Β葡聚糖在制备人树突状细胞肿瘤疫苗中的应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102600467 A (43)申请公布日 2012.07.25 CN 102600467 A *CN102600467A* (21)申请号 201210088329.9 (22)申请日 2012.03.29 A61K 39/385(2006.01) A61K 39/00(2006.01) C12N 5/0784(2010.01) A61P 35/00(2006.01) (71)申请人 戚春建 地址 213003 江苏省常州市天宁区兴隆巷 29 号 (72)发明人 戚春建 宁永玲 王仕忠 钱科卿 (74)专利代理机构 常州市江海阳光知识产权代 理有限公司 32214 。

2、代理人 孙晓晖 (54) 发明名称 - 葡聚糖在制备人树突状细胞肿瘤疫苗中 的应用 (57) 摘要 本发明公开了一种 - 葡聚糖在制备人树突 状细胞肿瘤疫苗中的应用。 该应用具有以下步骤 ： 用含有 GM-CSF 和 IL-4 的培养基培养人外周血 单核细胞， 获得未成熟人树突状细胞 ； 用 - 葡 聚糖诱导肿瘤抗原负载到步骤获得的未成熟人 树突状细胞内， 获得人树突细胞肿瘤疫苗。 所述的 - 葡聚糖的浓度为 80g/mL 120g/mL。本 发明采用 - 葡聚糖诱导肿瘤抗原负载到未成熟 的人树突状细胞内， 从而得到人树突状细胞肿瘤 疫苗， 该疫苗能够提高人树突状细胞的免疫效能， 促进T细胞的。

3、增殖能力， 特别能够体外刺激T细胞 具有特异性肿瘤杀伤能力， 从而用于治疗各种恶 性实体瘤。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 4 页 1/1 页 2 1.- 葡聚糖在制备人树突状细胞肿瘤疫苗中的应用。 2. 根据权利要求 1 所述的 - 葡聚糖在制备人树突状细胞肿瘤疫苗中的应用， 其特征 在于具有以下步骤 ： 用含有 GM-CSF 和 IL-4 的培养基培养人外周血单核细胞， 获得未成熟人树突状细 胞 ； 用 - 葡聚糖诱导肿瘤抗原负载到步骤获得的未成。

4、熟人树突状细胞内， 获得人树 突细胞肿瘤疫苗。 3. 根据权利要求 2 所述的 - 葡聚糖在制备人树突状细胞肿瘤疫苗中的应用， 其特征 在于 ： 步骤中所述的 - 葡聚糖的浓度为 80g/mL 120g/mL。 4. 根据权利要求 2 或 3 所述的 - 葡聚糖在制备人树突状细胞肿瘤疫苗中的应用， 其 特征在于 ： 步骤中所述的含有 GM-CSF 和 IL-4 的培养基中， GM-CSF 的浓度为 80ng/mL 120 ng/mL， IL-4 的浓度为 30ng/mL 70ng/mL。 5. 根据权利要求 2 或 3 所述的 - 葡聚糖在制备人树突状细胞肿瘤疫苗中的应用， 其 特征在于 ： 。

5、步骤中所述的人外周血单核细胞为CD14+外周血单核细胞， 它是由血细胞分离 机从人外周血中先分离获得外周血单个核细胞， 再通过磁珠分选系统从外周血单个核细胞 中分选获得。 6. 根据权利要求 2 或 3 所述的 - 葡聚糖在制备人树突状细胞肿瘤疫苗中的应用， 其 特征在于 ： 步骤中所述的未成熟人树突状细胞为培养 100h 140h 获得的。 7. 根据权利要求 2 或 3 所述的 - 葡聚糖在制备人树突状细胞肿瘤疫苗中的应用， 其特征在于 ： 步骤中所述的肿瘤抗原是通过生物法和 / 或物理法诱导肿瘤细胞凋亡而获 得。 8. 根据权利要求 7 所述的 - 葡聚糖在制备人树突状细胞肿瘤疫苗中的应。

6、用， 其特征 在于 ： 所述的生物法是采用抗肿瘤化疗药物处理肿瘤细胞使之凋亡。 9. 根据权利要求 7 所述的 - 葡聚糖在制备人树突状细胞肿瘤疫苗中的应用， 其特征 在于 ： 所述物理法是采用同位素射线照射肿瘤细胞使之凋亡， 或者采用紫外线照射肿瘤细 胞使之凋亡， 或者对肿瘤细胞进行反复冻融使之凋亡。 权 利 要 求 书 CN 102600467 A 2 1/3 页 3 - 葡聚糖在制备人树突状细胞肿瘤疫苗中的应用 技术领域 0001 本发明属于分子生物学领域， 具体涉及一种 - 葡聚糖在制备人树突状细胞肿瘤 疫苗中的应用。 背景技术 0002 树突状细胞 （Dendritic cells，。

7、 简称 DC） 大约占血液中整个细胞群体的 0.3%， 是 一种专职抗原递呈细胞， 它能够激发和调控机体的免疫应答。树突状细胞的以下几个特点 使得它能够有效的递呈抗原激发机体的免疫应答 ：（1） 能够通过吞噬作用、 胞饮作用和受 体介导的内吞作用而高效的捕捉抗原 （如凋亡和坏死的细胞微生物及可溶性的外源蛋白 等） ；（2） 具有强的运动性， 能够将捕捉到的抗原从外周组织转运到初级和次级淋巴器官 ； （3） 能够高水平表达 MHC- 、 MHC- 分子， 与细胞内加工形成的抗原决定簇形成复合体并 表达于树突状细胞表面为激活抗原特异的淋巴细胞提供必需的第一信号 ；（4） 能够高水平 表达共刺激分子。

8、及粘附分子， 为激活抗原特异的T 淋巴细胞提供必需的第二信号 ；（5） 能够 合成重要的细胞因子 （如 IL-12 和 IFN- 等） ， 激活多种免疫相关细胞。所以树突状细胞是 最有效的抗原递呈细胞， 其抗原递呈能力远远强于其他的抗原递呈细胞 （如 B 细胞和巨噬 细胞） 。 0003 肿瘤免疫治疗是放疗、 化疗和手术治疗之外的另一种治疗肿瘤的方法， 虽然目前 这种方法还只处于期和期临床研究阶段， 但它已被公认为是最具前景的肿瘤治疗方 法。肿瘤免疫治疗的关键是通过激活机体的免疫系统来清除肿瘤细胞， 其中关键的是产生 肿瘤特异的细胞毒性T淋巴细胞 （CTLs） 。 广泛的研究表明 ： 有效的抗。

9、肿瘤CTLs应答需要专 职抗原递呈细胞树突状细胞来激活 T 淋巴细胞。树突状细胞在激活抗原特异 T 淋巴细 胞及维持 T 淋巴细胞活性上具有重要作用。目前树突状细胞肿瘤疫苗正在被迅速、 广泛的 研究， 并且已在动物实验和早期的临床实验中取得了很有意义的结果。 这些研究结果表明 ： 树突状细胞肿瘤疫苗不仅能够诱发针对原发肿瘤的免疫应答， 而且也能够诱发针对转移肿 瘤的免疫应答。 0004 - 葡聚糖是存在于许多植物和微生物中的一种多糖， 包括燕麦、 大麦、 蘑菇、 海 藻、 细菌和酵母菌等， - 葡聚糖作为生物应答调节剂 （BRMs） ， 体内外的研究表明， 可溶性、 低分子量的 - 葡聚糖， 。

10、可结合于 CR3（CR11b/CD18） 受体。目前尚未发现用 - 葡聚糖制 备人树突状细胞肿瘤疫苗的文献报道。 发明内容 0005 本发明的目的在于解决上述问题， 提供一种 - 葡聚糖在制备人树突状细胞肿瘤 疫苗中的应用。 0006 实现本发明上述目的的技术方案是 ： - 葡聚糖在制备人树突状细胞肿瘤疫苗中 的应用。 0007 该应用具有以下步骤 ： 用含有GM-CSF和IL-4的培养基培养人外周血单核细胞， 说 明 书 CN 102600467 A 3 2/3 页 4 获得未成熟人树突状细胞 ； 用 - 葡聚糖诱导肿瘤抗原负载到步骤获得的未成熟人树 突状细胞内， 获得人树突细胞肿瘤疫苗。 。

11、0008 上述步骤中所述的 - 葡聚糖的浓度为 80g/mL 120g/mL。 0009 上述步骤中所述的含有 GM-CSF 和 IL-4 的培养基中， GM-CSF 的浓度为 80ng/ mL 120 ng/mL， IL-4 的浓度为 30ng/mL 70ng/mL。 0010 上述步骤中所述的人外周血单核细胞为 CD14+外周血单核细胞， 它是由血细胞 分离机从人外周血中先分离获得外周血单个核细胞， 再通过磁珠分选系统从外周血单个核 细胞中分选获得。 0011 上述步骤中所述的未成熟人树突状细胞为培养 100h 140h 获得的。 0012 上述步骤中所述的肿瘤抗原是通过生物法和 / 或物。

12、理法诱导肿瘤细胞凋亡而 获得。即可以单独通过生物法诱导肿瘤细胞凋亡， 也可以单独通过物理法诱导肿瘤细胞凋 亡， 还可以先通过生物法再通过物理法诱导肿瘤细胞凋亡。所述的生物法是采用抗肿瘤化 疗药物处理肿瘤细胞使之凋亡。所述物理法是采用同位素射线照射肿瘤细胞使之凋亡， 或 者采用紫外线照射肿瘤细胞使之凋亡， 或者对肿瘤细胞进行反复冻融使之凋亡。 0013 上述肿瘤为各种恶性实体瘤， 包括肝癌、 胃癌、 食道癌、 乳腺癌、 膀胱癌、 前列腺癌 等。 0014 本发明具有的积极效果是 ： 本发明采用 - 葡聚糖诱导肿瘤抗原负载到未成熟的 人树突状细胞内， 从而得到人树突状细胞肿瘤疫苗， 该疫苗能够提高。

13、人树突状细胞的免疫 效能， 促进 T 细胞的增殖能力， 特别能够体外刺激 T 细胞具有特异性肿瘤杀伤能力， 从而用 于治疗各种恶性实体瘤。 附图说明 0015 图 1 为 - 葡聚糖的结构式。 0016 图 2 为未成熟人树突状细胞吞噬 - 葡聚糖的示意图。 0017 图 3 为 - 葡聚糖影响共刺激分子表达的示意图。 0018 图 4 为 - 葡聚糖影响细胞因子浓度的示意图。 0019 图 5 为 T 细胞的特异性肿瘤杀伤能力的检测示意图。 具体实施方式 0020 （实施例 1） 本实施例的 - 葡聚糖在制备人树突状细胞肿瘤疫苗中的应用具有以下两个步骤 ： 未成熟人树突状细胞的获得 ： 使用。

14、费森尤斯血细胞分离机以及与其配套的一次性消耗管路， 选择双针单个核细胞程 序， 输入被采集人相应的参数 （性别、 身高、 体重、 血细胞比容等） ， 根据被采集人具体情况调 整血液流速为 50mL/min 80mL/min， 抗凝剂和全血比例为 1 10， 将单个核细胞从人外周 血中分离出来， 处理全血量不超过自身血量的 2 倍， 获得外周血单个核细胞。 0021 将上述获得的外周血单个核细胞先置于 15mL 的离心管中， 取 10L 细胞进行计 数， 然后加入抗人CD14+免疫磁珠抗体， 在108cells/100L， 4避光培养15min， 接着用2mL 的 PBS（磷酸盐缓冲液） 洗涤细。

15、胞 5min， 去除上清液， 再加入 0.5mL 的 PBS， 最后用自动磁珠 说 明 书 CN 102600467 A 4 3/3 页 5 分选系统阳性分选所得细胞即为 CD14+外周血单核细胞。 0022 将上述获得的CD14+外周血单核细胞洗涤后用无血清培养基 （市售， 下同） 制备1mL 的细胞悬液， 细胞计数， 调整细胞密度至 3106/mL， 加入 6 孔培养板中， 贴壁 2h 后， 收集悬 浮细胞， -80保存备用。 0023 向上述 6 孔培养板中加入含 GM-CSF 和 IL-4 的无血清培养基 （GM-CSF 浓度为 100ng/mL， IL-4 浓度为 50ng/mL） 。

16、， 在 37、 5% 的 CO2的条件下培养 CD14+外周血单核细胞， 在培养 24h 后换液 （保证 GM-CSF 浓度为 100ng/mL， IL-4 浓度为 50ng/mL， 下同） 一次， 在培 养 72h 后再换液一次， 培养 100h 140h 获得的细胞即为未成熟人树突状细胞。 0024 人树突状细胞肿瘤疫苗的获得 ： 将肿瘤细胞 （本实施例的肿瘤来源于胃癌） 接种于无血清培养基中， 加入抗肿瘤化疗药 物 5- 氟尿嘧啶继续培养 36h 后， 收集凋亡的肿瘤细胞， 然后用 PBS 洗涤 3 次， 接着将凋亡的 肿瘤细胞收集并悬浮于无血清培养基中， 在 37和液氮之间反复冻融 5。

17、 次， 获得肿瘤抗原。 0025 将步骤培养 120h 获得的未成熟人树突状细胞按照 1 3 的细胞数量比加入到 上述获得的肿瘤抗原中， 同时加入 - 葡聚糖 （- 葡聚糖的浓度为 100g/mL） ， 诱导 48h， 使肿瘤抗原负载到未成熟人树突状细胞中， 最后常规离心法洗涤， 收集负载了肿瘤抗原的 人树突状细胞并悬浮于生理盐水中， 获得人树突状细胞肿瘤疫苗。 0026 （实验例 1、 未成熟人树突状细胞能够吞噬 - 葡聚糖） 取 5105个实施例 1 的步骤培养 120h 获得的未成熟人树突状细胞与荧光素 DTAF 标记的 - 葡聚糖 （浓度为 20g/mL） 在 37培养 1h， 马上置。

18、于冰上， 用预冷的 PBS 洗涤 3 次， 进行流式细胞检测。实验结果见图 2。 0027 由图 2 可知 ： 未成熟人树突状细胞能够吞噬 - 葡聚糖。 0028 （实验例 2、 - 葡聚糖对共刺激分子表达以及细胞因子浓度的影响） 本实验例采用三组人树突状细胞进行 CD83、 CD86、 CD40、 HLA-DR、 CCR7 表面标志检测， 判定成熟度。其中第一组为离心收集的实施例 1 的步骤培养 120h 获得的未成熟人树突 状细胞。第二组为由 - 葡聚糖 （浓度为 100g/ml） 激发第一组获得的未成熟人树突状细 胞 48h 后的人树突状细胞。第三组为由 TNF-（浓度为 20ng/mL。

19、） 激发第一组获得的未成 熟人树突状细胞 48h 后的人树突状细胞， 实验结果见图 3。 0029 由图 3 可知 ： 由 - 葡聚糖激发后的第二组的共刺激分子的表达明显上升。 0030 另外， 收集上述三组人树突状细胞的培养上清液， 检测其细胞因子浓度， 结果见图 4。 0031 由图 4 可知 ： 由 - 葡聚糖激发后的第二组的细胞因子浓度明显上升。 0032 （实验例 3、 T 细胞的特异性肿瘤杀伤能力） 将实施例1获得的人树突状细胞肿瘤疫苗与T细胞按照110的数量比混合培养24h， 加入 IL-2（浓度为 500U/mL） ， 收集 T 细胞， 并与靶细胞混合， 分别按照效靶比为 30。

20、 1、 201、 101、 51的比例加入到培养板中， 同时设置最大释放孔、 效应细胞自然释放孔、 靶细胞自然释放孔， 在 37、 5% 的 CO2的条件下培养 4h 后， 加入 LDH 反应液检测。实验结 果见图 5。 0033 由图 5 可知 ： 由实施例 1 获得的人树突状细胞肿瘤疫苗体外刺激的 T 细胞具有特 异性肿瘤杀伤能力。 说 明 书 CN 102600467 A 5 1/4 页 6 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102600467 A 6 2/4 页 7 图 3 说 明 书 附 图 CN 102600467 A 7 3/4 页 8 图 4 说 明 书 附 图 CN 102600467 A 8 4/4 页 9 图 5 说 明 书 附 图 CN 102600467 A 9 。