可模压的骨取代物的生产 发明领域 本发明一般地涉及复合物， 充当用于骨细胞生长的支架， 包括纳米晶体羟磷灰石 (“HA” )、 增塑剂和可生物降解的聚合物。公开了本发明的某些实施例， 但并不意欲限制本 发明。在本发明的一个实施例中， 提供了通过添加特定的生物可降解的增塑剂来控制复合 物的硬化速度的方法， 产生具有持久的可随模成形性时间和高的最终强度的复合物。
发明背景
在医学上， 存在着许多必需帮助人体构建新的骨头的情形。物理的外伤， 例如， 骨 折， 可以以复杂的方式破坏骨组织， 其使得标准的骨折治疗令人满意。 破坏大部分骨组织的 肿瘤可以使得身体自身治愈损伤变为不可能。另一个实例是所谓的上颌窦提升， 在这种情 况下， 天然的骨太薄而不能支持牙齿植入物， 必须添加骨组织。
骨支架的插入是解决这些问题的常规方法。骨支架材料包括结构和组合物， 其在 植入到人体中时将引发骨的形成， 并作为用于骨细胞的培养基底。某些骨支架也能够抵抗 机械载荷， 其胜过原始的骨组织。天然的骨由长度为 20-40nm、 厚度为 2nm 和宽度为 2-4nm 1 的杆状的磷酸钙晶体组成， 由胶原蛋白网络围绕 。具有化学式为 Ca5(PO4) 3OH 的 HA 是矿
物质， 其非常类似天然骨中存在的磷酸钙矿物。
合成的骨支架可以是粉末的形式， 例如， HA 或磷酸三钙。 基于粉末的产品在恢复骨 组织方面是成功的， 但是较不适合于承载应用。还存在着可注射的、 硬化的骨支架材料， 其 目的在于方便插入步骤。一个实例是 HA 和硫酸钙半水合物的混合物， 这种组合物与水混合 并注射到需要的区域中。硫酸钙与水反应， 充当 HA 晶体之间的 “胶” 。硫酸钙晶体随后被身 2 体再吸收， 产生多孔结构， 其随后产生骨细胞生长的适合的环境 。骨支架的另一种类型是 刚性型， 这些通常由多孔的 HA 或磷酸三钙组成， 其是在高温下烧结过的。某些商业产品使 用天然的珊瑚作为原材料。珊瑚在高温下与磷酸盐反应， 产生的结构是刚性的多孔的 HA 材 3 料 。由于环境保护意识， 产生多孔 HA 结构的合成的方法变得越来越常见。刚性的骨支架 产品的最初的优势是材料的不收缩的结构以及多孔性， 其提高了用于骨细胞生长的可用表 面积。一个缺点是结构的易脆性， 由于材料不包含一些物质的事实， 例如， 在天然骨中的聚 合物， 其可以消散施加于材料的力。另一个缺点是材料在插入体内之前需要小心地拟合。
降低刚性的矿物支架的易脆特性的一个方法是向结构中混合聚合物。聚合物 / 矿 物复合材料由可生物降解的聚合物以及具有骨再生性质的矿物例如 HA 组成。聚合物使得 复合物有弹性和抗裂缝， 同时矿物诱导内源性骨的形成。生物降解速度可以通过聚合物的 选择来控制。 可生物降解的聚合物包括合成的聚酯， 例如， 聚 ( 己内酯 )(PLC)、 聚 ( 丙交酯 ) 或聚 ( 乳酸 )(PLA) 和聚 ( 乙交酯 )(PGL)， 但还包括天然生成的聚合物， 例如， 胶原蛋白、 透 4 明质酸、 几丁质和壳聚糖。这些聚合物在人体内经历水解， 产生无毒的降解产物 。PCL 是 具有组成 (C6H10O2)n 的聚酯， 它具有 -60℃的 Tg 和 60℃的熔解温度。对 于生物材料的应 用， 它被用于缝合术、 根管充填和药物递送应用中。PCL 直到其断裂展现了显著的高度延伸 率 ( ＞ 700％ )， 这使得它适合于承载应用 4。PCL 的熔化产生具有粘性的膏体， 其粘性随着 分子量而提高。具有 80000g/mol 分子量的 PCL 熔化物是半流体的、 粘的物质。超过熔解温度， 它可以被塑成任何需要的形状。在冷却时， 聚合物快速地变得更为粘稠， 因为聚合物链 5， 6 聚集， 变得没有运动性。在文献 中报道了 PCL/HA 的复合物， 其已经显示了具有良好的机 械性质并且也诱导骨细胞生长。然而， 这些复合物一般太硬而不能在室温下塑形。 8
为了产生密度大的、 无孔的聚合物 / 矿物复合物， 一般通过熔融挤出 7， 或溶剂 / 8， 9 溶液浇铸 来进行混合。密度大的复合物具有高强度， 但是缺乏骨整合性质， 因为骨细胞 没有表面区域来生长。多孔结构是用于骨细胞生长的更好的支架。产生多孔结构的一个方 法是添加所谓的致孔剂， 即一种材料， 其支持初始结构， 并且通过洗涤或加热随后被除去 10。 常见的致孔剂是氯化钠， 其易于在植入前用水除去 11-13(US5766618)。
除了骨支架的多孔性之外， 磷酸钙的晶体大小对于刺激内源性骨的生长也是重要 的。对于某些生物材料应用， 高度期望的是使用纳米 HA， 即， 长度为 1-100nm 的颗粒大小。 用于这个大小区间内的颗粒的其他术语可以是 “纳米晶体” 或简单的 “纳米颗粒” 。一般认 为的是， 如果 HA 晶体与人体产生的那些内源性骨具有相似的大小和形状， HA 的生物活性被 改善。人体识别纳米 HA 作为它自己的骨组织的一部分， 并围绕着外来的物体生长新的骨。 15 对于植入物， 相比微米大小的 HA， 用纳米 HA 覆盖将显著地提高骨细胞的活性 14， 。对于聚 16， 17 合 物 /HA 复合物， 用纳米 HA 大大地改善了生物活性和强度 。
如果聚合物 /HA 复合物在室温下或在接近人体温度的温度下是可成形的或可注 射的在许多情况下是极为有利的。当植入时， 以及在硬化之后， 材料将能够承受高机械载 荷， 优选的， 材料应该是多孔的以能够使骨细胞的向内生长。 复合物还应当含有与人体中存 在的相同大小和形状的 HA 颗粒以刺激内源性骨的生长。
在文献中， 几个专利描述了目的在于解决上述需求的产品。 WO2007015208A 描述了 可注射的骨支架， 其包括聚 ( 乙烯醇 )、 水和磷酸三钙， 在混合时产生水凝胶。 取决于存在的 聚合物的数量， 复合物可以在 2-60 分钟的时间范围内容易地注射在孔中。硬化通过水向周 围介质的渗漏来诱导。 然而， 不同于此处的本发明， 这个专利申请采用了在人体中降解非常 慢的聚合物。此外， 该复合物包含无孔的和密度大的骨支架。
US6331312 描述了生产骨支架材料的方法， 由结晶程度低的磷灰石和可生物降解 的聚合物一起组成。产品与水混合， 其产生可塑的复合物。然而， 不同于此处的本发明， 这 个专利申请描述了主要意图获得无孔的和密度大的复合物的制备途径。
US7004974 描述了一种物质， 其由磷酸钙颗粒体、 脂质和透明质酸组成。当与水混 合时， 这种物质产生可塑的和可注射的复合物， 具有相对低的抗压强度。
US2006013857 描述了不同的组合物， 其在体温下具有油灰的形式， 在室温下是硬 的。该组合物含有明胶、 硬脂酸钙、 醋酸生育酚， 在某些实例中， 含有微小尺寸的 HA 颗粒 (6-12μm)。这个文件没有 描述纳米尺寸 HA 的使用， 也没有描述控制复合物的硬化速度的 方法。
存在着少量关于可生物降解的聚合物与 HA 和塑化剂一起使用的文献。例如， US7186759 描述了三组分的系统， 由生物相容的聚合物、 水溶性的或水解降解的聚合物， 例 如， 聚 ( 乙二醇 ) 和生物活性物质组成。该复合物在加热时软化， 在冷却时硬化。生物活性 物质可以是可诱导骨生长的物质， 例如， 羟磷灰石。 在除去可水解降解的组分时， 例如， 在与 水或人体中存在的其他液体接触时， 将产生多孔结构， 生物活性物质存在于孔洞中、 聚合物 基体中或复合材料的外表面上。然而， 虽然专利 US7186759 公开了含有水溶性或水解降解聚合物形式的致孔剂的复合物， 可塑性被证明局限于短的时间。也应注意的是， PEG 的降解 18， 19 速度与支持聚合物的降解处在相同的范围内 ， 在 PEG 聚合物的去除时复合物的需要的 多孔性将不会是非常高效的。此外， 该专利采用了微米大小的 HA 颗粒。
SE520688 报道了可注射的骨替换材料， 其由两个部分组成。一个部分含有生物活 性物质， 例如， 生物学相容的油。第二部分包含骨胶接剂， 由硫酸钙 ( 以加快硬化过程 ) 和 / 或骨矿物取代物， 例如， HA( 在 10μm 的大小范围内， 优选更小的 ) 组成。混合两种组分产 生具有低粘度的骨替代材料， 允许材料向选定区域中的容易的注射。材料可以被注射以填 充植入物和周围组织之间的空隙， 或作为单独组分。所述骨替代材料也可以在插入体内之 前塑形成各种形状， 因为取决于组合物， 最大硬度在大约 4 到 8 分钟后达到。然而， 该发明 没有采用可生物降解的聚合物作为基本组分。
WO2008/000488 描述了用于组织再生的生物材料， 其可以由生 物活性材料， 例如， β- 磷酸三钙， 可生物降解的聚合物， 例如， 聚 ( 乳酸 - 羟基乙酸 ) 和减少可生物降解聚合 物的降解的水结合试剂， 例如， 硫酸钙组成。该文件还描述了化合物的用途， 例如， 聚 ( 乙二 醇 )400 用于改善可生物降解的聚合物的溶解。该文件没有描述使用增塑剂来延长复合物 的可成形性， 也没有描述纳米尺寸的 HA 的使用。 正如前面提到的那样， 对于骨替换物 1) 在室温下或在不超过 37℃的温度下， 长时 间可成形和可注射， 2) 能够承受高机械载荷， 3) 是多孔的以允许骨细胞的向内生长， 和 4) 含有与人体中存在的相同大小和形状的 HA 颗粒以尽可能有效地刺激骨细胞的生长是极为 有利的。
以前没有公开同时或顺序地组合上述物质用于合成有强度的、 可塑的复合物的方 法。
发明概述
本发明的主要目的是提供一种复合物， 充当用于骨细胞生长的支架， 包括纳米晶 体 HA、 增塑剂和可生物降解的聚合物。本发明的另一个目的是提供通过添加特定的生物可 降解的增塑剂来控制复合物的硬化速度的方法， 以提供具有长的可成形时间和高最终强度 的复合物。
本发明的其他目的和优点对于读者将变得显而易见， 这些目的和优点在本发明的 范围之内。
附图简要描述
图1： 用 CuKa- 辐射获得的纳米尺寸的 HA 颗粒的 XRD 衍射图 (1.54 埃 )。
图2： 纳米尺寸的 HA 颗粒的 TEM 图像 ( 放大率 100k×)。
图3： 纯的 PCL、 PCL/ 纳米尺寸的 HA 和 PCL/ 微米尺寸 HA 复合物在室温下的抗压 强度 (Pa) 相对于距离 (mm) 的曲线图。
图4： a)PCL/ 生育酚 / 具有氨基酸的纳米 HA(29wt％ HA) 的复合物， b)PCL/ 生育酚 / 没有氨基酸的纳米 HA(29wt％ HA) 的复合物和 c)PCL/ 生育酚 / 微米 HA(29wt％ HA) 的复 合物， 在加热到 70℃ 1 小时然后容许在室温中冷却之后， 在不同时间的抗压强度 (Pa) 相对 于距离 (mm)( 的曲线图 )。
图5： PCL/PEG20000/ 纳米尺寸的 HA(31wt％ HA) 在加热到 70℃ 1 小时然后容许在 室温下冷却之后在不同时间的抗压强度 (Pa) 相对于距离 (mm)( 的曲线图 )。
图6： PCL/ 生育酚 / 丁香酚 / 纳米尺寸的 HA(29wt％ HA) 在加热到 70℃ 1 小时然 后容许在室温下冷却之后在不同时间的抗压强度 (Pa) 相对于距离 (mm) 的曲线图。
图7： a)PCL/ 生育酚 / 油酸单甘油酯 / 纳米尺寸的 HA(31wt％ HA) 的复合物和 b) PCL/ 生育酚 / 油酸单甘油酯 / 纳米尺寸的 HA(38wt％ HA) 的复合物在加热到 70℃ 1 小时然 后容许在室温下冷却之后的抗压强度 (MPa) 相对于距离 (mm)( 的曲线图 )。
图8： 对于 PCL/ 生育酚 / 纳米尺寸的 HA(29wt％ HA)、 PCL/ 生 育酚 / 微米尺寸的 HA(29wt％ HA) 和 PCL/ 生育酚 / 没有氨基酸的纳米尺寸的 HA(29wt％ HA)， 在室温 (r.t.) 和 体温下测量的， 用于乙醇提取的复合物的抗压强度 (MPa) 相对于距离 (mm)( 的曲线图 )。
图9： PCL/ 生育酚 / 纳米尺寸的 HA 复合物在通过乙醇提取除去生育酚后的 SEM 图 像 ( 放大率 30k×)。
图 10 ： 通过水银孔隙度计测量获得的， a)PCL/ 生育酚 / 纳米尺寸的 HA 复合物和 b)PCL/ 生育酚 / 油酸单甘油酯 / 纳米尺寸的 HA 复合物的孔径大小分布。
发明优选实施方式详细说明
现在将详细说明本发明当前优选的实施例。
本发明包括纳米晶体 HA、 增塑剂和可生物降解的聚合物的复合物。所述复合物可 以在室温下塑形成要求的形状。在一定时间之后， 复合物硬化， 并且具有与纯的聚合物 -HA 复合物类似的强度。复合物硬化速度通过添加生物可降解的增塑剂来控制。当植入时， 增 塑剂被身体重吸收， 留下由纳米晶体 HA 和聚合物组成的多孔结构。在除去增塑剂之后， 复 合物的机械强度将显著地提高。由于纳米尺寸的 HA 颗粒的生物活性性质， 这种结构将充当 用于骨细胞生长的极好的支架。 纳米尺寸的 HA 使用一种方法来合成， 该方法涉及钙化合物的含水的分散剂和磷 酸溶液的混合 ( 参见实施例 1)。 产生的 HA 晶体具有长度 10-20nm 的大小， 以及高于 200m2/ g 的比表面积。制作纳米 尺寸的 HA 的另一种方法涉及钙化合物的含水的分散剂和氨基酸 与磷酸和氨基酸的溶液一起混合。美国专利公开号 60/996,561 中描述了生产具有氨基酸 的纳米晶体 HA 的方法， 它的公开内容通过引用合并在此。更具体的， 而不是限制的， 通过与 磷酸和 L- 赖氨酸的溶液一起混合钙化合物和 L- 天冬氨酸的含水的分散剂 ( 参见实施例 2)， 创造实施例。合成还可以用其他氨基酸实现。
当氨基酸存在于结晶溶液中时， 氨基酸附着在生长的磷酸钙晶体的表面， 通过静 电排斥阻止团聚作用和晶体生长。结果是包被有氨基酸的长度 10-20nm 大小的纳米尺寸的 HA 颗粒的悬浮液。氨基酸可以用于改善复合物的强度， 但是还作为向 HA 晶体附着其他官 能团的锚， 例如， 羧酸类、 环氧化物、 氰化物、 醛、 酯、 卤代烷、 酸性卤化物、 酸酐、 酮和磷酸盐。 任选的， 通过加热到 350℃或通过用水彻底的洗涤， 氨基酸可以在晶体插入复合物中之前除 去。
HA 粉末的粉末 X 射线衍射图可以参见图 1。如图 2 中的 TEM 图像显示的， 沉淀的 晶体是约 10-20nm 长度 (TEM 样品的制备， 参见实施例 14)。
增塑剂是完全或部分溶于聚合物基体的。当复合物被加热时， 由于聚合物链的提 高的活动性， 其粘度降低。在冷却到室温时， 复合物保持了它的可成形性， 因为增塑剂阻止 聚合物链的快速聚集。在一定时间之后， 一般是 30 分钟， 聚合物链开始聚集， 引起粘度和强 度的快速提高。具有控制硬化过程的能力的增塑剂可以包括生物可降解的亲脂性物质， 例
如， 油酸、 生育酚和丁香酚、 甘油三酯， 例如， 1， 2， 3- 三乙酸甘油酯， 但还包括两亲性物质， 例 如， 一油酸单甘油酯和辛基 -beta-D- 吡喃葡萄糖苷。
适合于与纳米晶体 HA 和增塑剂一起使用的聚合物包括， 但不限于， 生物可降解的 聚酯， 例如， 聚 ( 己内酯 )、 聚 (DL- 乳酸 ) 以及聚 ( 乙交酯 - 共 - 丙交酯 )。这些聚合物也 可以组合使用。
在一个实施例中， 复合物包括纳米晶体 HA、 PCL 和生育酚的混合物。这种复合物被 加热到 70℃并容许冷却到 37℃或到室温。在 37℃下， 复合物可以用手塑形至少 60 分钟。 在室温下， 复合物可以用手塑形至少 45 分钟。
在另一个实施例中， 复合物包括纳米晶体 HA、 PCL、 丁香酚和生育酚的混合物。在 熔化并在室温冷却之后， 这种复合物可以用手塑形至少 120 分钟。
在又一个实施例中， 复合物包括纳米晶体 HA、 聚 (D， L- 丙交酯 ) 和丁香酚的混合 物。在加热和在室温冷却之后， 这种复合物是粘性的膏体， 其在长期的保存后不会硬化。
在又一个实施例中， 复合物包括纳米晶体 HA、 聚 (D， L- 丙交酯 )、 生育酚和丁香酚 的混合物。在加热并在室温冷却之后， 这种复合物具有弹性的、 橡胶状的外观。
在又一个实施例中， 复合物是纳米晶体 HA、 PCL、 聚 (D， L- 丙交酯 )、 丁香酚和生育 酚的混合物。在加热和随后在室温冷却之后， 这种复合物可以用手塑形大约 30 分钟。 在又一个实施例中， 复合物是纳米晶体 HA、 PCL、 油酸单甘油酯和 1， 2， 3 三乙酸甘 油酯的混合物。这种复合物具有与 PCL/ 生育酚 /HA 复合物相似的机械性质。
在骨生长支架中包括增加的生物学活性因子的优点对于熟练的技术人员是显而 易见的。取决于患者的医疗需求， 这些因子可以包括， 但不限于， 抗生素、 化学治疗剂、 骨细 胞诱导物、 骨细胞刺激物、 组织促进因子、 组织分解抑制物和生长因子。
用其他磷酸钙替换或混合纳米晶体 HA 的可能性对于熟练的技术人员也是显而易 见的。取决于骨支架的需求的特性， 这些磷酸钙可以包括， 但不限于， 磷酸三钙、 磷酸八钙、 磷酸四钙和磷酸二钙。
复合物样品的机械性质通过加热到 70℃ 1 小时后在冷却时的不同时间 (15、 20、 30、 45、 60、 120、 240、 360 和 1440 分钟 ) 测量压力 (Pa) 相对于距离 (mm) 来研究， 这可以在图 3 ～ 8 中看出。应当指出的是， 图 3 ～ 8 仅仅展现了所述测量的典型实例以便于阅读。每 种复合物塑形成具有尺寸 ： 7mm( 高度 )×7mm( 直径 ) 的圆筒。塑形操作通过用复合物填充 一次性的注射器， 接着通过加热到 70 到 100℃之间至少 1 小时来简单地完成。圆柱形的形 状通过将粘性的物质注射到具有上述尺寸的聚四氟乙烯模具中来产生。 施加在样品上的压 力作为距离的函数来记录。当样品从 7mm 的原始高度压缩到 1mm 时， 表 1-4 中的值被记录。 在 TA-HDi Texture 分析仪 (Stable Micro Systems) 上进行实验， 采用 0.2mm/s 的压缩速 度。
PCL 的抗压强度
如在背景部分中提及的， 被冷却到低于其熔点的 PCL 的熔化的样品将不会立即固 化。聚合物链将逐渐地开始聚集， 产生粘度和抗压强度的提高。我们发现， 具有高于 4MPa 的抗压强度的样品难以用手塑形或用注射器注射。如表 1 中所示， 对于纯的 PCL， 在容许聚 合物 在室温冷却后， 这个值在小于 15 分钟内达到。可以看出的是， 在冷却大约 30 分钟后， PCL 达到 14.8MPa 的最大强度 ( 参见图 3)。
纳米尺寸的 HA 对比微米尺寸的 HA
在以下的部分中， 在存在氨基酸的情况下制备的纳米体 HA 被称为纳米 HA， 而在不 存在氨基酸的情况下合成的纳米晶体 HA 将被称为没有氨基酸的 HA。
进行一系列抗压强度测量以比较纳米尺寸的 HA 与微米尺寸的 HA 的效果。微米尺 寸的 HA 获自 Sigma Aldrich， Sweden。结果在表 1 和图 3 中示出。具有纳米晶体 HA(29wt％ HA) 的复合物， 在 20 分钟后的抗压强度是 15.6MPa， 其使得复合物在这个时间之后不可能用 手塑形。在冷却 30 分钟之后达到最大强度， 约 17MPa， 因而比纯的 PCL 更高 15％。市场上 可获得的、 微米 HA 得到了具有与纯的 PCL 相似的机械性质的复合物， 在 30 分钟之后抗压强 度约 15MPa 并且继续。因而， 使用纳米 HA 代替微米 HA 产生了强度更高 15％的复合物。结 果还显示了， 混合纳米或微米 HA 和 PCL 具有对硬化过程的影响， 主要是在初始阶段， 而最终 硬化的状态具有相似的强度。HA 加快了聚合物聚集过程， 显著地降低材料可以用手塑形的 时间。本发明包括方法， 其中复合物的硬化速度通过添加更多的纳米晶体 HA 来提高。
塑化剂的添加
为了延长 PCL/HA 复合物可以塑形的时间， 评估了许多不同的生物学相容的塑化 剂。这些测量的结果在图 4a-4c 和表 2 中示出。
在存在氨基酸的情况下用纳米 HA 对 PCL/ 生育酚 /HA 复合物 ( 参见实施例 3) 的 抗压强度测量在图 4a 和表 2 中示出。HA 纳米颗粒根 据实施例 2 产生。对于这种复合物， 抗压强度保持低于 4MPa 保持 45 分钟， 容许在这个时间内容易的可塑性。在 60 分钟之后， 这种复合物达到抗压强度的平台期， 最大抗压强度为 7.3MPa。
对于根据实施例 1 制备的不具有氨基酸的纳米 HA 颗粒的 PCL/ 生育酚 /HA 复合物 ( 参见实施例 3)， 可成形性维持大约 45 分钟， 抗压强度保持低于 4MPa( 参见图 4b)。最大值 抗压强度在 6h 后达到。用微米 HA 替代纳米 HA 得到了稍微更低的抗压强度， 如图 4c 和表 2 所示的。令人惊讶的是， 生育酚作为塑化剂的存在有效地阻滞了聚合物链的聚集， 从而使 容易的可成形性具有匀相更长时间。因而， 本发明包括通过添加更多的塑化剂降低复合物 的硬化速度的方法。
聚 (D， L- 丙交酯 )/ 丁香酚 /HA 的复合物根据实施例 4 制备。由于聚 (D， L- 丙交 酯 ) 在丁香酚中的高溶解度， 这种复合物是粘性的膏剂， 其甚至在长期保存以后不会硬化。
塑化剂的混合物
也可以采用两种塑化剂的混合物以更进一步阻滞聚集过程。丁香酚， 生物学相容 的亲脂性化合物被添加到 PCL/ 生育酚 /HA 系统。 相比生育酚， 丁香酚是对 PCL 更好的溶剂， 对聚合物聚集过程具有更强的影响。硬化速度也可以通过塑化剂的类型来控制。使用等量 的生育酚和丁香酚 ( 参见实施例 7) 有效地抑制聚合物链聚集， 使得复合物在室温下达 120 分钟的容易地塑形成为可能。这可以与仅生育酚作为塑化剂的复合物比较， 其允许容易的 可成形性。这些测量的结果在图 6 和表 3 中显示。如表 3 中所见， PCL/ 生育酚 / 丁香酚 / HA 复合物的最终强度是约 6.7MPa， 即与 PCL/ 生育酚 /HA 在相同的范围内。本 发明包括通 过提高丁香酚比生育酚的比例降低复合物的硬化速度的方法。
聚 (D， L- 丙交酯 )/ 丁香酚 / 生育酚 /HA 复合物根据实施例 5 制备。在加热和冷 却到室温之后， 这种复合物能够用手塑形 30 分钟。它然后固化成弹性的、 橡胶状的物质。
聚合物的混合物聚 (D， L- 丙交酯 )/PCL/ 丁香酚 / 生育酚 /HA 复合物根据实施例 6 制备。在加热 和冷却之后， 这种复合物能够用手塑形 120 分钟。
多孔复合物的抗压强度
如早先描述的， 生物可再吸收的塑化剂， 例如， 亲脂性和两亲性分子， 被成功地用 于抑制聚合物链的快速聚集， 因而提高可以自由地形成复合物的时间。在复合物植入体内 之后， 塑化剂被人体再吸收， 留下由纳米晶体 HA 和聚合物组成的多孔结构， 适合于脊椎动 物中的骨细胞生长。 本发明包括通过在骨缺陷的位置施用有效量的复合物在骨缺损处诱导 骨生长的方法。在支架被植入身体之后， 身体重吸收塑化剂， 发生骨生长。
为了模拟再吸收过程， 塑化剂使用乙醇提取 ( 参见实施例 11) 产生多孔的复合物 ( 参见图 9)。随后， 对获得的多孔的样品进行抗压强度测量以比较除去塑化剂之后的强度。 对有和没有附着的氨基酸的纳米 HA， 以及微米 HA 的复合物进行。测量的结果在图 8 和表 4 中示出。根据这个表格可见的， 纳米 HA 的复合物的抗压强度约 6.5MPa， 相比微米 HA 复合 物， 其具有 4.0MPa 的强度。因而， 纳米 HA 产生了具有比使用微米 HA 时更高 70％的强度的 复合物。根据 表 4 和图 8 还可以看出的是， 含有无氨基酸的 HA 的提取的复合物展现了处 于含纳米晶体和微米化 HA 的复合物所显示的之间的复合物强度。在室温下， 抗压强度测量 是 5.7MPa。在体温下， 观察轻微的提高 (5.9MPa)。因此， 使用纳米晶体 HA 产生了与采用微 米 HA 相比具有 45％更高的抗压强度的复合物。 总之， 在存在或不存在氨基酸的情况下使用 纳米晶体 HA 得到了具有高抗压强度的复合物， 所述抗压强度不受温度提高的影响。在室温 下显示的抗压强度在体温下不降低。这可以与使用微米 HA 相比较， 其中在体温下观察到更 低的抗压强度。 提取了塑化剂的复合物的 SEM 图像在图 9 中示出 ( 对于操作， 参见实施例 12)。压 贡法测量 ( 参见实施例 13) 揭示了， 在提取生育酚之后， PCL/ 生育酚 /HA 复合物产生了大 小范围约 0.1-1μm 的孔 ( 参见图 10a)。采用等量的生育酚和油酸单甘油酯的混合物作为 塑化剂 ( 参见实施例 8) 产生了具有大约 0.01-0.1μm 大小范围的小的孔体积的孔， 以及 10μm 范围内的更大的孔 ( 参见图 10b)。总孔隙度 ( 孔体积与总体积的比例， 包括固体和 空隙部分 ) 对于 PCL/ 生育酚 /HA 和 PCL/ 生育酚 / 油酸单甘油酯 /HA 分别是 31％和 14％。 在再吸收之后， 塑化剂的缺少得到了类似于纯的聚合物 /HA 复合物所观察到的机械强度的 复合物。组合生育酚和两亲性物质油酸单甘油酯得到了复合物， 其可以自由地塑形大约 30 分钟。将 HA 的数量从 31％提高的 38wt％提高了复合物的强度， 并且影响了完全硬化之前 的时间 ( 参见图 7 和表 3)。结论是， 两亲物质例如油酸单甘油酯可以用于控制植入的骨支 架材料的孔隙度。
孔隙度可以通过改变生育酚与油酸单甘油酯的比例来调整。 提高油酸单甘油酯的 数量来降低孔隙度。抗压强度可以通过提高纳米 HA 的百分比来提高。这可以在表 3 中看 出， 发现包含按重量计算大约 29-38％的纳米 HA 的复合物具有适合的强度。
PCL/PEG/HA
如前文提及的， US7186759 描述了基于三成分系统的可模塑的复合物， 所述三成分 系统由可生物降解的聚合物、 水溶性的或水解降解的聚合物， 例如， 聚 ( 乙二醇 ) 和生物活 性物质， 例如， HA 组成。分配给聚 ( 乙二醇 ) 的任务是在水解时诱导孔隙的能力。制备由 PCL、 聚乙二醇 (PEG20000) 和纳米晶体 HA 组成的复合物 ( 参见实施例 10)， 产生了具有与纯
的 PCL 可比较的最终机械强度的可成形的复合物。然而， 可塑形性限于短时间， 大约 15 分 钟， 在这之后抗压强度在 15.5MPa 持平 ( 参见图 5 和表 2)。还可以从表 2 看出的是， 在人体 温度 37℃附近， PCL/PEG/HA 复合物不可能用手塑形。这表明， 聚 ( 乙二醇 ) 如硬化剂一样 起作用， 其加快了硬化过程， 而不是存在于聚合物基质中生育酚所展示的相反的效果。
使用的化学物
可生物降解的聚合物聚 ( 己内酯 ) 和聚 (D， L- 丙交酯 ) 分别购自 Sigma Aldrich， Sweden 和 Polysciences， USA( 参见实施例 3-9)。
塑 化 剂 生 育 酚、 丁 香 酚、 油 酸 单 甘 油 酯 和 1， 2， 3- 三 乙 酸 甘 油 酯 都 获 自 Sigma Aldrich， Sweden。类似地， 在 HA 纳米颗粒的合成中使用的所有试剂， 例如， 氧化钙、 L- 天冬 氨酸和 X- 赖氨酸购自 Sigma Aldrich， Sweden( 参见实施例 1-10)。磷酸 (85wt％ ) 购自 Fluka。实施例 10 中使用的聚 ( 乙二醇 )20000 购自 Fluka。复合物的制备中使用的具有 9.4m2/g 比表面积的商业的 HA 购自 Sigma Aldrich， Sweden。
通过参考以下实施例， 将更清楚地理解本发明的特征， 实施例不被看作是限制本 发明。 实施例 如在美国专利申请 No.60/996,561 中描述的， 其公开内容通过引用合并在此， 可 塑形复合物的合成操作的以下实施例， 与此处的概括的和详细的说明一起， 更充分地说明 了本发明的性质和特征。
实施例 1 ： 纳米晶体羟磷灰石凝胶的合成
2.82g CaO 与 150ml H2O 在烧杯中混合。使分散剂搅拌 1 小时。在独立的烧杯中， 3.45g 的 H3PO4(85wt％ ) 与 150ml H2O 混合。两个烧杯中的内容物在环境温度下混合， 使产 生的凝胶搅拌 12 小时。混合物在 4 级玻璃滤器中过滤， 用水 (2.5L) 彻底地洗涤。一部分 凝胶进行干燥， 用 XRD 和氮吸收来分析。用 BET 方法计算的这种样品的比表面积是 200m2/ g。
实施例 2 ： 具有氨基酸的纳米晶体羟磷灰石凝胶的合成
纳米晶体羟磷灰石如下制备。6.70g 的 L- 天冬氨酸在烧杯中与 150ml H2O 混 合。2.82g CaO 添 加 到 这 个 溶 液， 使 混 合 物 搅 拌 1 小 时。 在 不 同 的 烧 杯 中， 3.45g 的 H3PO4(85wt％ )， 6.65g L- 赖氨酸和 150ml H2O 混合。这个溶液的 pH 值是 6.46。两个烧杯 中的内容物在环境温度下混合， pH 值测量为 8.10。使混合物搅拌 12 小时。混合物在 4 级 玻璃滤器中过滤， 用水 (2.5L) 彻底地洗涤来除去过量的氨基酸。产生的凝胶的 pH 值测量 为 7.90。
一部分凝胶进行干燥， 用 XRD 和氮吸附来分析。X 射线衍射图在图 1 中示出。用 BET 方法计算的这种样品的比表面积是 210m2/g。
实施例 3 ： PCL/ 生育酚 /HA
根据实施例 1 或 2 制备 HA 凝胶。由包被的羟磷灰石颗粒和水组成的凝胶与 6 克 分子量为 80000g/mol 的聚 ( 己内酯 ) 以及 6 克生育酚混合。混合物在彻底的加热下搅拌 下加热到 70℃直到发生水的完全蒸发。 从搅拌设备中取出黄色的混合物， 使之冷却到室温。 复合物可容易地塑形大约 45 分钟， 在此期间发现抗压强度是低于 4MPa。6.7MPa 的最大抗
压强度在大约 120 分钟后达到。
实施例 4 ： 聚 (D， L- 丙交酯 )/ 丁香酚 /HA
a) 纳米晶体羟磷灰石凝胶的合成
如早先在实施例 1 或 2 中描述的制备。
b) 可塑形的骨取代物的生产
由包被的羟磷灰石颗粒和水组成的产生的凝胶与 4 克丁香酚混合。混合物在彻底 的搅拌下加热到 70℃， 直到发生水的完全蒸发。糊状的共混物随后添加到溶于 4 克丁香酚 中的 4 克聚 (D， L- 丙交酯 ) 中。混合物然后再次加热到 70℃， 搅拌直到获得均匀的团状混 合物。产生的黄色的复合物材料从搅拌设备中取出， 使之冷却到室温。
实施例 5 ： D， L- 丙交酯 / 生育酚 / 丁香酚 /HA
a) 纳米晶体羟磷灰石凝胶的合成
如早先在实施例 1 或 2 中描述的制备。
b) 可模压的骨取代物的生产
由包被的羟磷灰石颗粒和水组成的产生的凝胶与 3 克生育酚混合。混合物加热到 70℃并搅拌直到获得干燥的褐色的粉末。在不同的烧杯中， 3 克 D， L- 丙交酯与 3 克丁香酚 混合， 随后在 70℃加热大约 3H， 或直到观察到匀质的共混物。向匀质的熔化物中添加生育 酚 /HA 粉末， 混合物随后在 70℃下保持搅拌。逐渐地， 温度提高到 90℃以便于粉末与粘性 的聚合物 / 油熔化物的混合。温度维持在 90℃直到获得均质材料， 此后材料从搅拌设备中 取出。使反应混合物冷却到室温， 产生糊状的材料。 实施例 6 ： PCL/ 聚 (D， L- 丙交酯 )/ 生育酚 / 丁香酚 /HA
a) 纳米晶体羟磷灰石凝胶的合成
如早先在实施例 1 或 2 中描述的制备。
b) 可模压的骨取代物的生产
纳米晶体羟磷灰石凝胶添加到 1.5 克生育酚和 1.5 克丁香酚中。反应混合物加热 到 70℃， 搅拌直到获得干燥的褐色粉末。在添加生育酚 / 丁香酚 /HA 粉末之前， 4.5 克聚 ( 己内酯 ) 和 1.5 克聚 (D， L- 丙交酯 ) 与 1.5 克生育酚和 1.5 克丁香酚混合。粘性的混合 物在 70℃加热大约 3 小时， 直到观察到匀质的共混物。 向匀质的熔化物中添加生 育酚 / 丁 香酚 /HA 粉末， 混合物随后在 70℃搅拌直到获得匀质的复合物材料。产生的褐色的复合物 材料从搅拌设备中取出， 使冷却到室温。
实施例 7 ： PCL/ 生育酚 / 丁香酚 /HA
a.) 纳米晶体羟磷灰石凝胶的合成
如早先在实施例 1 或 2 中描述的制备。
b) 可模压的骨取代物的生产
在添加纳米晶体羟磷灰石凝胶之前， 3 克丁香酚与 3 克生育酚和 6 克分子量为 80000g/mol 的聚 ( 己内酯 ) 混合。粘性的混合物在不搅拌的条件下在 70℃加热大约 2 小 时， 随后搅拌 2 小时。向匀质的和黄色的熔化物中添加作为凝胶的羟磷灰石。混合物然后 在彻底搅拌下加热到 70℃直到发生水的完全蒸发。 产生的褐色的复合物材料从搅拌设备中 取出， 使冷却到室温。生育酚 / 丁香酚作为塑化剂的组合允许复合物可塑形达到 120 分钟。 PCL/ 生育酚 / 丁香酚 /HA 复合物的最终的抗压强度是约 6.7MPa。
实施例 8 ： PCL/ 生育酚 / 油酸单甘油酯 /HA
a) 纳米晶体羟磷灰石凝胶的合成
如早先在实施例 1 或 2 中描述的制备。
b) 可模压的骨取代物的生产
在添加纳米晶体羟磷灰石凝胶之前， 3 克油酸单甘油酯与 3 克生 育酚和 5 克分子 量为 80000g/mol 的聚 ( 己内酯 ) 混合。粘性的混合物在 70℃加热大约 12 小时， 之后添加 羟磷灰石凝胶。混合物随后在彻底的搅拌下加热到 70℃直到发生水的完全蒸发。产生的 黄色复合物材料从搅拌设备中取出， 使冷却到室温。生育酚 / 油酸单甘油酯作为塑化剂的 组合得到了复合物， 其可自由地塑形大约 30 分钟， 此后， 其达到大约 5.5MPa 的最大抗压强 度。
实施例 9 ： PCL/ 油酸单甘油酯 / 三醋汀 /HA
a) 纳米晶体羟磷灰石凝胶的合成
如早先在实施例 1 或 2 中描述的制备。
b) 可模压的骨取代物的生产
在添加纳米晶体羟磷灰石凝胶之前， 3 克油酸单甘油酯与 3 克 1， 2， 3- 三乙酸甘油 酯和 6 克分子量为 80000g/mol 的聚 ( 己内酯 ) 混合。粘性的混合物加热到 70℃。向匀质 的和稍微不透明的色的熔化物中添加作为凝胶的羟磷灰石。 混合物随后在彻底的搅拌下加 热到 70℃， 直到发生水的完全蒸发。获得的米色复合材料从搅拌设备中取出， 使冷却到室 温。油酸单甘油酯和 1， 2， 3- 三乙酸甘油酯作为塑化剂的组合产生了复合物， 其可自由塑形 大约 45 分钟， 抗压强度 6.3MPa， 类似于 PCL/ 生育酚 /HA 复合物 ( 参见实施例 3)。
实施例 10 ： PCL/PEG20000/HA
为了评估与本发明的可生物降解的聚合物和纳米 HA 组合添加 可水解的化合物 作为致孔剂的效果， US7186759 中制备的复合物的机械性质和塑形时间与此处本发明中描 述的复合物相比较。 US7186759 中的复合物如所描述的制备， 然而， 使用纳米晶体 HA 颗粒代 替微米大小的 HA( 参见以下的说明 )。
a) 纳米晶体羟磷灰石凝胶的合成
如早先在实施例 1 或 2 中描述的制备。
b) 可模压的骨取代物的生产
在添加纳米晶体羟磷灰石凝胶之前， 5 克 PEG 20000 与 6.7 克聚 ( 己内酯 ) 在 80℃ 混合 2 小时， 随后在相同的温度下机械搅拌。 混合物然后在彻底的搅拌下保持在 80℃， 直到 发生水的完全蒸发。产生的不透明的复合物材料从搅拌设备中取出， 使冷却到室温。复合 物在大约 20-30 分钟之后达到大约 15MPa 的最大抗压强度。
实施例 11 ： 塑化剂的提取
提取过程在室温下在 6 天的时间内进行， 每隔一天交换乙醇相。在室温和在 37℃ 下测量抗压强度， 这可以在表 4 中看出。对于在体温下进行的实验， 在测量之前复合物材料 在 37℃加热至少一个小时。表 4 中显示的抗压强度值代表至少四个实验的平均值。
实施例 12 ： 用于 SEM 分析的乙醇提取的复合物样品的制备
提取的样品根据实施例 11 中描述的方法来制备。提取的样本置于碳胶带上， 随后 使用 JEOL 溅射镀膜机用薄的金薄膜溅射。在装备 有 Oxford Inca EDX 系统、 在 2-5kV 下运行的 LEO Ultra 55FEG SEM 上进行 SEM 分析。两次电子检测器用于检测。
实施例 13 ： 汞压法测量的样品制备
样品用手塑形成大约 1×1×1cm 尺寸的立方体。生育酚相随后根据早先描述的操 作用乙醇提取。在分析之前， 样品置于环境温度下真空中过夜。
实施例 14 ： 用于 TEM 分析的样品的准备
样本通过将 HA 材料磨碎成细粉、 将粉末分散在乙醇中， 然后将几滴分散剂置于有 孔的碳格栅上， 随后在室温下干燥来制备。分析在 120KV 下操作的 JEOL 1200EX II 显微镜 上进行。
本发明在其更广的方面中不限于所显示和描述的具体细节， 可以从这些细节产生 偏离而不背离本发明的原则和不牺牲它的主要优点。
表1
[a] [b]纳米 HA 根据实施例 2 制备。 微米 HA 购自 Sigma Aldrich。比表面积测定为 18m2/g。 表2
[a] [b]使用的 HA 根据实施例 2 制备。 使用的 HA 购自 Sigma Aldrich。比表面积测定为 18m2/g。 [c] 使用 PEG20000 [d] 使用的 HA 根据实施例 1 制备。 表3
[a]使用的 HA 根据实施例 2 制备。 表4[a] 复合物通过用 EtOH 提取 PCL/TOC/HA(29wt％纳米 HA) 来制备 ( 进一步的细节 参见实施例 11)。
[b] 复合物通过用 EtOH 提取 PCL/TOC/HA(29wt％微米 HA) 来制备 ( 进一步的细节 参见实施例 11)。
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