苯噻菌酯半抗原、人工抗原、特异抗体制备方法及其用途.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103613563 A (43)申请公布日 2014.03.05 CN 103613563 A (21)申请号 201310667544.9 (22)申请日 2013.12.11 C07D 277/74(2006.01) C07K 14/765(2006.01) C07K 14/77(2006.01) C07K 16/44(2006.01) G01N 33/577(2006.01) (71)申请人 南京农业大学 地址 210095 江苏省南京市卫岗 1 号南京农 业大学科技处钱宝英 (72)发明人 王鸣华 袁玉龙 华修德 施海燕 (54) 发明名称 苯噻菌酯半抗原、 。

2、人工抗原、 特异抗体制备方 法及其用途 (57) 摘要 本发明涉及苯噻菌酯抗原、 抗体的制备及其 应用， 属于免疫化学分析技术领域。苯噻菌酯化 学名称为 2-(5- 甲氧基 -2- 苯并噻唑 )- 硫甲 基 -(E)- 甲氧基亚甲基 苯乙酸甲酯。在碱 性条件下， 通过对苯噻菌酯结构中羧酸酯进行水 解， 合成了人工半抗原， 其化学名称为 2-(5- 甲 氧基-2-苯并噻唑)-硫甲基-(E)-甲氧基亚 甲基 苯乙酸， 将其分别于牛血清蛋白和卵清蛋 白偶联制备人工抗原。将人工抗原免疫 BALB c 雌性小鼠， 制得苯噻菌酯的特异性单克隆抗体。 这 种抗体与其他化合物不发生交叉反应。用该抗体 建立的酶。

3、联免疫层析分析方法可用于快速、 灵敏、 方便和廉价检测环境和农产品中苯噻菌酯残留。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 8 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书8页 (10)申请公布号 CN 103613563 A CN 103613563 A 1/1 页 2 1. 式 (I) 所示化合物 ： 2. 式 (I) 所示化合物的制备方法， 包括如下步骤 ： 在氢氧化锂碱性条件下， 将苯噻菌酯 水解反应， 获得所述化合物。 3. 式 (II) 所示人工抗原 ： 。 4. 权利 3 所述的人工抗原， 其特征在于 ： 采用碳二亚胺法将人工。

4、半抗原与牛血清蛋白 (BSA) 偶联， 采用混合酸酐法与卵清蛋白 (OVA) 偶联。 5. 权利要求 3 或 4 所述人工抗原在制备苯噻菌酯特异性抗体中的应用。 6. 权利要求 5 所述的应用， 其特征在于 ： 所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。 7. 以权利要求 3 或 4 所述人工抗原为免疫原制备得到的单克隆抗体。 8.权利要求7所述单克隆抗体， 其特征在于 ： 抗体重链可变区氨基酸序列为 ： QVKLQQSG GGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMTWVRQTPEKRLEWVASISSGGSTYYPDSVKGRFTISRDNARNILYLQMTSL RSEDTAIYYCAR。

5、LRTVVDYWGQGTTVTVSS ： 轻链可变区氨基酸序列为 ： ALMSASPGERVTLTCSASSSVSY MYWYQQKPGSSPKPWIYLTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISNMEAEDAATYYCQQWSSNPYTFGG。 9.权利要求3或4所述人工抗原， 或， 权利要求7或8所述单克隆抗体在检测苯噻菌酯 单中的应用。 权 利 要 求 书 CN 103613563 A 2 1/8 页 3 苯噻菌酯半抗原、 人工抗原、 特异抗体制备方法及其用途 一、 技术领域 0001 本发明涉及一种苯噻菌酯人工半抗原、 人工抗原、 特异性抗体制备方法及其用途。 二、 背景技术。

6、 0002 甲氧基丙烯酸酯类 (Strobilurins) 杀菌剂是以天然抗生素为先导开发成功的一 类新型杀菌剂， 具有广谱、 高效、 环境友好的特点， 近年来成为杀菌剂创制研究的热点。 苯噻 菌酯 (benzothiostrobin) 是由华中师范大学研发的一种新型 Strobilurins 类杀菌剂。苯 噻菌酯具有杀菌谱广， 杀菌活性高， 施用量低， 持效期长等优点， 具有保护及治疗作用， 对作 物白粉病、 霜霉病均表现出优越的防效， 具有良好的市场开发前景。 为预防苯噻菌酯应用存 在的潜在风险， 需要一种灵敏、 快速、 选择性的残留检测方法。 0003 0004 目前苯噻菌酯残留检测方法。

7、采用仪器分析方法， 如液相色谱分析法。这些仪器分 析方法灵敏准确， 但检测仪器昂贵、 样品前处理较繁琐、 检测费时费力、 难以满足大量样品 快速简便检测的需要。 0005 免疫检测方法具有快速、 廉价、 简便、 灵敏、 特异的优点， 在大量样品快速筛选和现 场监测中显示出独特优势。ELISA 是一种将酶催化反应和免疫反应相结合的免疫标记测定 技术， 有酶催化反应的高灵敏度和抗原抗体反应的高特异性， 在灵敏度方面有很大的优势。 ELISA作为一种快速灵敏的检测方法， 在许多小分子免疫分析中已得到较成熟的应用。 通过 化学合成苯噻菌酯半抗原和人工抗原， 制备针对苯噻菌酯的特异性抗体， 建立苯噻菌酯。

8、免 疫学检测方法。该发明方法的完成， 将解决苯噻菌酯半抗原合成， 抗体制备等关键技术， 建 立苯噻菌酯的 ELISA 快速检测技术。该发明不仅为食品安全检测， 而且为我国农产品等的 出入境检测、 环境监测部门的水域监测提供有效的技术手段和检测方法。对我国农产品的 可持续发展和食品安全问题具有重要的现实意义和重要的社会、 经济价值。目前国内外尚 未见有关苯噻菌酯的人工半抗原、 人工抗原和抗体的报道。 三、 发明内容 0006 技术问题 0007 本发明的目的是提供一种制备苯噻菌酯半抗原、 人工抗原及特异性单克隆抗体的 制备方法。 0008 技术方案 说 明 书 CN 103613563 A 3 。

9、2/8 页 4 0009 本发明包括 ： 0010 1 半抗原合成 0011 对苯噻菌酯苯环上羧酸酯进行碱性水解合成了人工半抗原， 再用碳二亚胺法与牛 血清蛋白(BSA)偶联获得免疫抗原， 用混合酸酐法与卵清蛋白(OVA)偶联获得包被抗原。 其 分子结构如下 ： 0012 0013 2 抗体制备 0014 将制备好的免疫抗原免疫 BALB c 雌性小鼠， 免疫剂量为 200L 只 ( 按蛋白 浓度计)， 共免疫五次。 首次免疫由等体积的免疫抗原和弗氏完全佐剂乳化， 腹腔注射， 以后 用等体积免疫抗原和弗氏不完全佐剂乳化。 从第三次免疫开始， 每次免疫后尾静脉采血， 测 定效价。待免疫血清效价稳。

10、定后， 将生长状态良好的骨髓瘤细胞 SP2 0 与上面血清效价 最好的小鼠脾脏细胞进行细胞融合制备杂交瘤细胞。通过系列筛选和亚克隆， 最后得到一 株能稳定分泌抗苯噻菌酯单克隆抗体的杂交瘤细胞株， 再将这杂交瘤细胞株注射小鼠腹内 制得腹水， 得到腹水后， 采用 Protein A 免疫亲和柱纯化腹水得到抗体， 冷冻干燥得到抗体 冻干粉。 0015 3 免疫分析方法建立及应用 0016 对制备的苯噻菌酯抗体进行效价、 特异性及灵敏度的分析， 建立苯噻菌酯的 ic-ELISA。 将建立的间接竞争酶免疫分析方法应用于环境样品和农产品中苯噻菌酯的残留 量检测。 0017 有益效果 0018 本发明优点和。

11、积极效果表现在 ： 0019 1 新颖实用 ： 苯噻菌酯抗原的合成与抗体制备技术具有重要的实用价值和实际意 义。首次设计合成苯噻菌酯人工抗原， 经免疫 BALB c 雌性小鼠产生特异性单克隆抗体， 为苯噻菌酯残留的高效快速分析提供了一种新的方法。 传统的农药仪器分析前处理过程繁 琐， 成本高， 耗时长， 大量使用有机溶剂易造成环境污染， 且对操作人员素质要求较高， 难以 满足农产品安全分析对快速、 简便、 准确、 大量检测的需求。而本发明提供的苯噻菌酯免疫 分析方法具有操作简单快速 ( 只需要 2-3 小时 )、 分析成本低、 分析容量大、 安全可靠、 容易 说 明 书 CN 10361356。

12、3 A 4 3/8 页 5 普及推广， 特别适用于大批量样品检测和现场监测， 可以与传统仪器分析方法互为补充。 0020 2 准确度高 ： 苯噻菌酯抗体经纯化制成冻干粉后的效价为 2106。抗体特异性识 别苯噻菌酯， 与其他甲氧基丙烯酸酯类杀虫剂没有明显的交义反应。 从而可知， 所制备的抗 体特异性强， 可快速准确地分析检测苯噻菌酯在样本中的残留量。应用该免疫方法苯噻菌 酯在实际样品中的的回收率为 80.43-113.83， 变异系数低于 7.8， 符合残留分析标准。 0021 3 灵敏度高 ： 建立的 ic-ELISA 的抑制中浓度 (IC50) 为 7.55g L， 检测限 (IC10， 。

13、LOD) 为 0.428g L， 线性范围为 0.428-54g L。 四、 具体实施方式 0022 1 人工半抗原的合成 0023 对苯噻菌酯苯环上羧酸酯进行碱性水解， 合成具有三个原子连接臂的半抗原， 既 最大限度的保留了苯噻菌酯特征基团， 又形成了羧基末端基团， 能较好的跟蛋白偶联。 产物 纯化后通过质谱 (ESI) 和核磁共振氢谱 (1H-NMR) 鉴定。苯噻菌酯人工半抗原的分子结构 式为 ： 0024 0025 1.1 人工半抗原的合成 0026 称取 8.02g(0.02mol) 苯噻菌酯原药和 30mL 四氢呋喃加入到 100mL 的三角瓶中， 然斤加入10.08mL5氢氧化锂溶。

14、液(苯噻菌酯 ： 氢氧化锂1 ： 1.05)， 室温下搅拌反应4个 小时加入20mL水， 用乙酸乙酯萃取三次， 每次40mL， 弃去有机相， 水相用浓盐酸调节pH值至 2.0， 用乙酸乙酯萃取三次， 每次 30mL， 合并有机相， 用无水硫酸钠干燥， 减压浓缩， 得黄色油 状物用硅胶柱纯化， 梯度洗脱 ： 150mL 的甲醇 ： 二氯甲炕 1 ： 50( 体积比 ) 的混合液， 100mL 的甲醇 ： 二氯甲烷 1 ： 30( 体积比 ) 的混合液， 收集体积比为 2 ： 8 的馏分， 浓缩近干， 得到 半抗原。 0027 1.2 苯噻菌酯人工半抗原的鉴定 0028 将纯化后的半抗原经ESI-。

15、MS、 1H-NMR测定， 以鉴定其分子结构。 质谱和核磁共振谱 信息如下 ： ESI-MS， m z， 346M+H+ 和 368M+Na+。 1H-NMR(400MHz， DMSO)， ： 3.79(s， 2H， CH2COO)， 3.86(s， 3H， OCH3)， 4.67(s， 2H， SCH2)， 7.01(dd， 1H， ArH)， 7.32-7.22(m， 3H， ArH)， 7.47(d， 1H， ArH)， 7.52(m， 1H， ArH)， 7.88(m， 1H， ArH)， 12.52(s， 1H， COOH)。 0029 从以上信息综合分析可知， 所合成的产物为目标人。

16、工半抗原。 0030 2 人工抗原的合成 0031 苯噻菌酯人工抗原的分子结构式如下 ： 0032 说 明 书 CN 103613563 A 5 4/8 页 6 0033 2.1 免疫抗原的合成 0034 免疫抗原的合成采用碳二亚胺法。将 69mg(0.2mmol) 苯噻菌酯半抗原溶解在 1mL 的 N， N- 二甲基甲酰胺 (DMF) 中， 然后在溶液中加入 69.0mg(0.6mmol) 的 N- 羟基琥珀酰亚 胺 (NHS)， 室温下搅拌反应 15min， 再加入 62.7mg(0.3mmol) 的二环己基碳二亚胺 (DCC)， 室 温下搅拌反应过夜。离心， 取上清液 0.5mL， 将上。

17、清液缓慢加入到 12mL 浓度为 10mg mL 牛 血清蛋白 (BSA) 的碳酸盐缓冲溶液 (CBS， 0.1mol L， pH9.6) 中， 磁力搅拌下反应 4h。将 反应完成斤的溶液装入预处理好的透析袋， 4下先用蒸馏水透析3次(间隔2-3h)， 然后用 磷酸盐缓冲溶液 (PBS， 0.01mol L， pH7.4) 透析 72h， 每天换液 3-5 次， 即得免疫抗原， 分 装， 保存于 -20的冰箱中。 0035 2.2 包被抗原的合成 0036 包被抗原的合成采用混合酸酐法。将 86.25mg(0.25mmol) 半抗原， 溶解在 1mL 的 N， N- 二甲基甲酰胺 (DMF) 。

18、中， 然后边搅拌边在溶液中加入 60L 三正丁胺和 30L 氯甲酸 异丁酯， 室温下反应 1h， 再缓慢加入到 12mL 的 10mg mL 卵清蛋白 (OVA) 的 CBS(0.1mol L， pH9.6) 中， 磁力搅拌下反应 2h， 待反应完成后， 装入透析袋， 4下先用蒸馏水透析 3 次 ( 间隔 2-3h)， 然后用 PBS(0.01mol L， pH7.4) 透析 72h， 每天换液 3-5 次， 即得包被抗原， 分装， 保存于 -20的冰箱中备用。 0037 2.3 人工抗原的鉴定 0038 对半抗原、 载体蛋白及偶联物进行紫外 (200nm 400nm) 扫描。从紫外谱图看到 。

19、偶联物紫外吸收光谱较载体蛋白和半抗原的吸收光谱发生了明显的变化， 具有载体蛋白和 半抗原的紫外吸收特征， 说明半抗原和载体蛋白偶联成功。根据它们在 280nm 波长下的摩 尔吸光系数估算得到免疫抗原和包被抗原的结合比分别为 17 ： 1 和 9 ： 1。 0039 3 抗体制备 0040 3.1 免疫 BALB c 雌性小鼠制备抗血清 0041 采用腹腔注射， 免疫 BALB c 雌性小鼠， 初次免疫用等量弗氏完全佐剂 (FCA) 乳 化免疫原， 免疫剂量为 200L 只 ( 按蛋白浓度计 )， 3 周后用弗氏不完全佐剂 (FIA) 乳化 加强免疫， 免疫剂量为 200L 只， 以后每间隔 2。

20、 周加免一次， 共加免 4 次。具体免疫方案 见下表。 说 明 书 CN 103613563 A 6 5/8 页 7 0042 0043 基础免疫前 1 周， 鼠尾静脉采集阴性血， 并制备血清作为阴性对照。从第三次免疫 开始， 每次免疫后尾静脉采血， 用间接非竞争酶联免疫吸附分析法测定抗血清的效价 ( 血 清的稀释倍数即为效价 )。 0044 待免疫血清效价稳定后， 将生长状态良好的骨髓瘤细胞 SP2 0 与上面血清效价 最好的小鼠脾脏细胞进行细胞融合制备杂交瘤细胞。通过系列筛选和亚克隆， 最后得到一 株能稳定分泌抗苯噻菌酯单克隆抗体的杂交瘤细胞株， 再将这杂交瘤细胞株注射小鼠腹内 制得腹水。。

21、 0045 3.2 抗体的纯化 0046 单克隆抗体使用 PALL Protein A 柱进行纯化， 具体步骤如下 ： 0047 (1)用510倍柱体积的平衡缓冲液PB(0.025M， pH7.4)洗涤平衡Protein A柱 ； 0048 (2) 含抗体的高密度培养上清液 12000rpm 离心后， 上清与 4 倍体积平衡缓冲液混 合， 缓慢加入层析柱 ； 0049 (3) 用 5 倍柱体积以上的平衡缓冲液洗柱， 至流出液无蛋白检出 ； 0050 (4) 加入 10 倍柱体积的洗脱缓冲液 (100mM 柠檬酸钠， Ph4) 洗脱吸附的抗体， 收集 洗脱液 ； 0051 (5) 向收集的洗脱液。

22、中加入 1 3 体积的 1M Tris-HCl， pH8.0 ； 0052 (6) 超滤离心管去盐， 冷冻抽干。 0053 3.3 抗体效价 0054 经纯化制成的抗体冻干粉后的效价为 2106。 0055 3.4 抗体可变区氨基酸序列的测定 0056 3.4.1 提取 mRNA 0057 (1) 收集细胞瓶里的杂交瘤细胞， 弃上清， 加 TRIZOL 试剂 1ml， 立即吹打。( 观察 ： 液体变粘稠， 细胞脱壁 )。 0058 (2)将各孔内消化好的细胞裂解液吸到一DEPC处理过的1.5ml EP管中， 加新开的 氯仿 0.2ml， 轻摇 20 秒。 0059 (3)室温静置5分钟后， 1。

23、2000rpm， 15min， 4， 离心。 然后取上清无色水相到EP管 (DEPC 处理过 )， 加等体积新开的异丙醇， 颠倒离心管数次， 混匀斤室温下静置 10 分钟。 0060 (4)12000rpm， 10 分钟， 4， 离心。观察总 RNA 在管底的白色沉淀， 弃去上清， 75 乙醇 1.0ml 洗涤 ( 用 DEPC 水新配制 ) 后， 7500rpm， 5min， 4离心， 重复两次洗涤。 0061 (5) 去上清， 点离， 用小 Tip 吸干液体。气干沉淀 5-10 分钟， DEPC 处理水 20-30ul 说 明 书 CN 103613563 A 7 6/8 页 8 加入， 。

24、中枪打匀， 55-60水浴 10 分钟溶解总 RNA， 测 OD 值。 0062 (6)1.2琼脂糖电泳， 155， 30min。 0063 3.4.2 反转录 0064 用 PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser 试剂盒 (TaKaRa) 反转录 得到 cDNA， -20冻存。 0065 3.4.3DNA 片段扩增及测序 0066 用Trans-Tap酶试剂盒(北京全式金生物有限公司)， 以cDNA为模板， 进行PCR扩 增， 得到目的 DNA 片段， 进行测序 ( 北京六合华大基因科技股份有限公司上海分公司 )。 0067 PCR 条件 。

25、： 0068 轻 链 ： 95 ， 5min-94 ， 30s-49 ， 30s-72 ， 30s- 重 复 循 环 30 次 -72， 8min-12， 终止 0069 重 链 ： 95 ， 5min-94 ， 30s-60 ， 30s-72 ， 30s- 重 复 循 环 30 次 -72， 8min-12， 终止 0070 3.4.3 抗体可变区氨基酸序列的确定 0071 经过翻译序列为 ： 0072 (1) 抗体重链可变区氨基酸序列为 ： 0073 QVKLQQSGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMTWVRQTPEKRLEWVASISSGGSTYYPDSVKGRFTI 。

26、SRDNARNILYLQMTSLRSEDTAIYYCARLRTVVDYWGQGTTVTVSS ； 0074 (2) 抗体轻链可变区氨基酸序列为 ： 0075 ALMSASPGERVTLTCSASSSVSYMYWYQQKPGSSPKPWIYLTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISNM EAEDAATYYCQQWSSNPYTFGG。 0076 4 苯噻菌酯 ic-ELISA 的建立 0077 4.1 方法原理 0078 采用间接竞争免疫分析方法。将农药分子与大分子载体 ( 如蛋白质 ) 偶联制得的 复合物作为包被抗原吸附于固相载体(96孔酶标板)上， 制备成固相抗原， 然后加入待测农。

27、 药和相应抗体。 固相抗原， 待测农药， 与抗体进行竞争结合反应， 待测农药含量多， 被结合在 固相抗原上的抗体就少， 反之结合在固相抗原的抗体多， 反应后加入酶标二抗 ( 只能与结 合在固相抗原上的抗体相结合 )， 最后用底物进行显色加以测定， 当抗体量一定时， 加入的 待测农药量越多， 与固相抗原结合的抗体就越少， 显色就减弱， 结合率降低， 反之， 则显色增 强， 结合率升高， 因而可根据已知量农药的标准曲线和待检样品的结合率， 推算出待测农药 的浓度。 0079 4.2 抗原抗体工作浓度 0080 ic-ELISA抗原抗体工作浓度的确定用方阵滴定法， 选择OD值为1.0时的抗原抗体 稀。

28、秆浓度。经实验， 包被抗原浓度 0.500g/mL， 抗体浓度 0.035g mL 作为最适工作浓 度。 0081 4.3 间接竞争免疫反应程序 0082 4.3.1 包被 0083 用 CBS 缓冲液 (0.05mol L， pH9.6) 将包被抗原稀秆至最适浓度， 100L 孔加 入 96 孔酶标板 (MaxisorpTM 透明聚乙烯板 )， 4包被过夜 ； 说 明 书 CN 103613563 A 8 7/8 页 9 0084 4.3.2 封闭 0085 取出包被好的酶标板， 弃去包被液， 用0.5吐温-20的磷酸盐缓冲溶液(PBST)洗 涤后， 加入用 PBS 缓冲溶液稀释的 1.0的。

29、 OVA 的 PBS(0.01M， pH7.4) 封闭液 200L 孔， 于 37温箱中温育 50min。 0086 4.3.3 加样 0087 取经封闭和洗涤后的酶标板， 加入系列浓度的苯噻菌酯标准液或待测样品提取液 50L 孔， 再加入抗体稀秆液 50L 孔， 同时设置空白对照和阴性对照， 37温育 1h。 0088 4.3.4 加酶标二抗 0089 弃去孔内液体， 用 PBST 溶液洗涤。加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠 10000 倍稀 释液 100L/ 孔， 37温育 1h， 弃去孔内液体， 用 PBST 溶液洗涤。 0090 4.3.5 显色反应 0091 加入四甲基联苯胺 (TMB。

30、)-H2O2 底物溶液 100L 孔， 37温箱中温育 15min， 用 50L孔2molLH2SO4终止反应。 在iMarkTM酶标仪上测定490nm波长下的吸光值(A)。 0092 4.4 标准曲线和灵敏度 0093 根据结合率与苯噻菌酯浓度的对数作图即得到标准曲线， 计算抑制中浓度 (IC50) 及最低检测限 (IC10， LOD)。结合率 (B Bo， ) 以下式计算 ： 0094 B Bo( ) (Ax-Amin) (Amax-Amin)100 0095 式中 ： Ax 为不加药时的吸光值， Amax 为阴性对照的吸光值， Amin 为空白对照的吸 光值。 0096 标准曲线的线性方。

31、程为 ： B Bo( ) -24.549LogC+17.168 0097 苯噻菌酯浓度在 0.428-54g/L 范围内， 呈线性关系， 相关系数为 R2 0.9976， IC50 为 7.55g L， LOD 为 0.428g L。 0098 4.5 抗体的特异性 0099 抗体的特异性是指它同特异性抗原结合的能力与同该抗原类似物结合能力的比 较。常用交叉反应作为评价的重要标准。交叉反应越小， 抗体的特异性越好。 0100 制备的抗体除与吡啶醚菌酯有微弱的交义反应外 (CR 0.34 )， 与其他甲氧 基丙烯酸酯类杀菌剂没有交叉反应 (CR 0.05 )。从而可知， 所制备的抗体特异性强， 。

32、可以用于苯噻菌酯的分析。 0101 5 样品添加分析 0102 5.1 提取方法 0103 5.1.1 水样 0104 水样 ( 或经过滤 ) 添加苯噻菌酯制成三个不同浓度水平 (0.01， 0.05， 0.5mg/kg) 的样品， 重复3次， 设置对照。 混匀， 放置过夜后， 用含10甲醇的PBS与待测水样等量混匀 进行测量。 0105 5.1.2 土壤或农产品样品 ( 大米， 梨， 番茄 ) 0106 称取粉碎后的样品 10g， 装入三角瓶中。苯噻菌酯添加的方式与水样相同。混匀， 放置过夜， 在样品中加入 20mL 乙腈超声萃取 15min 两次。在 4000rpm 离心 5min， 合并。

33、两次 上清液， 倒入盛有5g氯化钠的具塞量筒中， 剧烈振荡， 使乙腈与水分层， 静置10min， 取25mL 至平底烧瓶。用旋转蒸发器浓缩近干， 用含 5甲醇的 PBS 定容。 说 明 书 CN 103613563 A 9 8/8 页 10 0107 5.2 样品的 ELISA 分析 0108 样 品 分 析 步 骤 参 考 4.3。 经 分 析 可 知， 该 ELISA 的 苯 噻 菌 酯 回 收 率 为 80.43-113.83， 平均变异系数为 1.2-7.8。 0109 实际样品中苯噻菌酯残留量检测参照 5.1 和 5.2 方法进行。 0110 本发明建立的苯噻菌酯残留的免疫分析方法符合苯噻菌酯残留分析标准。 该方法 可用于环境和农产品中苯噻菌酯的残留检测， 且前处理方法较仪器分析方法简单， 适合大 批量检测和现场监测。 说 明 书 CN 103613563 A 10 。