一种穗花杉双黄酮的纯化方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103694212 A (43)申请公布日 2014.04.02 CN 103694212 A (21)申请号 201310617378.1 (22)申请日 2013.11.27 C07D 311/30(2006.01) C07D 311/40(2006.01) (71)申请人桂林三宝药业有限公司地址 546600 广西壮族自治区桂林市荔浦县马岭镇长水岭工业园区 (72)发明人卢照凯钟德品谢冬养唐利萍卓振松周晓青卢桦香应启实 (74)专利代理机构桂林市持衡专利商标事务所有限公司 45107 代理人唐智芳 (54) 发明名称一种穗花杉双黄酮。

2、的纯化方法 (57) 摘要本发明公开了一种穗花杉双黄酮的纯化方法，包括以下步骤： 1) 获取卷柏总黄酮提取物，该卷柏总黄酮提取物中穗花杉双黄酮含量 30% ； 2) 将卷柏总黄酮提取物用甲醇或乙醇溶解，上 ADS-7 大孔树脂柱，水洗树脂柱至流出液澄清，再用 0.5 2v/v% 的盐酸洗脱，收集洗脱液； 3) 洗脱液调 pH 至 4 6，浓缩，静置析晶，收集晶体，所得晶体再用甲醇或乙醇进行重结晶，过滤，收集晶体，干燥，即得。本发明采用既具有吸附功能同时带有离子交换功能的 ADS-7 大孔树脂对卷柏总黄酮提取物进行层析，在将穗花杉双黄酮吸附在大。

3、孔树脂上的同时，起到了非常好的除杂作用，使所得产品的纯度达 95% 以上的产品，且产品收率在 71% 以上。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页说明书 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书1页说明书5页 (10)申请公布号 CN 103694212 A CN 103694212 A 1/1 页 2 1. 一种穗花杉双黄酮的纯化方法，包括以下步骤： 1) 获取卷柏总黄酮提取物，该卷柏总黄酮提取物中穗花杉双黄酮含量 30% ； 2) 将卷柏总黄酮提取物用甲醇或乙醇溶解，上 ADS-7 大孔树脂柱，水洗树脂柱至流出液澄清，。

4、再用 0.5 2v/v% 的盐酸洗脱，收集洗脱液； 3) 洗脱液调 pH 至 4 6，浓缩，静置析晶，收集晶体，所得晶体再用甲醇或乙醇进行重结晶，过滤，收集晶体，干燥，即得穗花杉双黄酮。 2. 根据权利要求 1 所述的穗花杉双黄酮的纯化方法，其特征在于：步骤 2) 中，用于溶解卷柏总黄酮提取物的甲醇的浓度为 60 80v/v%，乙醇的浓度为 30 60v/v%。 3. 根据权利要求 1 所述的穗花杉双黄酮的纯化方法，其特征在于：步骤 3) 中，用于重结晶的甲醇的浓度为 60 80v/v%，乙醇的浓度为 30 60v/v%。 4. 根据权利要求 1 。

5、3 中任一项所述的穗花杉双黄酮的纯化方法，其特征在于：获取卷柏总黄酮的步骤包括以下步骤： a) 以卷柏为原料，加水加热提取，弃去水提取液，收集卷柏药材； b) 将步骤 1) 所得的卷柏药材加入甲醇或乙醇，回流提取，收集醇洗脱液，减压浓缩，浓缩液离心，收集沉淀物； c) 将收集的沉淀物用 6 号溶剂油或石油醚搅拌脱脂，过滤，收集滤饼，干燥，即得卷柏总黄酮提取物。 5. 根据权利要求 4 所述的穗花杉双黄酮的纯化方法，其特征在于：步骤 c) 中，所述搅拌脱脂的时间为 30 60min。 6.根据权利要求4所述的穗花杉双黄酮的纯化方法，其特征在于。

6、：步骤c)中，所述6号溶剂油或石油醚的用量为沉淀物重量的 5 10 倍。 7. 根据权利要求 4 所述的穗花杉双黄酮的纯化方法，其特征在于：步骤 a) 中，加水后加热至 60 100进行提取。 8. 根据权利要求 4 所述的穗花杉双黄酮的纯化方法，其特征在于：步骤 b) 中，甲醇的浓度为 90 100v/v%，乙醇的浓度为 70 100v/v%。权利要求书 CN 103694212 A 2 1/5 页 3 一种穗花杉双黄酮的纯化方法技术领域 0001 本发明涉及植物中活性成分的提取方法，具体涉及一种穗花杉双黄酮的纯化方法。背景技术 0002 中。

7、国药典 2005 年版中规定卷柏为卷柏科植物卷柏 Selaginella tamariscina(Beauv.)Spring或垫状卷柏Selaginella pulvinata(Hook.et Grev.)Maxim. 的干燥全草。卷柏既可观赏，还可药用，全草有止血、收敛的效能。民间将它全株烧成灰，内服可治疗各种出血症，和菜油拌起来外用，可治疗各种刀伤。现代医学证明其有清热解毒、活血化瘀、止血抗癌、防癌治癌、抗炎、抗病毒、抗感染、抗过敏、镇痛、催眠、降血压、降血糖、增强人体免疫功能等功效。在临床上卷柏主要用于治疗闭经、吐。

8、血、尿血、便血、崩漏、脱肛、跌打损伤、腹痛、哮喘等。 0003 卷柏中的功效成分主要是黄酮类，且主要为双黄酮。全草含苏铁双黄酮 (sotetsuflavone)，穗花杉双黄酮 (amentoflavone)，扁柏双黄酮 (hinokiflavone)，异柳杉双黄酮 (isocryptomerin)，柳杉双黄酮 (cryptomerin)B，芹菜素 (apigenin) 和海藻糖 (trehalose)。 0004 卷柏药材的质量主要以穗花杉双黄酮的含量为标准，而卷柏提取物中也以穗花杉双黄酮为主要目标成分，其分子式为 C30H18010，分子量为 538.46。

9、。熔点为 256“C。淡黄色粉末，易溶于甲醇、乙醇和丙酮，其结构式如下： 0005 0006 公开号为 CN101585825A 的发明专利，公开了一种穗花杉双黄酮的制备方法，是以卷柏为原料，经有机溶剂和水的不同浓度混合溶液提取后，浓缩得到浸膏，收集沉淀物，用有机溶剂溶解，进硅胶柱层析，用不同梯度的有机溶剂洗脱，浓缩后再经Sephadex LH-20柱层析，最后再用不同梯度的有机溶剂洗脱，用 TLC 跟踪检测，分段收集浓缩后得到 95% 以上的穗花杉双黄酮精制品。该方法需要经过硅胶柱层析和 Sephadex LH-20 柱层析，一方面工艺较为繁琐，。

10、周期较长；另一方面要用到硅胶柱和 Sephadex LH-20 柱，不仅生产成本较高，而且不易于实现产业化。公开号为 CN102178703A 的发明专利，公开了一种提取卷柏双黄酮的方法，以卷柏为原料，经石油醚和丙酮提取，在丙酮提取液中加入无机盐和聚乙二醇，搅拌后进行萃取，取聚乙二醇相进行超滤和纳滤，再浓缩得到卷柏双黄酮产品。该方法工序较说明书 CN 103694212 A 3 2/5 页 4 简单，并可以获得含量较高 (65% 以上 ) 的穗花杉双黄酮产品，但由于用到高分子量的聚乙二醇，使得工艺较难控制；另外，在萃取步骤中，提取液中的油脂会。

11、溶于萃取试剂中，导致产品中杂质较多，而且不易干燥；再者该方法中使用的超滤和纳滤设备成本较高，运行时能耗也较高，前期投入大。发明内容 0007 本发明要解决的技术问题是提供一种成本低、工艺简单易控的穗花杉双黄酮的纯化方法。由该方法制得的产品中穗花杉双黄酮含量可达 95% 以上 (HPLC 法 )。 0008 本发明所述的穗花杉双黄酮的纯化方法，包括以下步骤： 0009 1) 获取卷柏总黄酮提取物，该卷柏总黄酮提取物中穗花杉双黄酮含量 30% ； 0010 2) 将卷柏总黄酮提取物用甲醇或乙醇溶解，上 ADS-7 大孔树脂柱，水洗树脂柱至流出液澄清，再用 0.5。

12、 2v/v% 的盐酸洗脱，收集洗脱液； 0011 3) 洗脱液调 pH 至 4 6，浓缩，静置析晶，收集晶体，所得晶体再用甲醇或乙醇进行重结晶，过滤，收集晶体，干燥，即得穗花杉双黄酮。 0012 上述纯化方法的步骤 1) 中，所述的卷柏总黄酮提取物可以直接从市场上购买，也可以按现有常规方法制备得到，优选按以下方法制备： 0013 a) 以卷柏为原料，加水加热提取，弃去水提取液，收集卷柏药材； 0014 b) 将步骤 1) 所得的卷柏药材加入甲醇或乙醇，回流提取，收集醇洗脱液，减压浓缩，浓缩液离心，收集沉淀物； 0015 c) 将收集的沉淀物。

13、用 6 号溶剂油或石油醚搅拌脱脂，过滤，收集滤饼，干燥，即得卷柏总黄酮提取物。 0016 上述步骤 a) 中，在加入水后优选加热至 60 100进行提取，更优选是至 70 80进行提取；提取的次数通常为 1 3 次，每次提取 0.5 2h，每次提取时水的加入量为原料重量的 5 12 倍。步骤 b) 中，甲醇的浓度优选为 90 100v/v%，乙醇的浓度优选为 70 100v/v% ；提取的次数通常为 1 3 次，每次提取 1 2h，每次提取时甲醇或乙醇的加入量优选为原料重量的812倍；该步骤中，浓缩液可以趁热离心，也可以静置冷却后再离心，采用趁热。

14、离心可以使制得的卷柏总黄酮提取物中获得相对较高的穗花杉双黄酮含量，而采用静置冷却后再离心的方式则可以使制得的卷柏总黄酮提取物中获得相对较高的穗花杉双黄酮收率。步骤 c) 中，所述搅拌脱脂的时间在 30min 以上，优选为 30 60min。该步骤中，所述 6 号溶剂油或石油醚的用量为沉淀物重量的 5 10 倍。 0017 卷柏中含有大量的水溶性物质，这些水溶性物质在直接用甲醇或乙醇提取时也会被提取出来，而穗花杉双黄酮本身的水溶性很差，几乎不溶于水，所以当直接用甲醇或乙醇提取对卷柏进行提取时会造成后序纯化工序(如过树脂柱、萃取等工序)的很大负担，本方法通过先用水提并。

15、弃去水提液的操作以除去卷柏中大量的水溶性物质 ( 相当于杂质 )，大大减少了后序纯化工序的负担；另外，现有技术中通常采用加入萃取试剂对提取液进行萃取，常用的萃取试剂为乙酸乙酯等有机溶剂，但提取液中的油脂等脂性杂质及其他非极性物质在乙酸乙酯中也具有一定的溶解度，因而在萃取操作收集的有机相中会带有一定量的脂性杂质，导致产品纯度的降低；而本发明是对收集的沉淀物进行搅拌脱酯操作，相当于是将沉淀物中的油脂等脂性杂质及其他非极性物质溶于加入的脱酯溶剂 (6 号溶剂油或石油说明书 CN 103694212 A 4 3/5 页 5 醚 ) 中，通过过滤的方式使这些杂质与。

16、黄酮提取物分离，有效避免了因杂质溶于萃取试剂中造成产品纯度降低的现象，而且有利于产品的干燥，所得产品的性状好。采用上述方法制得的卷柏总黄酮提取物中穗花杉双黄酮的含量在 30 41%，总黄酮含量在 62 70%。 0018 上述纯化方法的步骤 2) 中，用于溶解卷柏总黄酮提取物的甲醇或乙醇的用量和浓度与现有技术相同，优选甲醇的浓度为6080v/v%，乙醇的浓度为3060v/v% ；优选甲醇或乙醇的用量为溶解卷柏总黄酮提取物重量的 8 20 倍。该步骤中，优选采用 1 2v/ v% 的盐酸溶液用来洗脱。洗脱的过程中采用薄层层析 (TLC) 跟踪检测。 0019 上述纯化。

17、方法的步骤 3) 中，洗脱液通常用氢氧化钠溶液、碳酸钠溶液或碳酸氢钠溶液等碱液来调节其pH值，上述碱液的浓度通常为520w/w%。所述用于重结晶的甲醇或乙醇的浓度与现有技术相同，优选甲醇的浓度为 60 80v/v%，乙醇的浓度为 30 60v/v%。该步骤中，通常是将调 pH 值后的洗脱液浓缩至原料重量的 2 4 倍，静置析晶析晶的时间通常为 24 72h。 0020 与现有技术相比，本发明采用既具有吸附功能同时带有离子交换功能的 ADS-7 大孔树脂对卷柏总黄酮提取物进行层析，在将穗花杉双黄酮吸附在大孔树脂上的同时，起到了非常好的除杂作用，使得在用盐酸溶液。

18、解析后，洗脱液经 pH 调节、两次结晶操作，即可获得纯度达 95% 以上 (HPLC 法 ) 的穗花杉双黄酮产品，且穗花杉双黄酮产品的收率在 71% 以上 ( 以卷柏总黄酮提取物中穗花杉双黄酮的含量为基准计算 )。具体实施方式 0021 下面以具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于这些实施例。 0022 实施例 1 0023 1)将卷柏原料粉碎至2040目，取100kg，加入8倍原料重量的水加热至80提取 1.5h，过滤，弃掉滤液，留下卷柏药材； 0024 2) 水提取之后的卷柏药材加入 10 倍原料重量的 80%（v/v）乙醇，加热回流提取 1.。

19、5h，过滤，收集滤液；滤渣再加入 7 倍原料重量的 80%（v/v）乙醇，加热回流提取 1.5h，过滤，收集滤液；合并滤液，得到提取液，提取液浓缩回收乙醇，再浓缩至原料重量 1.5 倍的浸膏； 0025 3) 浸膏冷却静置 12 小时，离心，收集滤饼； 0026 4) 将滤饼捣碎，加入滤饼重量 7 倍量的 6 号溶剂油脱脂 ( 脱脂时间为 60min，整个脱酯过程中不停搅拌 )，过滤收集滤饼，滤饼真空干燥，粉碎，得到 2.1kg 卷柏总黄酮提取物；所得产品外观为棕褐色粉末，紫外分光光度法检测总黄酮含量为 64.24%，其中穗花杉双。

20、黄酮经 HPLC 法检测含量为 32.16% ； 0027 5) 上述所得的卷柏总黄酮提取物用相当于其重量 14 倍的 40%（v/v）乙醇加热溶解，冷却后进 ADS-7 强极性大孔树脂，水洗至流出液变清；然后用 1% （v/v）的盐酸溶液洗脱，收集洗脱液；洗脱液用 10%(w/w) 氢氧化钠溶液调其至 pH=5 6，然后浓缩至原料重量的 3 倍，冷却静置 30 小时，析晶，过滤收集晶体，得到粗晶体；粗晶体用 30%（v/v）乙醇加热溶解，放冷充分析晶，过滤收集重结晶的晶体，真空干燥，得到穗花杉双黄酮精制产品 0.52kg，经 HPLC 检测含量。

21、为 96.21%。 0028 实施例 2 说明书 CN 103694212 A 5 4/5 页 6 0029 1) 将卷柏原料粉碎至 20 目，取 200kg，加入 5 倍原料重量的水加热至 100提取 0.5h，过滤，弃掉滤液，留下卷柏药材； 0030 2) 水提取之后的卷柏药材加入 10 倍原料重量的 95%（v/v）乙醇，加热回流提取 1h，过滤，收集滤液；滤渣再加入 6 倍原料重量的 95%（v/v）乙醇，加热回流提取 1h，过滤，收集滤液；合并滤液，得到提取液，提取液浓缩回收乙醇，再浓缩至原料重量 2 倍的浸膏； 0031 3) 浸膏冷。

22、却静置 4 小时，离心，收集滤饼； 0032 4) 将滤饼捣碎，加入滤饼重量 5 倍量的石油醚脱脂 ( 脱脂时间为 30min，整个脱酯过程中不停搅拌 )，过滤收集滤饼，滤饼真空干燥，粉碎，得到 4.6kg 卷柏总黄酮提取物；所得产品外观为棕褐色粉末，紫外分光光度法检测总黄酮含量为 63.47%，其中穗花杉双黄酮经 HPLC 法检测含量为 31.66% ； 0033 5) 上述所得的卷柏总黄酮提取物用相当于其重量 20 倍的 30%（v/v）乙醇加热溶解，冷却后进 ADS-7 强极性大孔树脂，水洗至流出液变清；用 0.5%（v/v）的盐酸溶液洗脱，。

23、收集洗脱液；洗脱液用氢氧化钠溶液中和至pH=45，浓缩至原料重量的2倍，冷却静置72 小时，析晶，过滤收集晶体，得到粗晶体；粗晶体用 30%（v/v）乙醇加热溶解，放冷充分析晶，过滤收集重结晶的晶体，真空干燥，得到穗花杉双黄酮精制产品 1.21kg，经 HPLC 检测含量为 95.72%。 0034 实施例 3 0035 1) 将卷柏原料粉碎至 10 20 目，取 150kg，加入 10 倍原料重量的水加热至 60 提取 2h，过滤，弃掉滤液，留下卷柏药材； 0036 2) 水提取之后的卷柏药材加入 12 倍原料重量的 70%（v/v）乙醇，加。

24、热回流提取 2h，过滤，收集滤液；滤渣再加入 9 倍原料重量的 75%（v/v）乙醇，加热回流提取 2h，过滤，收集滤液；合并滤液，得到提取液，提取液浓缩回收乙醇，再浓缩至原料量 1 倍的浸膏； 0037 3) 浸膏冷却静置 4 小时，离心，收集滤饼； 0038 4) 将滤饼捣碎，加入滤饼重量 10 倍量的 6 号溶剂油脱脂 ( 脱脂时间为 50min，整个脱酯过程中不停搅拌 )，过滤收集滤饼，滤饼真空干燥，粉碎，得到 3.2kg 卷柏总黄酮提取物；所得产品外观为棕褐色粉末，紫外分光光度法检测总黄酮含量为 62.7%，其中穗花杉双黄酮。

25、经 HPLC 法检测含量为 30.46% ； 0039 5) 上述所得的卷柏总黄酮提取物用相当于其重量 8 倍的 50%（v/v）乙醇加热溶解，冷却后进 ADS-7 强极性大孔树脂，水洗至流出液变清；用 2%（v/v）的盐酸溶液洗脱，收集洗脱液；洗脱液用氢氧化钠溶液中和至pH=55.5，浓缩至原料量的4倍量，冷却静置45 小时，析晶，过滤收集晶体，得到粗晶体；粗晶体用 30%（v/v）乙醇加热溶解，放冷充分析晶，过滤收集重结晶的晶体，真空干燥，得到穗花杉双黄酮精制产品 0.73kg，经 HPLC 检测含量为 95.83%。 0040 实施例 4。

26、 0041 1)将卷柏原料粉碎至1020目，取150kg，加入10倍原料重量的水加热至100 提取 2h，过滤，弃掉滤液，留下卷柏药材； 0042 2) 水提取之后的卷柏药材加入 10 倍原料重量的 95%（v/v）甲醇，加热回流提取 2h，过滤，收集滤液；滤渣再加入 8 倍原料重量的 95% （v/v）甲醇，加热回流提取 1.5h，过滤，收集滤液；滤渣再加入 8 倍原料重量的 95%（v/v）甲醇，加热回流提取 1h，过滤，收集滤液；说明书 CN 103694212 A 6 5/5 页 7 合并滤液，得到提取液，提取液浓缩回收甲醇，再。

27、浓缩至原料量 1.5 倍的浸膏； 0043 3) 浸膏冷却静置 4 小时，离心，收集滤饼； 0044 4) 将滤饼捣碎，加入滤饼重量 8 倍量的石油醚脱脂 ( 脱脂时间为 50min，整个脱酯过程中不停搅拌 )，过滤收集滤饼，滤饼真空干燥，粉碎，得到 3.4kg 卷柏总黄酮提取物；所得产品外观为棕褐色粉末，紫外分光光度法检测总黄酮含量为 61.94%，其中穗花杉双黄酮经 HPLC 法检测含量为 30.21% ； 0045 5) 上述所得的卷柏总黄酮提取物用相当于其重量 8 倍的 60%（v/v）甲醇加热溶解，冷却后进 ADS-7 强极性大孔树脂，水洗至。

28、流出液变清；用 1.5%（v/v）的盐酸溶液洗脱，收集洗脱液；洗脱液用氢氧化钠溶液中和至 pH=4，浓缩至原料量的 2 倍量，冷却静置 60 小时，析晶，过滤收集晶体，得到粗晶体；粗晶体用 70%（v/v）甲醇加热溶解，放冷充分析晶，过滤收集重结晶的晶体，真空干燥，得到穗花杉双黄酮精制产品 0.77kg，经 HPLC 检测含量为 95.37%。 0046 实施例 5 0047 取卷柏总黄酮提取物 7.5kg( 购于湖南康麓生物科技有限公司 )，其中总黄酮含量为 62.56%，穗花杉双黄酮含量为 30.16%)，用相当于其重量 8 倍的 40% （v/v）乙醇加热溶解，冷却后进 ADS-7 强极性大孔树脂，水洗至流出液变清；用 1.5%（v/v）的盐酸溶液洗脱，收集洗脱液；洗脱液用氢氧化钠溶液中和至 pH=4.5，浓缩至原料量的 3 倍量，冷却静置 30 小时，析晶，过滤收集晶体，得到粗晶体；粗晶体用 40%（v/v）乙醇加热溶解，放冷充分析晶，过滤收集重结晶的晶体，真空干燥，得到穗花杉双黄酮精制产品 1.68kg，经 HPLC 检测含量为 96.76%。说明书 CN 103694212 A 7 。

摘要
申请专利号：	CN201310617378.1	申请日：	2013.11.27
公开号：	CN103694212A	公开日：	2014.04.02
当前法律状态：	授权	有效性：	有权
法律详情：	授权\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):C07D 311/30申请日:20131127\|\|\|公开
IPC分类号：	C07D311/30; C07D311/40	主分类号：	C07D311/30
申请人：	桂林三宝药业有限公司
发明人：	卢照凯; 钟德品; 谢冬养; 唐利萍; 卓振松; 周晓青; 卢桦香; 应启实
地址：	546600 广西壮族自治区桂林市荔浦县马岭镇长水岭工业园区
优先权：
专利代理机构：	桂林市持衡专利商标事务所有限公司 45107	代理人：	唐智芳
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内容摘要

本发明公开了一种穗花杉双黄酮的纯化方法，包括以下步骤：1)获取卷柏总黄酮提取物，该卷柏总黄酮提取物中穗花杉双黄酮含量≥30%；2)将卷柏总黄酮提取物用甲醇或乙醇溶解，上ADS-7大孔树脂柱，水洗树脂柱至流出液澄清，再用0.5～2v/v%的盐酸洗脱，收集洗脱液；3)洗脱液调pH至4～6，浓缩，静置析晶，收集晶体，所得晶体再用甲醇或乙醇进行重结晶，过滤，收集晶体，干燥，即得。本发明采用既具有吸附功能同时带有离子交换功能的ADS-7大孔树脂对卷柏总黄酮提取物进行层析，在将穗花杉双黄酮吸附在大孔树脂上的同时，起到了非常好的除杂作用，使所得产品的纯度达95%以上的产品，且产品收率在71%以上。

权利要求书

权利要求书
1.  一种穗花杉双黄酮的纯化方法，包括以下步骤：
1)获取卷柏总黄酮提取物，该卷柏总黄酮提取物中穗花杉双黄酮含量≥30%；
2)将卷柏总黄酮提取物用甲醇或乙醇溶解，上ADS-7大孔树脂柱，水洗树脂柱至流出液澄清，再用0.5～2v/v%的盐酸洗脱，收集洗脱液；
3)洗脱液调pH至4～6，浓缩，静置析晶，收集晶体，所得晶体再用甲醇或乙醇进行重结晶，过滤，收集晶体，干燥，即得穗花杉双黄酮。

2.  根据权利要求1所述的穗花杉双黄酮的纯化方法，其特征在于：步骤2)中，用于溶解卷柏总黄酮提取物的甲醇的浓度为60～80v/v%，乙醇的浓度为30～60v/v%。

3.  根据权利要求1所述的穗花杉双黄酮的纯化方法，其特征在于：步骤3)中，用于重结晶的甲醇的浓度为60～80v/v%，乙醇的浓度为30～60v/v%。

4.  根据权利要求1～3中任一项所述的穗花杉双黄酮的纯化方法，其特征在于：获取卷柏总黄酮的步骤包括以下步骤：
a)以卷柏为原料，加水加热提取，弃去水提取液，收集卷柏药材；
b)将步骤1)所得的卷柏药材加入甲醇或乙醇，回流提取，收集醇洗脱液，减压浓缩，浓缩液离心，收集沉淀物；
c)将收集的沉淀物用6号溶剂油或石油醚搅拌脱脂，过滤，收集滤饼，干燥，即得卷柏总黄酮提取物。

5.  根据权利要求4所述的穗花杉双黄酮的纯化方法，其特征在于：步骤c)中，所述搅拌脱脂的时间为30～60min。

6.  根据权利要求4所述的穗花杉双黄酮的纯化方法，其特征在于：步骤c)中，所述6号溶剂油或石油醚的用量为沉淀物重量的5～10倍。

7.  根据权利要求4所述的穗花杉双黄酮的纯化方法，其特征在于：步骤a)中，加水后加热至60～100℃进行提取。

8.  根据权利要求4所述的穗花杉双黄酮的纯化方法，其特征在于：步骤b)中，甲醇的浓度为90～100v/v%，乙醇的浓度为70～100v/v%。

说明书

说明书一种穗花杉双黄酮的纯化方法
技术领域
本发明涉及植物中活性成分的提取方法，具体涉及一种穗花杉双黄酮的纯化方法。
背景技术
中国药典2005年版中规定卷柏为卷柏科植物卷柏Selaginella tamariscina(Beauv.)Spring或垫状卷柏Selaginella pulvinata(Hook.et Grev.)Maxim.的干燥全草。卷柏既可观赏，还可药用，全草有止血、收敛的效能。民间将它全株烧成灰，内服可治疗各种出血症，和菜油拌起来外用，可治疗各种刀伤。现代医学证明其有清热解毒、活血化瘀、止血抗癌、防癌治癌、抗炎、抗病毒、抗感染、抗过敏、镇痛、催眠、降血压、降血糖、增强人体免疫功能等功效。在临床上卷柏主要用于治疗闭经、吐血、尿血、便血、崩漏、脱肛、跌打损伤、腹痛、哮喘等。
卷柏中的功效成分主要是黄酮类，且主要为双黄酮。全草含苏铁双黄酮(sotetsuflavone)，穗花杉双黄酮(amentoflavone)，扁柏双黄酮(hinokiflavone)，异柳杉双黄酮(isocryptomerin)，柳杉双黄酮(cryptomerin)B，芹菜素(apigenin)和海藻糖(trehalose)。
卷柏药材的质量主要以穗花杉双黄酮的含量为标准，而卷柏提取物中也以穗花杉双黄酮为主要目标成分，其分子式为C30H18010，分子量为538.46。熔点为256"C。淡黄色粉末，易溶于甲醇、乙醇和丙酮，其结构式如下：

公开号为CN101585825A的发明专利，公开了一种穗花杉双黄酮的制备方法，是以卷柏为原料，经有机溶剂和水的不同浓度混合溶液提取后，浓缩得到浸膏，收集沉淀物，用有机溶剂溶解，进硅胶柱层析，用不同梯度的有机溶剂洗脱，浓缩后再经Sephadex LH-20柱层析，最后再用不同梯度的有机溶剂洗脱，用TLC跟踪检测，分段收集浓缩后得到95%以上的穗花杉双黄酮精制品。该方法需要经过硅胶柱层析和Sephadex LH-20柱层析，一方面工艺较为繁琐，周期较长；另一方面要用到硅胶柱和Sephadex LH-20柱，不仅生产成本较高，而且不易于实现产业化。公开号为CN102178703A的发明专利，公开了一种提取卷柏双黄酮的方法，以卷柏为原料，经石油醚和丙酮提取，在丙酮提取液中加入无机盐和聚乙二醇，搅拌后进行萃取，取聚乙二醇相进行超滤和纳滤，再浓缩得到卷柏双黄酮产品。该方法工序较简单，并可以获得含量较高(65%以上)的穗花杉双黄酮产品，但由于用到高分子量的聚乙二醇，使得工艺较难控制；另外，在萃取步骤中，提取液中的油脂会溶于萃取试剂中，导致产品中杂质较多，而且不易干燥；再者该方法中使用的超滤和纳滤设备成本较高，运行时能耗也较高，前期投入大。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种成本低、工艺简单易控的穗花杉双黄酮的纯化方法。由该方法制得的产品中穗花杉双黄酮含量可达95%以上(HPLC法)。
本发明所述的穗花杉双黄酮的纯化方法，包括以下步骤：
1)获取卷柏总黄酮提取物，该卷柏总黄酮提取物中穗花杉双黄酮含量≥30%；
2)将卷柏总黄酮提取物用甲醇或乙醇溶解，上ADS-7大孔树脂柱，水洗树脂柱至流出液澄清，再用0.5～2v/v%的盐酸洗脱，收集洗脱液；
3)洗脱液调pH至4～6，浓缩，静置析晶，收集晶体，所得晶体再用甲醇或乙醇进行重结晶，过滤，收集晶体，干燥，即得穗花杉双黄酮。
上述纯化方法的步骤1)中，所述的卷柏总黄酮提取物可以直接从市场上购买，也可以按现有常规方法制备得到，优选按以下方法制备：
a)以卷柏为原料，加水加热提取，弃去水提取液，收集卷柏药材；
b)将步骤1)所得的卷柏药材加入甲醇或乙醇，回流提取，收集醇洗脱液，减压浓缩，浓缩液离心，收集沉淀物；
c)将收集的沉淀物用6号溶剂油或石油醚搅拌脱脂，过滤，收集滤饼，干燥，即得卷柏总黄酮提取物。
上述步骤a)中，在加入水后优选加热至60～100℃进行提取，更优选是至70～80℃进行提取；提取的次数通常为1～3次，每次提取0.5～2h，每次提取时水的加入量为原料重量的5～12倍。步骤b)中，甲醇的浓度优选为90～100v/v%，乙醇的浓度优选为70～100v/v%；提取的次数通常为1～3次，每次提取1～2h，每次提取时甲醇或乙醇的加入量优选为原料重量的8～12倍；该步骤中，浓缩液可以趁热离心，也可以静置冷却后再离心，采用趁热离心可以使制得的卷柏总黄酮提取物中获得相对较高的穗花杉双黄酮含量，而采用静置冷却后再离心的方式则可以使制得的卷柏总黄酮提取物中获得相对较高的穗花杉双黄酮收率。步骤c)中，所述搅拌脱脂的时间在30min以上，优选为30～60min。该步骤中，所述6号溶剂油或石油醚的用量为沉淀物重量的5～10倍。
卷柏中含有大量的水溶性物质，这些水溶性物质在直接用甲醇或乙醇提取时也会被提取出来，而穗花杉双黄酮本身的水溶性很差，几乎不溶于水，所以当直接用甲醇或乙醇提取对卷柏进行提取时会造成后序纯化工序(如过树脂柱、萃取等工序)的很大负担，本方法通过先用水提并弃去水提液的操作以除去卷柏中大量的水溶性物质(相当于杂质)，大大减少了后序纯化工序的负担；另外，现有技术中通常采用加入萃取试剂对提取液进行萃取，常用的萃取试剂为乙酸乙酯等有机溶剂，但提取液中的油脂等脂性杂质及其他非极性物质在乙酸乙酯中也具有一定的溶解度，因而在萃取操作收集的有机相中会带有一定量的脂性杂质，导致产品纯度的降低；而本发明是对收集的沉淀物进行搅拌脱酯操作，相当于是将沉淀物中的油脂等脂性杂质及其他非极性物质溶于加入的脱酯溶剂(6号溶剂油或石油醚)中，通过过滤的方式使这些杂质与黄酮提取物分离，有效避免了因杂质溶于萃取试剂中造成产品纯度降低的现象，而且有利于产品的干燥，所得产品的性状好。采用上述方法制得的卷柏总黄酮提取物中穗花杉双黄酮的含量在30～41%，总黄酮含量在62～70%。
上述纯化方法的步骤2)中，用于溶解卷柏总黄酮提取物的甲醇或乙醇的用量和浓度与现有技术相同，优选甲醇的浓度为60～80v/v%，乙醇的浓度为30～60v/v%；优选甲醇或乙醇的用量为溶解卷柏总黄酮提取物重量的8～20倍。该步骤中，优选采用1～2v/v%的盐酸溶液用来洗脱。洗脱的过程中采用薄层层析(TLC)跟踪检测。
上述纯化方法的步骤3)中，洗脱液通常用氢氧化钠溶液、碳酸钠溶液或碳酸氢钠溶液等碱液来调节其pH值，上述碱液的浓度通常为5～20w/w%。所述用于重结晶的甲醇或乙醇的浓度与现有技术相同，优选甲醇的浓度为60～80v/v%，乙醇的浓度为30～60v/v%。该步骤中，通常是将调pH值后的洗脱液浓缩至原料重量的2～4倍，静置析晶析晶的时间通常为24～72h。
与现有技术相比，本发明采用既具有吸附功能同时带有离子交换功能的ADS-7大孔树脂对卷柏总黄酮提取物进行层析，在将穗花杉双黄酮吸附在大孔树脂上的同时，起到了非常好的除杂作用，使得在用盐酸溶液解析后，洗脱液经pH调节、两次结晶操作，即可获得纯度达95%以上(HPLC法)的穗花杉双黄酮产品，且穗花杉双黄酮产品的收率在71%以上(以卷柏总黄酮提取物中穗花杉双黄酮的含量为基准计算)。
具体实施方式
下面以具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于这些实施例。
实施例1
1)将卷柏原料粉碎至20～40目，取100kg，加入8倍原料重量的水加热至80℃提取1.5h，过滤，弃掉滤液，留下卷柏药材；
2)水提取之后的卷柏药材加入10倍原料重量的80%（v/v）乙醇，加热回流提取1.5h，过滤，收集滤液；滤渣再加入7倍原料重量的80%（v/v）乙醇，加热回流提取1.5h，过滤，收集滤液；合并滤液，得到提取液，提取液浓缩回收乙醇，再浓缩至原料重量1.5倍的浸膏；
3)浸膏冷却静置12小时，离心，收集滤饼；
4)将滤饼捣碎，加入滤饼重量7倍量的6号溶剂油脱脂(脱脂时间为60min，整个脱酯过程中不停搅拌)，过滤收集滤饼，滤饼真空干燥，粉碎，得到2.1kg卷柏总黄酮提取物；所得产品外观为棕褐色粉末，紫外分光光度法检测总黄酮含量为64.24%，其中穗花杉双黄酮经HPLC法检测含量为32.16%；
5)上述所得的卷柏总黄酮提取物用相当于其重量14倍的40%（v/v）乙醇加热溶解，冷却后进ADS-7强极性大孔树脂，水洗至流出液变清；然后用1%（v/v）的盐酸溶液洗脱，收集洗脱液；洗脱液用10%(w/w)氢氧化钠溶液调其至pH=5～6，然后浓缩至原料重量的3倍，冷却静置30小时，析晶，过滤收集晶体，得到粗晶体；粗晶体用30%（v/v）乙醇加热溶解，放冷充分析晶，过滤收集重结晶的晶体，真空干燥，得到穗花杉双黄酮精制产品0.52kg，经HPLC检测含量为96.21%。
实施例2
1)将卷柏原料粉碎至20目，取200kg，加入5倍原料重量的水加热至100℃提取0.5h，过滤，弃掉滤液，留下卷柏药材；
2)水提取之后的卷柏药材加入10倍原料重量的95%（v/v）乙醇，加热回流提取1h，过滤，收集滤液；滤渣再加入6倍原料重量的95%（v/v）乙醇，加热回流提取1h，过滤，收集滤液；合并滤液，得到提取液，提取液浓缩回收乙醇，再浓缩至原料重量2倍的浸膏；
3)浸膏冷却静置4小时，离心，收集滤饼；
4)将滤饼捣碎，加入滤饼重量5倍量的石油醚脱脂(脱脂时间为30min，整个脱酯过程中不停搅拌)，过滤收集滤饼，滤饼真空干燥，粉碎，得到4.6kg卷柏总黄酮提取物；所得产品外观为棕褐色粉末，紫外分光光度法检测总黄酮含量为63.47%，其中穗花杉双黄酮经HPLC法检测含量为31.66%；
5)上述所得的卷柏总黄酮提取物用相当于其重量20倍的30%（v/v）乙醇加热溶解，冷却后进ADS-7强极性大孔树脂，水洗至流出液变清；用0.5%（v/v）的盐酸溶液洗脱，收集洗脱液；洗脱液用氢氧化钠溶液中和至pH=4～5，浓缩至原料重量的2倍，冷却静置72小时，析晶，过滤收集晶体，得到粗晶体；粗晶体用30%（v/v）乙醇加热溶解，放冷充分析晶，过滤收集重结晶的晶体，真空干燥，得到穗花杉双黄酮精制产品1.21kg，经HPLC检测含量为95.72%。
实施例3
1)将卷柏原料粉碎至10～20目，取150kg，加入10倍原料重量的水加热至60℃提取2h，过滤，弃掉滤液，留下卷柏药材；
2)水提取之后的卷柏药材加入12倍原料重量的70%（v/v）乙醇，加热回流提取2h，过滤，收集滤液；滤渣再加入9倍原料重量的75%（v/v）乙醇，加热回流提取2h，过滤，收集滤液；合并滤液，得到提取液，提取液浓缩回收乙醇，再浓缩至原料量1倍的浸膏；
3)浸膏冷却静置4小时，离心，收集滤饼；
4)将滤饼捣碎，加入滤饼重量10倍量的6号溶剂油脱脂(脱脂时间为50min，整个脱酯过程中不停搅拌)，过滤收集滤饼，滤饼真空干燥，粉碎，得到3.2kg卷柏总黄酮提取物；所得产品外观为棕褐色粉末，紫外分光光度法检测总黄酮含量为62.7%，其中穗花杉双黄酮经HPLC法检测含量为30.46%；
5)上述所得的卷柏总黄酮提取物用相当于其重量8倍的50%（v/v）乙醇加热溶解，冷却后进ADS-7强极性大孔树脂，水洗至流出液变清；用2%（v/v）的盐酸溶液洗脱，收集洗脱液；洗脱液用氢氧化钠溶液中和至pH=5～5.5，浓缩至原料量的4倍量，冷却静置45小时，析晶，过滤收集晶体，得到粗晶体；粗晶体用30%（v/v）乙醇加热溶解，放冷充分析晶，过滤收集重结晶的晶体，真空干燥，得到穗花杉双黄酮精制产品0.73kg，经HPLC检测含量为95.83%。
实施例4
1)将卷柏原料粉碎至10～20目，取150kg，加入10倍原料重量的水加热至100℃提取2h，过滤，弃掉滤液，留下卷柏药材；
2)水提取之后的卷柏药材加入10倍原料重量的95%（v/v）甲醇，加热回流提取2h，过滤，收集滤液；滤渣再加入8倍原料重量的95%（v/v）甲醇，加热回流提取1.5h，过滤，收集滤液；滤渣再加入8倍原料重量的95%（v/v）甲醇，加热回流提取1h，过滤，收集滤液；合并滤液，得到提取液，提取液浓缩回收甲醇，再浓缩至原料量1.5倍的浸膏；
3)浸膏冷却静置4小时，离心，收集滤饼；
4)将滤饼捣碎，加入滤饼重量8倍量的石油醚脱脂(脱脂时间为50min，整个脱酯过程中不停搅拌)，过滤收集滤饼，滤饼真空干燥，粉碎，得到3.4kg卷柏总黄酮提取物；所得产品外观为棕褐色粉末，紫外分光光度法检测总黄酮含量为61.94%，其中穗花杉双黄酮经HPLC法检测含量为30.21%；
5)上述所得的卷柏总黄酮提取物用相当于其重量8倍的60%（v/v）甲醇加热溶解，冷却后进ADS-7强极性大孔树脂，水洗至流出液变清；用1.5%（v/v）的盐酸溶液洗脱，收集洗脱液；洗脱液用氢氧化钠溶液中和至pH=4，浓缩至原料量的2倍量，冷却静置60小时，析晶，过滤收集晶体，得到粗晶体；粗晶体用70%（v/v）甲醇加热溶解，放冷充分析晶，过滤收集重结晶的晶体，真空干燥，得到穗花杉双黄酮精制产品0.77kg，经HPLC检测含量为95.37%。
实施例5
取卷柏总黄酮提取物7.5kg(购于湖南康麓生物科技有限公司)，其中总黄酮含量为62.56%，穗花杉双黄酮含量为30.16%)，用相当于其重量8倍的40%（v/v）乙醇加热溶解，冷却后进ADS-7强极性大孔树脂，水洗至流出液变清；用1.5%（v/v）的盐酸溶液洗脱，收集洗脱液；洗脱液用氢氧化钠溶液中和至pH=4.5，浓缩至原料量的3倍量，冷却静置30小时，析晶，过滤收集晶体，得到粗晶体；粗晶体用40%（v/v）乙醇加热溶解，放冷充分析晶，过滤收集重结晶的晶体，真空干燥，得到穗花杉双黄酮精制产品1.68kg，经HPLC检测含量为96.76%。