、 木半夏、 川芎、 大麻、 西洋接骨木、 亮叶杨桐、 西番莲、 滨海前胡、 茴芹、 穗花牡荆、 印度人参、 帚石楠、 单子山楂、 亚 麻、 阿魏蘑、 刺槐、 无梗五加中的 1 种或 2 种以上的植物提取物。
[ 方式 15]
一种用于预防及 / 或治疗肥胖的方法， 其特征在于， 所述方法包括向需要该预防 及 / 或治疗的个体投给含有选自西洋接骨木、 茴芹、 单子山楂及亮叶杨桐中的 1 种或 2 种以 上的植物提取物的抗肥胖剂。
[ 方式 16]
一种用于制造抗肥胖剂的应用， 其为用于制造用于预防及 / 或治疗肥胖的抗肥胖 剂的应用， 其特征在于， 所述抗肥胖剂含有选自西洋接骨木、 茴芹、 单子山楂及亮叶杨桐中 的 1 种或 2 种以上的植物提取物。
根据本发明， 提供优异的 PPAR 配体剂、 及以其为有效成分含有的组合物 ( 医药组 合物、 饮食品 )。 本发明的作为配体剂的有效成分的植物提取物因可作为来自天然的食物进行摄 取， 安全性高， 所以可长期摄取。 因此， 可作为经口用组合物日常摄取， 也可作为与过氧化物 酶体增殖物激活受体相关的疾病、 例如肥胖、 高脂血症、 高血压、 糖尿病等的预防用组合物 来利用。此外， 也可作为在长期进行治疗及改善上必需的上述疾病的治疗用及改善用组合 物来利用。
附图说明 图 1 表示投给西洋接骨木提取物时的体重变化。白色菱形为不投给提取物的对 照， 方形为投给 100mg/kg/day、 三角形为投给 300mg/kg/day 的结果。
图 2 表示投给西洋接骨木时的体脂肪量。白色柱为不投给提取物的对照， 横纹柱 为投给 100mg/kg/day、 深黑色柱为投给 300mg/kg/day 投给的结果。
图 3 表示投给西洋接骨木时的血液中游离脂肪酸浓度。白色柱为不投给提取物的 对照， 横纹柱为投给 100mg/kg/day、 深黑色柱为投给 300mg/kg/day 的结果。**P ＜ 0.01 对 照
图 4 表示投给西洋接骨木时的血液中中性脂肪浓度。白色柱为不投给提取物的对 照， 横纹柱为投给 100mg/kg/day、 深黑色柱为投给 300mg/kg/day 的结果。
图 5 表示投给茴芹提取物时的体重变化。白色菱形为不投给提取物的对照， 黑色 方形为投给 1000mg/kg/day 的结果。
图 6 表示投给茴芹时的体脂肪量。白色柱为不投给提取物的对照， 黑色柱为投给 1000mg/kg/day 的结果。
图 7 表示投给茴芹时的血液中游离脂肪酸浓度。白色柱为不投给提取物的对照， 黑色柱为投给 1000mg/kg/day 的结果。**P ＜ 0.01
图 8 表示投给茴芹时的血液中中性脂肪浓度。白色柱为不投给提取物的对照， 黑 色柱为投给 1000mg/kg/day 的结果。
图 9 表示投给单子山楂提取物时的体重变化。圆形为不投给提取物的对 照， 方形 为投给 100mg/kg/day、 菱形为投给 300mg/kg/day、 三角形为投给 1000mg/kg/day 的结果。
图 10 表示投给单子山楂时的体脂肪量。白色柱为不投给提取物的对照， 浅黑色柱 为投给 100mg/kg/day、 横纹柱为投给 300mg/kg/day 投给、 黑色柱为投给 1000mg/kg/day 的 结果。
图 11 表示投给单子山楂时的血液中游离脂肪酸浓度。白色柱为不投给提取物 的对照， 浅黑色柱为投给 100mg/kg/day、 横纹柱为投给 300mg/kg/day 投给、 黑色柱为投给 1000mg/kg/day 的结果。**P ＜ 0.01 对照
图 12 表示投给亮叶杨桐提取物时的体重变化。白色菱形为不投给提取物的对照， 黑色方形为投给 100mg/kg/day 的结果。
图 13 表示投给亮叶杨桐时的体脂肪量。白色柱为不投给提取物的对照， 黑色柱为 投给 100mg/kg/day 的结果。
图 14 表示投给亮叶杨桐时的血液中游离脂肪酸浓度。白色柱为不投给提取物的 对照， 黑色柱为投给 100mg/kg/day 的结果。**P ＜ 0.01
图 15 表示投给亮叶杨桐时的血液中中性脂肪浓度。白色柱为不投给提取物的对 照， 黑色柱为投给 100mg/kg/day 的结果。 具体实施方式 I.PPAR 配体剂
本发明涉及含有作为有效成分的特定的植物提取物的过氧化物酶体增殖物激活 受体 (PPAR) 的配体剂及 / 或抗肥胖剂。
( 植物提取物 )
作为本发明的配体剂的原料的植物为选自以下 23 种植物中的 1 种或 2 种以上的 食用植物。
(1) 西洋接骨木 (Sambucus nigra) ；
(2) 亮叶杨桐 (Adinandra nitida) ；
(3) 西番莲 (Passiflora incarnata) ；
(4) 滨海前胡 (Peucedanum japonicum) ；
(5) 茴芹 (Pimpinella anisum) ；
(6) 穗花牡荆 (Vitex agnus-castus) ；
(7) 印度人参 (Withania somnifera) ；
(8) 帚石楠 (Calluna vulgaris) ；
(9) 单子山楂 (Crataegus monogyna) ；
(10) 亚麻 (Linum usitatissimum) ；
(11) 阿魏蘑 (Pleurotus ferulae) ；
(12) 刺槐 (Robinia pseudoacacia) ；
(13) 无梗五加 (Acanthopanax sessiliflorus) ；
(14) 大麻 (Cannabis sativa) ；
(15) 豆蔻 (Elettaria cardamomum) ；
(16) 欧白芷 (Angelica archangelica) ；
(17) 番石榴 (Psidium guajava) ；
(18) 黑刺李 (Prumus spinosa) ；
(19) 锯叶棕 (Serenoa repens) ；
(20) 木半夏 (Eleagnus multiflora) ；
(21) 川芎 (Ligusticum chuaxiong) ；
(22) 刺五加 (Acanthopanax senticosus) 及
(23) 巴西莓 (Euterpe oleracea、 或 E.edulis)。
以下， 对各植物进行说明。
(1) 西洋接骨木 ： 忍冬科植物， 在本发明中优选使用花。已知西洋接骨木的花的别 名也称为接骨木花， 是在欧洲自古以来一直使用的芳香药草， 对感冒、 咽喉炎、 关节炎等的 改善有效。且有报道指出其对牙周炎的初期炎症具有抑制效果 ( 非专利文献 3)。但是， 对 西洋接骨木的溶剂提取物为 PPAR 配体剂还全然不知。
(2) 亮叶杨桐 ( 石崖茶 ) ： 山茶科植物， 在本发明中优选使用叶。亮叶杨桐是中国 南部、 广西壮族自治区特产的茶， 公认其有消炎、 解毒作用， 对咽喉炎、 口腔炎有疗效， 并具 有降压效果、 防癌效果。但是， 对亮叶杨桐的 溶剂提取物为 PPAR 配体剂还全然不知。 (3) 西番莲 ： 西番莲科植物， 在本发明中优选使用地上部。西番莲的地上部被称为 时钟花， 在欧洲是被用于烦躁不安、 失眠的芳香药草。已知有包含 1 种以上包含西番莲 ( 时 钟花 ) 在内的多种多酚材料和大蒜材料的循环器官疾病预防组合物 ( 专利文献 2)。 且公开 了以减轻因减肥而造成的精神压力的作用为目的的含有食物纤维的减肥食品， 其中记载了 配合有时钟花的减肥食品 ( 专利文献 3)。 但是所有的文献中均未提及西番莲的独立的生理 作用， 也未证实和公开西番莲的溶剂提取物为 PPAR 配体剂。
(4) 滨海前胡 ： 日本名称为牡丹防风， 伞形科植物， 在本发明中优选使用地上部。 专利文献 4 中记载了滨海前胡的干燥粉末或提取物具有二糖类分解酶抑制活性， 对抗糖尿 病、 抗肥胖有效， 但对滨海前胡的溶剂提取物为 PPAR 配体剂还全然不知。
(5) 茴芹 ： 伞形科植物， 在本发明中优选使用种子。茴芹的种子作为芳香性的芳香 药草被用于饮料、 烤制点心、 芳香药草茶等， 作为民间疗法药被用于利尿、 消化不良、 支气管 炎等。但是， 对茴芹的溶剂提取物为 PPAR 配体剂还全然不知。
(6) 穗花牡荆 ： 马鞭草科植物， 在本发明中优选使用果实。在欧洲， 穗花牡荆的果 实作为香辛料、 且作为民间疗法药被用于月经不调、 经前紧张症。此外， 还有关于乙醇提取 物中含有的类黄酮类的抗氧化活性的报道 ( 非专利文献 4)。但是， 对穗花牡荆的溶剂提取 物为 PPAR 配体剂还全然不知。
(7) 印度人参 ： 茄科植物， 在本发明中优选使用根。印度人参的叶和根在印度的传 统医疗阿育吠陀中自古以来即被用作长寿药萨拉扬 (Sarayan)。已知有滋养强壮、 强精、 抗 焦虑、 抗抑郁、 缓和风湿病等的关节炎等的功效。但是， 对印度人参的溶剂提取物为 PPAR 配 体剂还全然不知。
(8) 帚石楠 ： 杜鹃花科植物， 在本发明中优选使用花。在欧洲， 帚石楠的花被作为 对预防尿道感染、 利尿、 关节炎、 失眠、 呼吸器官疾病等有效的芳香药草使用， 叶·茎也被作 为具有同样效果的保健茶使用。专利文献 5 中公开了因脂肪酶抑制作用而作为脂肪吸收抑
制剂的抗肥胖、 改善粉刺的效果， 但这是与作为 PPAR 配体剂的改善脂质代谢的效果不同 的作用， 且对帚石楠的溶剂提取物为 PPAR 配体剂还全然不知。
(9) 单子山楂 ： 蔷薇科植物， 在本发明中优选使用果实。在欧洲， 单子山楂的花、 叶、 果实被作为治疗心脏病的芳香药草使用， 特别是果实被作为对动脉硬化、 肾脏病有效的 芳香药草使用。但是， 对单子山楂的溶剂提取物为 PPAR 配体剂还全然不知。
(10) 亚麻 ： 亚麻科植物， 优选使用种子。已知亚麻种子富含 ω3 脂肪酸， 具有降低 血液中胆固醇的作用， 此外， 从免疫学上已知在摄取亚麻种子的芬兰， 前列腺癌、 乳癌等的 激素敏感性癌的患病率低。如上所述， 虽已知脂肪酸为 PPAR 配体剂， 但亚麻的溶剂提取物 为 PPAR 配体剂并未被具体公开， 也未被证实。
(11) 阿魏蘑 ： 侧耳科植物， 在本发明中优选使用子实体。已知有提高免疫的抗肿 瘤效果及增强胰脏功能而对糖尿病有效。但是， 对阿魏蘑的溶剂提取物为 PPAR 配体剂还全 然不知。
(12) 刺槐 ： 也称为洋槐， 豆科植物， 在本发明中优选使用花。花作为中药被用于下 血、 喀血。虽然专利文献 6 中公开了作为与以原花色素为有效成分的脂质燃烧促进剂有关 的材料的洋槐的果实， 但优选使用的部位不同， 且也未证实和公开其作为 PPAR 配体剂。
(13) 无梗五加 ： 五加科植物， 在本发明中优选使用叶。无梗五加的根皮作为中药 的五加皮被用于抗炎症、 镇痛、 强壮， 叶被作为食用、 保健茶使用。非专利文献 5 中报道了无 梗五加的叶的皂苷通过抑制胰脂肪酶而具有抗肥胖效果， 但这是与作为 PPAR 配体剂的改 善脂质代谢的效果不同的作用， 且对无梗五加的溶剂提取物为 PPAR 配体剂还全然不知。
(14) 大麻 ： 大麻科植物， 优选使用种子。有报道指出大麻的叶和花冠中含有的向 神经性物质大麻素作用于神经系统， 与食欲、 能量代谢有关 ( 非专利文献 6 及 7)， 但却不知 道大麻的果实 ( 种子 ) 使脂质代谢亢进， 且对大麻的溶剂提取物为 PPAR 配体剂全然不知。
(15) 豆蔻 ： 姜科植物， 在本发明中优选使用种子。豆蔻的种子被用作 香辛料。专 利文献 7 中公开了以配合水溶性半乳甘露聚糖及食品乳化剂、 酵母粉末、 维生素 B 类为特征 的肥胖防止剂， 且有在其中配合豆蔻精油的记载， 该专利中记载了其主要作用为通过由水 溶性半乳甘露聚糖引起胃的膨满感从而控制饮食和降低、 延迟葡萄糖、 脂肪的吸收以防止 肥胖， 通过精油的配合来促进体内代谢， 但未得到证明， 也没有对豆蔻的溶剂提取物为 PPAR 配体剂的作用的证实和公开。
(16) 欧白芷 ： 伞形科植物， 在本发明中优选使用根。欧白芷的根在欧洲是被用于 食欲不振、 消化不良、 膨满感等症状的芳香药草。 已知欧白芷对高血压、 贫血、 糖尿、 神经痛、 利尿、 疲劳恢复、 预防血栓形成等有功效， 但对其为 PPAR 配体剂还全然不知。
(17) 番石榴 ： 桃金娘科植物， 优选使用未成熟果实。专利文献 8 及 9 中公开了番 石榴茶的防止及改善肥胖的作用。但是， 其作用在专利文献 8 中为通过碳水化合物、 脂肪的 消化酶抑制来控制脂肪、 淀粉、 糖分的吸收， 在专利文献 9 中为通过糖质消化酶的抑制效果 来抑制糖的吸收， 但对番石榴的未成熟果实使脂质代谢亢进还不得而知， 且对番石榴的溶 剂提取物为 PPAR 配体剂还全然不知。
(18) 黑刺李 ( 黑刺李 ) ： 在本发明中优选使用果实。黑刺李的果实在欧洲被作为 芳香药草茶且被作为口腔、 咽粘膜炎症的民间疗法药使用。 但是， 对黑刺李的溶剂提取物为 PPAR 配体剂还全然不知。(19) 锯叶棕 ： 棕榈科植物， 在本发明中优选使用果实。已知锯叶棕的果实有抗雄 激素作用， 对前列腺障碍有效。但是， 对锯叶棕的溶剂提取物为 PPAR 配体剂还全然不知。
(20) 木半夏 ： 胡颓子科植物， 在本发明中优选使用果实。木半夏的果实在中药中 称为木半夏， 被用于跌打损伤、 风湿病所引起的关节痛的治疗。但是， 对木半夏的溶剂提取 物为 PPAR 配体剂还全然不知。
(21) 川芎 ： 伞形科植物， 在本发明中优选使用地上部。该植物的根茎在中药中为 川芎， 被用作强壮、 镇静、 镇痛药。但是， 对川芎的溶剂提取物为 PPAR 配体剂还全然不知。
(22) 刺五加 ： 五加科植物， 在本发明中优选使用根皮。根皮作为五加皮被用于抗 炎症、 镇痛、 强壮， 叶具有抗精神压力的作用， 被用作保健茶。专利文献 10 中公开了因刺五 加叶的皂苷的脂肪酶抑制活性而具有抑制脂质吸收、 抗肥胖、 改善高脂血症的效果等， 但对 刺五加的根皮使脂质代谢亢进还不得而知， 对刺五加的溶剂提取物为 PPAR 配体剂也还全 然不知。
(23) 巴西莓 ： 日本名为阿萨伊莓， 棕榈科植物， 在本发明中优选使用果实。果实中 富含具有抗氧化作用的多酚、 氨基酸、 必须脂肪酸， 虽有关于以具有抗氧化作用的阿沙依椰 子 (Jucara) 及巴西莓果实为基础的健康补助食品的见解 ( 专利文献 11)， 但却没有关于预 防、 改善脂质代谢和肥胖的记载。 此外， 对巴西莓的溶剂提取物为 PPAR 配体剂还全然不知。 本发明中使用的植物的植物提取物中的各种植物体的使用部位优选上述部位， 但 不限于此， 花蕾、 花、 果实、 果皮、 种子、 叶、 枝、 干、 树皮、 根、 根皮、 地上部、 全草等的所有的部 位均可使用。此外， 不仅为上述的优选部位， 也可并用选自上述的所有部位中的 1 种或 2 种 以上。
作为原料的植物体可使用新鲜或干燥后的产物， 可根据需要进行粉碎、 细切、 粉末 化等的加工后使用。此外， 也可直接使用可获得的生药。
植物提取物除了通过使用溶剂直接从上述各种提取部位中提取而得到以外， 进 行水蒸气蒸馏、 使用超临界萃取技术的二氧化碳提取、 进而进行压榨处理后得到的压榨液 ( 榨汁 ) 及 / 或在残渣中加入溶剂进行提取而得到的产物、 所述的压榨液本身均包含于本发 明的植物提取物的定义范围内。
此外， 本发明者由上述 23 种植物的醇水溶液得到提取物， 在其中加入乙酸乙酯、 正丁醇或水进行液相分配而得到乙酸乙酯萃取物、 丁醇萃取物及水萃取物中， 证实了一个 或一个以上的萃取物中具有优异的 PPAR 配体活性。本发明的植物提取物中也包含此种溶 剂提取物的萃取物。
本发明的植物提取物也可根据需要用柱色谱法等分离精制其活性成分。
( 提取方法 )
本发明中， 可使用上述的植物提取物或其精制物。 这些可单独使用， 也可将二种以 上混合使用。
作为用于得到植物提取物而使用的提取溶剂无特别限定， 可列举水、 碳原子数为 1 ～ 4 的低级醇 ( 例如甲醇、 乙醇、 丙醇、 丁醇等 )、 液状多元醇 ( 例如 1， 3- 丁二醇、 丙二醇、 丙三醇等 )、 酮类 ( 例如丙酮、 丁酮 )、 酯类 ( 例如乙酸乙酯、 乙酸丁酯等 ) 等。也可将上述 单独或 2 种以上混合使用。
作为原料植物使用 (1) 西洋接骨木 ( 特别是花 )、 (2) 亮叶杨桐 ( 特别是叶 )、 (3)
西番莲 ( 特别是地上部 )、 (4) 滨海前胡 ( 特别是地上部 )、 (5) 茴芹 ( 特别是种子 )、 (6) 穗花牡荆 ( 特别是果实 )、 (7) 印度人参 ( 特别是根 )、 (8) 帚石楠 ( 特别是花 )、 (9) 单子 山楂 ( 特别是果实 )、 (10) 亚麻 ( 特别是种子 )、 (11) 阿魏蘑 ( 特别是子实体 )、 (12) 刺槐 ( 特别是花 )、 (13) 无梗五加 ( 特别是叶 ) 时， 作为溶剂， 优选使用醇、 特别是低级醇或其水 溶液。
作为溶剂， 使用醇或其水溶液时， 醇的浓度可根据所希望的配体作用适当选择。 通 常， 提取溶剂中醇的浓度为约 10 ～ 100 容量％， 优选为约 10 ～ 70 容量％。本发明的配体 剂因适合作为医药组合物或饮食品等的经口用组合物使用， 所以， 从安全性的观点来看， 作 为醇优选使用乙醇。
而且， 作为原料植物使用 (10) 亚麻 ( 特别是种子 )、 (11) 阿魏蘑 ( 特别是子实体 )、 (13) 无梗五加 ( 特别是叶 ) 时， 除了上述醇或醇水溶液以外， 作为溶剂也优选使用热水的方 式。此外， 作为原料植物使用 (14) 大麻 ( 特别是种子 ) 时， 作为溶剂也优选使用热水。本 说明书中所述的热水具体为 50 ～ 100℃， 更优选为 50 ～ 85℃的水。
上述的溶剂、 即热水、 醇或醇水溶液中， 只要在不过大地损害作为本发明的特征的 PPAR 配体作用、 提取效率的范围内， 也可含有任意其他的成分。 作为提取方法， 无特别限定， 通过使溶剂与上述植物原料接触来进行。具体地说， 可在溶剂中浸漬原料静置保存， 搅拌、 加热回流等提取方式可根据公知方法， 根据所需适当 设定。提取温度无特别限制， 可根据溶剂的温度适当设定， 但从操作上的观点来看， 优选为 溶剂的沸点以下。此外， 也可根据需要设定加压、 减压等的条件。
提取时间可根据所使用的植物原料的种类、 提取溶剂的种类及使用量等 适当设 定。具体地说， 作为溶剂使用醇或醇水溶液时， 其使用量通常相对于 1 重量份原料为 1 ～ 1000 倍， 优选为 1 ～ 100 倍， 进一步优选为 1 ～ 10 倍， 提取时间通常为约 10 分钟～ 1 个月 左右， 优选为 10 分钟～ 7 天左右。此外， 作为溶剂使用热水时， 其使用量通常相对于 1 重量 份原料为 1 ～ 1000 倍， 优选为 1 ～ 100 倍， 进一步优选为 1 ～ 10 倍， 提取时间通常为约 10 分钟～ 7 天左右， 优选为 10 分钟～ 1 天左右， 进一步优选为 10 分钟～ 1 小时左右。
本发明的植物提取物在上述的提取操作后， 分离提取残渣而制成提取液的形态。 作为此种分离手段可使用公知的方法， 例如可例举过滤、 离心分离等。在本发明中， 可直接 使用上述提取液， 也可根据需要， 作为提取液的浓缩物或干燥物 ( 浓缩干固物 ) 使用， 从输 送的方便性等观点来看， 优选作为浓缩物或干燥物。 浓缩可在常压或减压下进行， 通过浓缩 可使浓缩液的容积减少至约 10 ～ 50 容量％， 优选为约 10 ～ 30 容量％。干固物优选在减 压下使含有 PPAR 配体活性成分的提取液中的溶剂干燥而获得。
如上所述， 本发明的植物提取物中， 也包含使溶剂与上述植物原料接触而得到的 提取物的萃取物 ( 例如乙酸乙酯萃取物、 丁醇萃取物、 水萃取物 )。该萃取物通常是通过将 植物原料的醇或醇水溶液的提取物进行液相分配而得到。作为液相分配的方法无特别限 制， 可使用公知的方法。
(PPAR 配体剂及抗肥胖剂 )
本发明的 PPAR 配体剂及抗肥胖剂如上所述， 含有作为有效成分的选自锯叶棕、 刺 五加、 巴西莓、 豆蔻、 欧白芷、 番石榴、 黑刺李、 木半夏、 川芎、 大麻、 西洋接骨木、 亮叶杨桐、 西 番莲、 滨海前胡、 茴芹、 穗花牡荆、 印度人参、 帚石楠、 单子山楂、 亚麻、 阿魏蘑、 刺槐、 无梗五
加中的 1 种或 2 种以上的植物的溶剂提取物。
在此， 本说明书中的 PPAR 配体剂是指具有与 PPAR 配体结合区域结合的能力、 即具 有 PPAR 配体作用的物质的总称。配体剂可以是激动剂也可以是拮抗剂， 优选为激动剂。
本发明的 PPAR 配体剂可对与胰岛素抵抗、 高脂血症、 糖尿病、 高血压及肥胖等的 生活习惯病有关的各种基因的表达进行正控制或负控制。所述各种 基因例如可例举酰基 辅酶 A 氧化酶、 中链酰基辅酶 A 脱氢酶、 肉碱棕榈酰转移酶、 长链酰基辅酶 A 合成酶、 脂肪酸 结合蛋白、 脂蛋白脂肪酶、 载脂蛋白、 解耦联蛋白等， 但不限于这些。
PPAR 配体活性例如可通过将 PPAR 配体结合区与 GAL4 的融合蛋白的结合用荧光素 酶的表达来体现的报告基因检测 (Cell， 1995 年， 83 卷， 803 ～ 812 页 )、 使用包含 PPAR 配体 结合区的蛋白的竞争结合实验 (competitive bindingassay)(Cell， 1995 年， 83 卷， 813 ～ 819 页 ) 等测定。这些检测中， 样品的活性通常与溶剂对照相比， 将显示比溶剂对照活性高 的样品评价为 “具有 PPAR 配体活性” 。在本发明中， 将与溶剂对照相比显示 1.3 倍以上活性 的样品评价为 “具有 PPAR 配体活性” 。
本发明的 PPAR 配体剂只要对于 PPARα、 γ、 δ 之中的至少 1 种以上的 PPAR 具有 配体作用即可。如后述实施例所示， 本发明的 PPAR 配体剂特别是作为 PPARδ 的配体剂而 有用。 因本发明中可使用的来自 23 种植物的提取物均至少对于 PPARδ 亚型具有配体活 性， 所以， 作为上述 PPARδ 的配体剂有用。如本说明书的 [ 背景技术 ] 的项目中所记载， PPARδ 的生理作用得到证实是最近的事。关于 PPARδ， 可期待可激活 PPARδ 的激动剂作 为提高 HDL 胆固醇作用、 由其引起的抑制动脉硬化发展及其治疗、 脂质降低剂、 血糖降下剂 的应用。但是， 其具有充分的活性， 可被临床应用还不为人所知。因此， 本发明的 PPAR 的配 体剂作为 PPARδ 激动剂被认为特别是作为血液中脂质降低剂、 抗肥胖剂而有希望。
而且， 如后述的实施例所明确的， 对于 α 亚型及 γ 亚型的 PPAR， 因所来源的植物 种类不同， 有具有配体活性的情况， 也有不具有的情况。 具体地说， 豆蔻的水萃取物、 亚麻的 乙酸乙酯萃取物及正丁醇萃取物显示 PPARα 活性 ( 实施例 2)。此外， 刺五加、 木半夏、 大 麻、 西洋接骨木、 亮叶杨桐、 茴芹及帚石楠的乙酸乙酯萃取物、 以及亮叶杨桐的正丁醇萃取 物显示 PPARγ 活性 ( 实施例 4)。根据本发明所公开的内容， 本领域技术人员可根据需要， 通过选择所使用的植物材料制备所需的配体剂。优选对 PPAR δ 和 PPAR γ 两者显示配体 活性。
此外， 如后述实施例 6 所述， 将本发明的抗肥胖剂投给小鼠 16 天后， 可证实其具有 抑制体重增加、 抑制体脂肪积累、 降低血液中中性脂肪浓度的作用。因此， 本发明的抗肥胖 剂可作为体重增加抑制剂、 体脂肪积累抑制剂、 血液中中性脂肪降低剂等使用。 本发明的抗 肥胖剂优选含有选自西洋接骨木、 茴芹、 单子山楂及亮叶杨桐中的 1 种或 2 种以上的植物提 取物。
具体地说， 以未投药的对照组在试验结束时的体重为 100 ％时， 西洋接骨木提取 物投给组 (300mg/kg/day) 的体重增加被抑制到约 92％左右， 投给茴芹提取物组 (1000mg/ kg/day) 被抑制到约 93％左右， 投给单子山楂提取物组 (1000mg/kg/day) 被抑制到约 94％ 左右， 投给亮叶杨桐提取物组 (100mg/kg/day) 被抑制到约 69％左右。且以未投药的对照 组在试验结束时的体脂肪量为 100％时， 西洋接骨木提取物投给组 (300mg/kg/day) 的体脂
肪积累被抑制到约 81％左右， 投给茴芹提取物组 (1000mg/kg/day) 被抑制到约 88％左右， 投给单子山楂提取物组 (1000mg/kg/day) 被抑制到约 80 ％左右， 投给亮叶杨桐提取物组 (100mg/kg/day) 被抑制到约 88％左右。而且， 以未投药的对照组在试验结束时的血液中中 性脂肪浓度为 100％时， 西洋接骨木提取物投给组 (300mg/kg/day) 的中性脂肪浓度被降低 到约 80％左右， 投给茴芹提取物组 (1000mg/kg/day) 被降低到约 87％， 投给亮叶杨桐提取 物组 (100mg/kg/day) 被降低到约 63％左右。
而且， 本发明的抗肥胖剂还可使投给本发明的植物提取物的机体的血液中的游离 脂肪酸浓度发生变化。 血液中的游离脂肪酸浓度增加是指脂肪细胞中积累的中性脂肪或血 液中的中性脂肪被分解而游离于血液中， 从而成为能量源。并非限定， 但含有西洋接骨木、 茴芹及单子山楂中的提取物的抗肥胖剂可得到血液中的游离脂肪酸浓度增加的效果。 血液 中的游离脂肪酸浓度减少是指因游离的脂肪酸进入肝脏等进一步燃烧而产生亢进的状况， 从而使血液中的游离脂肪酸浓度减少的状态。并非限定， 但含有亮叶杨桐中的提取物的抗 肥胖剂可得到血液中的游离脂肪酸浓度减少的效果。
II. 医药用组合物及饮食品
在本发明中， 可由来自各种植物的提取物制备 PPAR 配体剂。本发明也提 供含有 该 PPAR 配体剂和药学上允许的添加剂及可食用的添加剂的医药组合物、 饮食品 ( 也可总称 记为 “本发明的组合物” )。本发明的组合物根据 PPAR 在机体内的分布和生理活性， 可用于 预防及 / 或治疗与过氧化物酶体增殖物激活受体相关的疾病。具体地说， 本发明的组合物 对肥胖、 高脂血症、 高血压、 高血糖、 胰岛素抵抗、 糖尿病的预防或改善有效。
在本发明中， 肥胖的预防是指防止或延迟包括内脏肥胖在内、 日本肥胖学会在肥 胖·肥胖症的指导手册第 2 版 (2001 年 7 月发行 ) 中定义的肥胖或肥胖症的状态的形成。 且肥胖的改善是指从上述学会定义的肥胖症或肥胖的状态向上述学会定义的正常范围的 状态靠近。
在本发明中， 高脂血症的预防是指防止或延迟日本动脉硬化学会在动脉硬化性疾 病诊疗指南 (2002 年 9 月发行 ) 中定义的高脂血症的状态或临界状态的形成。此外， 高脂 血的改善是指从上述所示的高脂血症的状态或临界状态向上述指南中定义的正常范围的 状态靠近。
在 本 发 明 中， 胰 岛 素 抵 抗 是 指 在 肝 脏· 脂 肪 细 胞· 骨 格 肌 中， 作为胰岛素 的 主 要 作 用 的 糖 的 吸 收 促 进 作 用 减 弱 的 状 态。 胰 岛 素 抵 抗 的 预 防 是 指 防 止 或 延 迟 SSPG(steady-state plasma glucose) 法等规定的作为胰岛素抵抗的指标的值更加恶化。 胰岛素抵抗的改善是指进一步改善作为上述的胰岛素抵抗的指标的值。
在本发明中， 糖尿病的预防是指防止或延迟日本糖尿病学会在糖尿病治疗指南 2002-2003(2002 年 5 月发行 ) 中定义的糖尿病的状态或临界状态的形成。此外， 糖尿病的 改善是指从上述的糖尿病的状态或临界状态向上述指南中定义的正常范围的状态靠近。
本发明的组合物其形态不受限定， 例如可作为健康食品、 营养补助食品、 营养功能 食品、 特定保健用食品等的饮食品及医药品使用。
本发明的饮食品含有上述 23 种植物提取物的 1 种或 2 种以上、 和作为饮食物允许 的添加剂。在此， 添加剂是指饮食品中通常使用的添加剂， 例如可例举维生素 E、 维生素 C 等的维生素类、 糖类、 赋形剂、 崩解剂、 粘合剂、 润滑剂、 乳化剂、 绷紧剂 (tensing agent)( 等张剂 )、 缓冲剂、 助溶剂、 防腐 剂、 稳定剂、 抗氧化剂、 着色剂、 矫味剂、 香料、 凝固剂、 pH 调节 剂、 增粘剂、 提取物粉末、 生药、 无机盐等， 只要不损坏所希望的本发明配体剂的效果， 不限 定于这些。特别是本发明的饮食物为营养强化剂时， 例如可适当配合制备维生素 E、 维生 素 C 等的维生素类、 制备营养强化剂时通常配合的乳化剂、 绷紧剂 (tensing agent)( 等张 剂 )、 缓冲剂、 助溶剂、 防腐剂、 稳定剂、 抗氧化剂等。
作为饮食品， 可在口香糖、 巧克力、 奶糖、 果冻、 饼干、 克力架等的点心类， 冰淇淋、 冰点心等的冰点心类， 茶、 清凉饮料、 保健营养液、 美容饮料等的饮料， 面条、 中华面条、 意大 利面、 速食面等的面类， 鱼糕、 圆筒状鱼糕、 鱼肉山芋饼等的加工产品， 调味汁、 沙拉酱、 酱汁 等的调味料， 人造奶油、 黄油、 沙拉油等的油脂类， 面包、 火腿、 汤、 软罐头食品、 冷冻食品等 所有的饮食品中使用。该提取物的摄取量无特别限定， 但期望 PPAR 配体活性、 特别是预防 及 / 或改善肥胖及因肥胖而发病的胰岛素抵抗、 高血脂、 高血压、 糖尿病而摄取时， 其摄取 量按该提取物计成人每人每天为 0.01 ～ 1000mg/kg 体重， 优选 1 ～ 300mg/kg 体重， 进一步 优选 2 ～ 20mg/kg 体重。
本发明的医药组合物含有上述 23 种植物提取物中的 1 种或 2 种以上、 和药学上允 许的添加剂。作为在此所述的添加剂， 例如可例示赋形剂、 崩解剂、 润滑剂、 粘合剂、 抗氧化 剂、 着色剂、 抗凝剂、 吸收促进剂、 助溶剂、 稳定剂等。 医药组合物的形态无特别限定， 例如可 例举胶囊剂、 片剂、 颗粒剂、 注射剂、 栓剂、 贴剂等， 特别优选为经口用组合物的形态。 为经口 用组合物时， 该提取物的摄取量无特别限定， 但在期待 PPAR 配体活性、 特别是预防及 / 或改 善肥胖及因肥胖而发病的胰岛素抵抗、 高脂血、 高血压、 糖尿病而摄取时， 其投给量按该提 取物计成人每人每天为 0.01 ～ 1000mg/kg 体重， 优选为 0.1 ～ 300mg/kg 体重， 进一步优选 为 2 ～ 20mg/kg 体重， 分一次或数次投给。 本领域技术人员可考虑患者的状态 ( 年龄、 性别、 症状等 )、 及投给方式等确定适当的投给量。
“预防及 / 或治疗方法” 、 以及 “用于制造医药组合物的应用”
本发明还提供用于预防及 / 或治疗与过氧化物酶体增殖物激活受体相关 的疾病 的方法， 所述方法包括对于需要该预防及 / 或治疗的个体投给含有本发明的植物提取物的 医药组合物。
本发明进一步提供用于制造如下医药组合物的本发明的植物提取物的应用， 该医 药组合物为预防及 / 或治疗与过氧化物酶体增殖物激活受体相关的疾病时所使用的医药 组合物。
本发明还提供用于预防及 / 或治疗肥胖的方法， 所述方法包括对于需要该预防及 / 或治疗的个体投给含有本发明的植物提取物的抗肥胖剂。
本发明还进一步提供本发明的植物提取物用于制造如下抗肥胖剂的应用， 该抗肥 胖剂为预防及 / 或治疗肥胖时使用的抗肥胖剂。
对于本发明的 “预防及 / 或治疗方法” 、 以及 “用于制造医药组合物的应用” ， 有关 投给方式、 投给量等如以上 “医药组合物” 中所述。
实施例
以下， 列举实施例进一步具体说明本发明， 但本发明不限于这些实施例。
植物材料
本说明书中的实施例中所使用的植物和其使用部位如表 1 所示。样品制备中使用各植物使用部位的干燥粉碎物。破碎时使用日本株式会社 TOSHO 制片剂粉碎机 TS-10M 型 或日本株式会社吉田制作所制 Wiley 型粉碎机 1029-JAS 型。
表1
※1“果汁粉末” 为将鲜果实榨汁后得到的果汁进行冷冻干燥后得到的粉末。
※2“地上部” 有时包含茎叶部、 花。
样品制备例 1
将表 1 所示植物的破碎物 1g 分别浸入 10ml(10(W/V) 倍量 )70 容量％的乙醇中， 室温下进行 1 天 1 次搅拌操作后提取 7 天， 过滤后得到提取液。将提取液 5ml 浓缩后进行 冷冻干燥， 得到提取物。使提取物在 1ml 蒸馏水中溶解或悬浮， 加入 3ml 水饱和乙酸乙酯进 行搅拌、 离心分离后， 取分离后的乙酸乙酯层。进一步在水层中加入水饱和 1ml 正丁醇进行 搅拌、 离心分离后， 分离正丁醇层和水层。浓缩所得到的乙酸乙酯层、 正丁醇层及水层后进 行冷冻干燥， 得到乙酸乙酯萃取物、 正丁醇萃取物及水萃取物。
样品制备例 2
将西洋接骨木、 亮叶杨桐、 西番莲、 滨海前胡、 茴芹、 穗花牡荆、 印度人参、 帚石楠、 单子山楂、 亚麻、 阿魏蘑、 刺槐、 无梗五加的破碎物分别浸入表 1 所示的重量的 10(W/V) 倍量 的 70 容量％乙醇中， 室温下进行 1 天 1 次搅拌操作后提取 7 天， 过滤后得到提取液。将提 取液浓缩后进行冷冻干燥， 得到乙醇提取物。
样品制备例 3
将亚麻、 阿魏蘑、 无梗五加、 大麻的破碎物分别加入表 1 所示的重量的 20(W/V) 倍 量的蒸馏水， 每 10 分钟进行搅拌操作， 同时在 80℃下进行 30 分钟提取。 将提取液用水冷却 后， 将 3000rpm、 离心 10 分钟后得到的上清进行过滤。冷冻干燥滤液， 得到热水提取物。
实施例 1PPARδ 配体活性的测定
对于样品制备例 1 中得到的各植物的乙酸乙酯萃取物、 正丁醇萃取物、 水萃取物， 使用以下所示方法测定 PPARδ 配体活性。
将 HepG2 细 胞 ( 来 自 人 体 肝 癌 的 培 养 细 胞 ) 接 种 于 96 孔 培 养 皿 中， 使其为 4 1x10 Cells/well， 在 37℃、 5％ CO2 条件下培养 24 小时。培养基使用含有 10％ FBS( 胎牛血 清； Equitech-Bio 公司 )、 0.3g/L L-Glutamine( 日水制药 ) 的 RPMI1640( 日水制药 )。将 其细胞用 OPTI-MEM(GIBCO 公司 ) 洗涤后， 使用 pBIND/GAL4::mPPARδ 和 pG5luc(Promega 公 司 ) 进行转染。且 pBIND/GAL4::mPPARδ 为在来自酵母的转录因子 GAL4 融合蛋白表达质 粒 pBIND(Promega 公司 ) 中插入小鼠 PPARδ 基因的质粒， pG5lu 为在荧光素酶基因的上游 将 GAL4 的应答序列 (UAS) 整合 5 次后的报告基因· 质粒 ( 可用 Cell， 1995 年， 83 卷， 803 ～ 812 页等中记载的方法制备 )。
转染约 24 小时后， 换成含有植物提取物的培养基， 培养 24 小时。溶剂对照使用 DMSO， 在培养基中添加 1/100 量。将细胞用磷酸缓冲生理盐水 (PBS-) 洗涤后， 用细胞溶解 液 (Cell Culture Lysis Reagent ： Promega 公司 ) 使细胞溶解， 添加 Luciferase Assay Reagent(Promega 公司 ) 用多标记检测仪 (multilabel counter)(Wallac 公司 ) 测定荧光 素酶的发光强度。 此外， 将 PPARδ 的合成激动剂 L-165041(Sigma 公司浓度为 25μM) 作为 阳性对照使用。配体活性的评价将相对于对照 ( 溶剂对照 ) 发光强度的样品发光强度的比 作为样品的 PPARδ 配体活性发光度比， 将显示出 1.3 以上的样品判断为具有 PPARδ 的配 体活性。用于活性测定的样品浓度 ( 培养基中的样品浓度 ) 和配体活性 ( 发光度比 ) 如表 2 所示。
表2
PPAR 配体活性
实施例 2PPARα 配体活性的测定
在 实 施 例 1 中 记 载 的 方 法 中， 作 为 融 合 蛋 白 表 达 质 粒 除 使 用 pBIND/ GAL4::mPPARα 替代 pBIND/GAL4::mPPARδ 以外， 与实施例 1 同样实施， 进行 PPARα 配体活 性的测定。且 pBIND/GAL4::mPPARα 是指在 pBIND(Promega 公司 ) 中插入小鼠 PPARα 基 因的质粒。此外， 以 PPARα 的合成激动剂 WY-14643(Sigma 公司浓度为 25μM) 作为阳性对 照使用。用于活性测定的样品浓度 ( 培养基中的样品浓度 ) 和配体活性 ( 发光度比 ) 如表 3 所示。
表3
PPARα 配体活性
实施例 3PPARγ 配体活性的测定
PPARγ 配体活性测定用 CHO 细胞用如下方法获得。
PPAR 报告基因质粒 (pPPRE-Luc) 是在包含 SV40 启动子基因、 荧光素酶基因的报 告基因质粒 pGL3(Promega 公司 ) 的 SV40 启动子基因的上游将 PPAR 应答序列 (PPRE) 整 合 3 次后的报告基因质粒。PPARγ 表达质粒 (pKD-rPPARγ) 是通过 SV40 启动子在哺乳 类细胞用表达质粒中整合大鼠 PPARγ 基因的质粒。将 pPPRE-Luc 与 pKD-rPPARγ 使用 Lipofectamine(Invitorgen 公司 ) 在 CHO(dhfr-) 细胞 ( 来自中国仓鼠卵巢细胞的二氢 叶酸还原酶缺陷株 ) 中进行共转染。通过用含有几乎不含胸腺嘧啶脱氧核苷的透析胎牛 血清 (GIBCO 公司 ) 的 D-MEM 培养基 (GIBCO 公司 ) 培养细胞， 获得保留了 pPPRE-Luc 和 pKD-rPPARγ 的稳定转化株 (CHO/PPARγ/PPRE)。
将 上 述 细 胞 接 种 于 96 孔 培 养 板 中， 使 其 为 1x104Cells/well， 在 37 ℃、 5 ％ CO2 条 件 下 培 养 24 小 时。 培 养 基 使 用 含 有 10 ％ FBS( 胎 牛 血 清 ； Equitech-Bio 社 )、 0.3g/ L L-Glutamine( 日水制药 )、 10ml/L MEM 用非必需氨基酸溶液 ( 大日本住友制药 ) 的 DMEM( 日水制药 )。培养 24 小时后， 换成含有植物提取物的培养基， 培养 24 小时。溶剂对 照使用 DMSO， 在培养基中添加 1/100 量。 将细胞用磷酸缓冲生理盐水 (PBS-) 洗涤后， 用 细胞溶解液 (Cell CultureLysis Reagent ： Promega 公司 ) 使细胞溶解， 添加 Luciferase AssayReagent(Promega 公司 )， 用多标记检测仪 (multilabel counter)(Wallac 公司 ) 测 定荧光素酶的发光强度。此外， 以 PPARγ 的合成激动剂 Ciglitizone(Sigma 公司浓度为 25μM) 作为阳性对照使用。 用于活性测定的样品浓度 ( 培养基中的样品浓度 ) 和配体活性 ( 发光度比 ) 如表 4 所示。
表4
PPARγ 配体活性
实施例 4 乙醇提取物的 PPARδ 配体活性的测定 将样品制备例 2 中得到的各植物的乙醇提取物的 PPARδ 配体活性用实施例 1 中记载的方法测定。用于活性测定的样品浓度 ( 培养基中的样品浓度 ) 和配体活性 ( 发光度 比 ) 如表 5 所示。
表5
乙醇提取物中的 PPARδ 配体活性
实施例 5 热水提取物的 PPARδ 配体活性的测定
将样品制备例 3 中得到的各植物的热水提取物的 PPARδ 配体活性用实施例 1 中 记载的方法测定。用于活性测定的样品浓度 ( 培养基中的样品浓度 ) 和配体活性 ( 发光度 比 ) 如表 6 所示。
表6
热水提取物中的 PPARδ 配体活性
如以上实施例 1 ～ 5 所示， 证实各植物提取物中均有 PPAR 的配体活性。具体如下。 (1) 证实西洋接骨木的乙酸乙酯萃取物中有 PPARδ 及 PPARγ 的配体活性， 且证实 正丁醇萃取物中有 PPARδ 的配体活性， 进一步证实乙醇提取物中有 PPARδ 活性。
(2) 证实亮叶杨桐的乙酸乙酯萃取物中有 PPARδ 及 PPARγ 的配体活性， 且证实 正丁醇萃取物中有 PPARδ 及 PPARγ 的配体活性， 进一步证实乙醇提 取物中有 PPARδ 活 性。
(3) 证实西番莲的正丁醇萃取物中有 PPARδ 的配体活性， 且证实乙醇提取物中有 PPARδ 活性。
(4) 证实滨海前胡的正丁醇萃取物中有 PPARδ 的配体活性， 且证实乙醇提取物中 有 PPARδ 活性。
(5) 证实茴芹的乙酸乙酯萃取物中有 PPARγ 的配体活性， 且证实正丁醇萃取物中 有 PPARδ 的配体活性， 进一步证实乙醇提取物中有 PPARδ 活性。
(6) 证实穗花牡荆的正丁醇萃取物中有 PPARδ 的配体活性， 且证实乙醇提取物中 有 PPARδ 活性。
(7) 证实印度人参的水萃取物中有 PPARδ 的配体活性， 且证实乙醇提取物中有 PPARδ 活性。
(8) 证实帚石楠的乙酸乙酯萃取物中有 PPARδ 及 PPARγ 的配体活性， 且证实水萃 取物中有 PPARδ 的配体活性， 进一步证实乙醇提取物中有 PPARδ 活性。
(9) 证实单子山楂的水萃取物中有 PPARδ 的配体活性， 且证实乙醇提取物中有 PPARδ 活性。
(10) 证实亚麻的乙酸乙酯萃取物中有 PPARα 的配体活性， 且证实正丁醇萃取物 中有 PPARα 的配体活性， 还证实水萃取物中有 PPARδ 的配体活性， 进一步证实乙醇提取物 中有 PPARδ 活性， 进而证实热水提取物中有 PPARδ 活性。
(11) 证实阿魏蘑的水萃取物中有 PPARδ 的配体活性， 且证实乙醇提取物中有 PPARδ 活性， 进一步证实热水提取物中有 PPARδ 活性。
(12) 证 实 刺 槐 的 水 萃 取 物 中 有 PPARδ 的 配 体 活 性， 且证实乙醇提取物中有 PPARδ 活性。
(13) 证实无梗五加的水萃取物中有 PPARδ 的配体活性， 且证实乙醇提取物中有 PPARδ 活性， 进一步证实热水提取物中有 PPARδ 活性。
(14) 证实大麻的乙酸乙酯萃取物中有 PPARγ 的配体活性， 且证实正丁醇萃取物 中有 PPARδ 的配体活性， 进一步证实水萃取物中有 PPARδ 的配体 活性， 还进一步证实热 水提取物中有 PPARδ 活性。
(15) 证实豆蔻的乙酸乙酯萃取物中有 PPARδ 的配体活性， 且证实正丁醇萃取物 中有 PPARδ 的配体活性， 进一步证实水萃取物中有 PPARα 的配体活性。
(16) 证实欧白芷的正丁醇萃取物中有 PPARδ 的配体活性。
(17) 证实番石榴的正丁醇萃取物中有 PPARδ 的配体活性。
(18) 证实黑刺李的正丁醇萃取物中有 PPARδ 的配体活性。
(19) 证实锯叶棕的正丁醇萃取物中有 PPARδ 的配体活性， 且证实水萃取物中有 PPARδ 的配体活性。
(20) 证实木半夏的乙酸乙酯萃取物中有 PPARγ 的配体活性， 且证实正丁醇萃取 物中有 PPARδ 的配体活性。
(21) 证实川芎的正丁醇萃取物中有 PPARδ 的配体活性。
(22) 证实刺五加的乙酸乙酯萃取物中有 PPARγ 的配体活性， 且证实正丁醇萃取 物中有 PPARδ 的配体活性， 进一步证实水萃取物中有 PPARδ 的配体活性。
(23) 证实巴西莓的正丁醇萃取物中有 PPARδ 的配体活性， 且证实水萃取物中有 PPARδ 的配体活性。
实施例 6 抗肥胖作用的验证( 试验方法 )
将西洋接骨木、 亮叶杨桐、 茴芹、 单子山楂的各植物提取物的抗肥胖作用通过以 下所示方法进行验证。动物使用 ddY 小鼠、 雄性、 6 周龄 ( 纪和实验动物 )， 用标准饲料 (CE-2( 日本 Clea 公司 (Clea Japan， Inc.)) 驯化饲养 1 星期后投给样品。样品投给是将 用与样品制备例 2 同样的方法制备的西洋接骨木、 亮叶杨桐、 茴芹、 单子山楂的各植物提取 物悬浮于含有 3％阿拉伯胶的精制水中， 将后述的投给量以 1 天 1 次在上午、 共计 17 天内强 制经口投给 12 次。此外， 对照组投给只含有 3％阿拉伯胶的精制水。在投给样品期间内的 饲料使用含有 45kcal％的脂肪成分的 Research Diets Inc. 的高脂肪餐 (D12451)， 试验期 间自由摄水。
在 解 剖 前 一 天 即 投 给 开 始 第 16 天，使 用 实 验 动 物 用 X 线 CT 装 置 (LathetaLCT-100· 阿洛卡株式会社 (ALOKA CO.， LTD.)) 测定体脂肪量。解剖当天不投给， 在小鼠断食 4 小时后， 在乙醚麻醉下从腹大静脉取全身血， 离心后得到血浆， 保存于 -80℃。 之后， 将血液中的中性脂肪、 游离脂肪酸使用自动分析装置 ( 日立 7070· 株式会社日立制作 所 ) 测定。
6-1 西洋接骨木
( 结果 )
以 100、 300mg/kg/day( 投给液量为 10ml/kg) 投给西洋接骨木提取物时， 试验期间 内的体重变化如图 1 所示， 投给第 16 天的体脂肪量、 试验结束时的血液中游离脂肪酸浓度 及血液中中性脂肪浓度分别如图 2、 图 3、 图 4 所示。
如图 1-4 所示， 西洋接骨木提取物抑制体重增加和体脂肪积累具有用量依赖性。 且血液中游离脂肪酸的水平显著上升， 而另一方面， 中性脂肪的水平降低。
6-2 茴芹
( 结果 )
以 1000mg/kg/day( 投给液量为 10ml/kg) 投给茴芹提取物时， 试验期间内的体重 变化如图 5 所示， 投给第 16 天的体脂肪量、 试验结束时的血液中游离脂肪酸浓度及血液中 中性脂肪浓度分别如图 6、 图 7、 图 8 所示。
如图 5-8 所示， 通过茴芹提取物的投给抑制了体重增加、 体脂肪积累。且血液中游 离脂肪酸的水平显著提高， 而另一方面， 中性脂肪的水平降低。
6-3 单子山楂
( 结果 )
以 100、 300、 1000mg/kg/day( 投给液量为 10ml/kg) 投给单子山楂提取物时， 试验 期间内的体重变化如图 9 所示， 投给第 16 天的体脂肪量如图 10 所示， 试验结束时的血液中 游离脂肪酸浓度的测定结果如图 11 所示。
如图 9-11 所示， 单子山楂提取物抑制体重增加和体脂肪积累具有用量依赖性。且 血液中游离脂肪酸浓度具有用量依赖性地显著增加。
6-4 亮叶杨桐
( 结果 )
以 100mg/kg/day( 投给液量为 10ml/kg) 投给亮叶杨桐提取物时， 试验期间内的体 重变化如图 12 所示， 投给第 16 天的体脂肪量、 试验结束时的血液中游离脂肪酸浓度及血液中中性脂肪浓度分别如图 13、 图 14、 图 15 所示。
证实通过投给亮叶杨桐提取物， 显著抑制了体重增加， 也抑制了体脂肪积累量。 此 外， 游离脂肪酸的水平显著降低， 中性脂肪的水平也显著降低。