喹唑啉衍生物及其制备方法和用途.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103554091 A (43)申请公布日 2014.02.05 CN 103554091 A (21)申请号 201310542061.6 (22)申请日 2013.11.05 C07D 405/14(2006.01) A61K 31/517(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (71)申请人沈阳工业大学地址 110870 辽宁省沈阳市经济技术开发区沈辽西路 111 号 (72)发明人蔡志强李素君侯玲胡志泉孙洪涛李志利郭洪彬蔡奥飞 (74)专利代理机构沈阳智龙专利事务所 ( 普通合伙 ) 21115 代理人宋铁军周。

2、楠 (54) 发明名称喹唑啉衍生物及其制备方法和用途 (57) 摘要本发明属药物化学技术领域，涉及通式（）喹唑啉衍生物及其制备方法，及其与无机或有机的酸或碱所形成的生理上可接受的盐，含有它们的药物组合物，及其在制备治疗疾病的药物，特别是特征为异常erbB家族PTK活性的疾病药物上的应用。所述化合物具有有价值的药理性质，特别是对因酪氨酸激酶所引起的信号转导有抑制效果。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页说明书 9 页附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书1页说明书9页附图1页 (10)申请公布号 CN 。

3、103554091 A CN 103554091 A 1/1 页 2 1. 通式（）所示的喹唑啉衍生物或其药学上可接受的盐：其中， R1 表示：氢、 C1-4烷烃、 C1-4烷氧烃或卤素； R2 表示：氢、乙酰基、环丙甲酰基、环己基甲酰基、甲磺酰基、苯甲酰基、对甲苯甲酰基、苯磺酰基或对甲苯磺酰基。 2. 根据权利要求 1 所述的喹唑啉衍生物或其可药用盐，其特征在于： R1 优选自单取代的氢、甲基、甲氧基、氟、氯或溴。 3. 根据权利要求 1 所述的喹唑啉衍生物或其可药用盐，其特征在于： R1 优选自双取代的氢、甲基、甲氧基、氟、氯或。

4、溴。 4. 根据权利要求 1、 2 或 3 所述的喹唑啉衍生物或其药学上可接受的盐，其特征在于：适用的酸为：盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、富马酸、丁二酸、乳酸、柠檬酸、酒石酸、水杨酸、甲磺酸、琥珀酸、马来酸或苹果酸。 5. 权利要求 1、 2 或 3 中所述任一化合物作为制备治疗以异常 ErbB 家族 PTK 活性为特征的疾病的药物中的应用。 6. 权利要求 5 所述的用途，其特征在于：所述 ErbB 家族 PTK 选自 EGFR、 ErbB1(EGFR) 和 ErbB2(HER2)。 7. 权利要求 1、 2 或 3 中所述任一化合物或盐类，以及含有。

5、该任一化合物或盐类作为活性成分的药物组合物作为制备抗癌药物的应用。 8. 根据权利要求 7 所述的应用，其用于制备皮下给药或口服的药物制剂。权利要求书 CN 103554091 A 2 1/9 页 3 喹唑啉衍生物及其制备方法和用途技术领域 0001 本发明属于药物合成领域，具体地说是一种喹唑啉衍生物的制备方法及其作为药物制剂用途。背景技术 0002 酪胺酸激酶抑制剂（Tyrosine Kinase Inhibitor），主要作用于上皮细胞生长因子受体（Epidermal Growth Factor Receptor， EGFR）。EGFR 对癌细胞的生长有重。

6、要的影响与控制相关性。如果癌细胞的受体过度表达或是过度活化，癌细胞将会大量生长，因而连带地增加治愈困难度以及再发的机率。EGFR 受体可分为四种人类上皮生长因子受体（Human Epidermal Receptor）。第一型通常称为 EGFR，而第二型则称为 HER2，其他另有第三与第四型。在这四型中，第二型受体的存在与否最为重要，因为第二型受体的过度表现与过度活化与乳腺癌患者的治愈机率成反比，即患者的癌细胞若带有第二型受体，那么其治愈率则越低，复发率越高，预计生存时间越短。人 ErbB 受体属于 I 型受体酪氨酸激酶 (TK) 家族。包括 ErbB1(。

7、EGFR)、 ErbB2(HER2)、 ErbB3(HER3) 和 ErbB4(HER4)。癌症患者 ErbB-1(EGFR) 和 ErbB-2(HER-2) 受体通常过度表达或发生其它改变。 0003 ErbB 家族 PTK 的生物学作用及其与各种疾病的关系在例如美国专利 5773476 ；国际专利申请 WO99/35146 ； M.C.Hung 等， Seminars in oncology,26:4,Suppl.12 ,1999,51-59;Ullri 等，Cell,61:203-212,20,1990;Modjtahedi 等，Intl.J.of Oncology,13:3。

8、35-342,1998; 以及 J.R.Wooburn,Pharmacol.Ther.,82:2-3,241-250,1999 中已有讨论。 0004 已知人类表皮生长因子受体 -2(ErbB-2、 HER-2) 是目前认识较为清楚的与乳腺癌关系密切的人类癌基因，它在乳腺癌中的高表达往往预示着易有淋巴结转移和肿瘤分化差。随着对 HER-2 研究的深入，它已经成为乳腺癌特异性治疗的靶分子之一。 0005 许多合成的化合物具有抑制表皮生长因子受体酪氨酸激酶 (EGFR-PTK) 的活性，尤其以喹唑啉类化合物研究的最深入，其中拉帕替尼于 2007 年被在美国获准上市治疗乳腺癌，并在。

9、12 月份获得欧洲药品管理机构有条件的批准。 0006 通过对拉帕替尼的临床前、以及临床的数据、专利情况等的分析和对比，确立以其为先导化合物，然后根据已报道化合物及生物活性测试数据，利用计算机辅助设计的手段，有目的的对拉帕替尼的结构进行设计、合成与筛选，以其找到结构新颖、高特异、活性更好的新型靶向抗肿瘤化合物。发明内容 0007 发明目的： 0008 本发明的目的是提供一种新颖化合物喹唑啉衍生物、及互变异构体和其盐类，尤其是其与无机的或有机的酸或碱的生理上可接受的盐类，并提供含有该药理学上有效化合物的药物制剂及其应用。说明书 CN 103554091。

10、 A 3 2/9 页 4 0009 技术方案： 0010 本发明是通过以下技术方案来实现的。 0011 优点及效果： 0012 本发明的喹唑啉衍生物还具有但不限于以下有益效果： 0013 （1）相对于拉帕替尼，本发明所提供的喹唑啉衍生物 -2 具有良好的药理活性和选择性。例如，喹唑啉衍生物 -2 对体外培养细胞生长的抑制活性 IC50(g/ml) 值分别如下：对A-549和MCF-7的抑制活性为0.18和0.27g/ml，对PC-3的抑制活性为10.2 ；而拉帕替尼对体外培养细胞生长的抑制活性 IC50(g/ml) 值分别如下：对 A-549 和 MCF-7 的抑。

11、制活性为 1.56 和 3.15g/ml，对 PC-3 的抑制活性为 7.28。由此可见，所设计的喹唑啉衍生物具有更好的抑制活性和选择性。 0014 （2）本发明的喹唑啉衍生物-2具有较好的水溶性，经试验证实，其在0.1NHCl盐酸中溶解度为 0.008mg/mL，水中的溶解度可达 0.05mg/ml H2O（温度 25），而拉帕替尼在 0.1N HCl 盐酸中溶解度为 0.001mg/mL，水中溶解度为 0.007mg/mL（温度 25），几乎高于一个数量级。因而本发明的喹唑啉衍生物 -2 具有较拉帕替尼更佳或至少相当的生物利用度。附图说明： 0015 图。

12、 1 是喹唑啉衍生物或其药学上可接受的盐的通式； 0016 图 2 是合成式通式（）所示的化合物衍生物的路线图。具体实施方式： 0017 本发明涉及通式（）的新颖化合物、及互变异构体和其盐类、及其制法，含有该药理学上有效化合物的药物制剂及其应用。 0018 通式（）所示的喹唑啉衍生物或其药学上可接受的盐： 0019 0020 其中， R1 表示：氢、 C1-4烷烃、 C1-4烷氧烃或卤素； R2 表示：氢、乙酰基、环丙甲酰基、环己基甲酰基、甲磺酰基、苯甲酰基、对甲苯甲酰基、苯磺酰基或对甲苯磺酰基。 0021 R1 优选自单取代的氢、甲基、。

13、甲氧基、氟、氯或溴。 0022 R1 优选自双取代的氢、甲基、甲氧基、氟、氯或溴。 0023 上述通式（I）所示的喹唑啉衍生物或其药学上可接受的盐，成盐适用的酸为：盐说明书 CN 103554091 A 4 3/9 页 5 酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、富马酸、丁二酸、乳酸、柠檬酸、酒石酸、水杨酸、甲磺酸、琥珀酸、马来酸或苹果酸。 0024 上述任一化合物作为制备治疗以异常 ErbB 家族 PTK 活性为特征的疾病的药物中的应用。 0025 所述 ErbB 家族 PTK 选自 EGFR、 ErbB1(EGFR) 和 ErbB2(HER2)。 0。

14、026 所述化合物具有有价值的药理性质，特别是对因酪氨酸激酶所引起的信号转导有抑制效果。 0027 上述通式（）所示的化合物或盐类及其非毒性药学上可接受的盐，以及包含通式（）所示的化合物或盐类及其非毒性药学上可接受的盐作为活性成分的药物组合物作为制备抗癌药物的用途。 0028 上述化合物或盐类用于制备皮下给药或口服的药物制剂。 0029 本发明所述的化合物或其可药用盐可以单独或以药物组合物的形式给药。本发明药物组合物可根据给药途径配成各种适宜剂型。使用一种或多种生理学上可接受的载体，包含赋形剂和助剂，它们有利于将活性化合物加工成可以在药学上使用的制剂。适当的制剂形式取。

15、决于所选择的给药途径，可以按照本领域熟知的常识进行制备。 0030 给药途径可以是口服、非肠道或局部给药，优选口服和注射形式给药。可以口服的药物制剂包括胶囊剂和片剂等。本发明化合物也可以配制用于肠胃外给药或者透皮给药或者经粘膜给药，或者采用栓剂或者埋植剂的方式给药。本领域技术人员可以理解，本发明化合物可以采用合适的药物释放系统（DDS）以得到更有利的效果。 0031 本发明通过体外四氮唑盐还原法（MTT 法）试验表明：具有通式（）结构的喹唑啉衍生物对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）、人肺腺癌细胞（A-549）、人髓状甲状腺细胞（TT）、人。

16、结直肠腺癌细胞（Colo205）、人前列腺癌细胞（PC-3）、人卵巢癌细胞（SKOV-3）、人乳腺癌细胞（MCF-7）、人白血病细胞（HL-60）等具有很强的细胞增殖抑制作用。 0032 下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明： 0033 首先参考文献（WO99/35146）方法合成式（）所示的化合物衍生物： 0034 0035 其中 R1和 R2如上所定义。说明书 CN 103554091 A 5 4/9 页 6 0036 将硝基苯氧基哌啶酮1用铁酸还原得到化合物2，化合物2再与取代的喹唑啉反应得到化合物 3，化合物 3 在钯碳的催化。

17、下与呋喃硼酸反应得到化合物 4，化合物 4 再与伯胺反应得到目标化合物。 0037 实施例 1 0038 1-(4-(4-(6-(5-(2-( 甲磺酰基 ) 乙基 ) 氨基 ) 甲基 ) 呋喃 -2- 基 ) 喹唑啉 -4- 基 ) 氨基 ) 苯氧基 ) 甲基 ) 哌啶 -1- 基 ) 乙酮（ -1）的合成 0039 0040 将500mL乙醇和5mL硫酸加入1000mL四口反应瓶中，再加入50g1-(4-(4-硝基苯氧基 ) 甲基 ) 哌啶 -1- 基 ) 乙酮 1，升温回流。少量多次加入 60g 还原铁粉，加完铁粉后于继续回流反应 3h。冷却至室温滴加氨水，调节 pH。

18、=9 左右，过滤，除去铁泥，水洗。滤液用盐酸调 pH=4，析出产品，过滤，滤饼烘干得 36.8g1-(4-(4- 氨基苯氧基 ) 甲基 ) 哌啶 -1- 基 ) 乙酮 2。1H NMR(400MHz,DMSO):1.34-1.59(m,4H,CH2),2.00(m,1H,CH),2.36(s,3H,CH3), 3.20-3.40(m,4H,CH2),3.90(d,2H,CH2),6.50-6.80(dd,4H,ArH);ESI-MS:m/z249M+H+。 0041 将 4- 氯 -6- 碘喹唑啉 (90.2g,0.31mol) 和 1-(4-(4- 氨基苯氧基 ) 甲基 ) 哌。

19、啶 -1- 基 ) 乙酮 2 （76.9g,0.31mol) 溶解在异丙醇 (500mL) 中，加热回流 2h。溶液冷却后，过滤，异丙醇和乙醚洗，干燥得 120.5g1-(4-(4-(6- 碘喹唑啉 -4- 基 ) 氨基 ) 苯氧基 ) 甲基 ) 哌啶 -1- 基 ) 乙酮 3。1H NMR(400MHz,DMSO):1.34-1.59(m,4H,CH2),2.00(m,1H,CH) ,2.36(s,3H,CH3),3.20-3.40(m,4H,CH2),3.90(d,2H,CH2),6.74(d,2H,ArH),7.60(d,2H,Ar H),7.93(d,1H,ArH),8.2。

20、0(m,2H,ArH),8.60(s,1H,ArH);ESI-MS:m/z503M+H+。 0042 将化合物 3(130.52g,0.26mol)、乙酸钯 (58.4g,0.26mol)、三苯基磷 (68.1g,0.26mol) 和三乙胺 20mL 溶解在 350mL 的 DMF 中，滴加 5- 甲酰基 -2- 呋喃硼酸 (36.4g,0.26mol)，加热回流7小时，得到粗品经柱层析得到90.3g5-(4-(4-(1-乙酰基哌啶 -4- 基 ) 甲氧基 ) 苯基 ) 氨基 ) 喹唑啉 -6- 基 ) 呋喃 -2- 甲醛 4。1H NMR(400MHz,DMSO ):。

21、1.34-1.59(m,4H,CH2),2.00(m,1H,CH),2.36(s,3H,CH3),3.20-3.40(m,4H,CH2),3.90( d,2H,CH2),6.39(d,1H,ArH),6.74(d,2H,ArH),7.35(d,1H,ArH),7.60(d,2H,ArH),7.93(d, 1H,ArH),8.20(m,2H,ArH),8.60(s,1H,ArH),9.70(s,1H,CHO);ESI-MS:m/z471M+H+。 0043 将化合物 4(84.6g,0.18mol) 和 2- 甲磺酰基乙胺 (22.4g,0.18mol) 加到 200mL 二氯甲烷中，室温搅。

22、拌 2 小时。然后加入三乙酰基硼氢化钠 (110.2g,0.52mol) 的 50mL 乙酸溶液，继续反应 6 小时。倒入水中，二氯甲烷提取，蒸干溶剂，粗品柱层析得到目标化合物 1-(4-(4-(6-(5-(2-( 甲磺酰基 ) 乙基 ) 氨基 ) 甲基 ) 呋喃 -2-yl) 喹唑啉 -4-yl) 氨基 ) 苯氧基 ) 甲基 ) 哌啶 -1- 基 ) 乙酮（ -1） 80.2g。1H NMR(400MHz,DMSO):1.34-1.5 说明书 CN 103554091 A 6 5/9 页 7 9(m,4H,CH2),2.00(m,1H,CH),2.36(s,3H,CH3),。

23、2.83(s,3H,CH3),3.11(m,2H,CH2),3.20-3.4 0(m,4H,CH2),3.53(m,2H,CH2),3.67(s,2H,CH2),3.90(d,2H,CH2),6.39(d,1H,ArH),6.74(d, 2H,ArH),7.35(d,1H,ArH),7.60(d,2H,ArH),7.93(d,1H,ArH),8.20(m,2H,ArH),8.60(s,1H ,ArH);ESI-MS:m/z578M+H+。 0044 实施例 2 0045 环丙基 1-(4-(4-(6-(5-(2-( 甲磺酰基 ) 乙基 ) 氨基 ) 甲基 ) 呋喃 -2- 基 ) 喹唑啉 -4。

24、- 基 ) 氨基 ) 苯氧基 ) 甲基 ) 哌啶 -1- 基 ) 甲酮（ -2）的合成 0046 0047 按照实施例 1 相同的方法制备，将环丙基 (4-(4- 硝基苯氧基 ) 甲基 ) 哌啶 -1- 基 ) 甲酮在铁粉还原下得到化合物 (4-(4- 氨基苯氧基 ) 甲基 ) 哌啶 -1- 基 ) 环丙基甲酮，再与 4- 氯 -6- 碘喹唑啉反应，然后与 5- 甲酰基 -2- 呋喃硼酸反应，最后与 2- 甲磺酰基乙胺反应得到目标化合物-2， 1H NMR(400MHz,DMSO):0.72-0.93(m,4H,CH 2),1.15- 1.17(m,1H,CH),1.34-1。

25、.59(m,4H,CH2),2.00(m,1H,CH),2.83(s,3H,CH3),3.11(m,2H,CH2), 3.20-3.40(m,4H,CH2),3.53(m,2H,CH2),3.67(s,2H,CH2),3.90(d,2H,CH2),6.39(d,1H,ArH) ,6.74(d,2H,ArH),7.35(d,1H,ArH),7.60(d,2H,ArH),7.93(d,1H,ArH),8.20(m,2H,ArH),8 .60(s,1H,ArH);ESI-MS:m/z604M+H+。 0048 实施例 3 0049 6-(5-(2-( 甲磺酰基 ) 乙基 ) 氨基 ) 甲基 ) 呋喃。

26、 -2- 基 )-N-(4-(1-( 甲磺酰基 ) 哌啶 -4- 基 ) 甲氧基 ) 苯基 ) 喹唑啉 -4- 胺（ -3）的合成 0050 0051 按照实施例1相同的方法制备，将1-甲磺酰基-(4-(4-硝基苯氧基)甲基)哌啶说明书 CN 103554091 A 7 6/9 页 8 在铁粉还原下得到化合物 (4-(1- 甲磺酰基 ) 哌啶 -4- 基 ) 甲氧基苯胺，再与 4- 氯 -6- 碘喹唑啉反应，然后与 5- 甲酰基 -2- 呋喃硼酸反应，最后与 2- 甲磺酰基乙胺反应得到目标化合物 -3， 1H NMR(400MHz,DMSO):1.34-1.59(m,4。

27、H,CH 2),2.00(m,1H,CH),2.83(s,3H,CH3 ),2.96(s,3H,CH3),3.11(m,2H,CH2),3.20-3.40(m,4H,CH2),3.53(m,2H,CH2),3.67(s,2H,CH 2),3.90(d,2H,CH2),6.39(d,1H,ArH),6.74(d,2H,ArH),7.35(d,1H,ArH),7.60(d,2H,ArH), 7.93(d,1H,ArH),8.20(m,2H,ArH),8.60(s,1H,ArH);ESI-MS:m/z614M+H+。 0052 实施例 4 0053 6-(5-(2-( 甲磺酰基 ) 乙基 ) 氨基。

28、) 甲基 ) 呋喃 -2- 基 )-N-(4-(1-( 苯磺酰基 ) 哌啶 -4- 基 ) 甲氧基 ) 苯基 ) 喹唑啉 -4- 胺（ -4）的合成 0054 0055 按照实施例 1 相同的方法制备，将 4-(4- 硝基苯氧基 ) 甲基 )-1- （苯磺酰基）哌啶在铁粉还原下得到化合物4-(1-(苯磺酰基)哌啶-4-基)甲氧基)苯胺，再与4-氯-6-碘喹唑啉反应，然后与 5- 甲酰基 -2- 呋喃硼酸反应，最后与 2- 甲磺酰基乙胺反应得到目标化合物 -4， 1H NMR(400MHz,DMSO):1.34-1.59(m,4H,CH 2),2.00(m,1H,CH),2。

29、.83(s,3H,CH3 ),3.11(m,2H,CH2),3.20-3.40(m,4H,CH2),3.53(m,2H,CH2),3.67(s,2H,CH2),3.90(d,2H,CH 2),6.39(d,1H,ArH),6.74(d,2H,ArH),7.35(d,1H,ArH),7.60(d,2H,ArH),7.93(d,1H,ArH) ,8.20-8.45(m,7H,ArH),8.60(s,1H,ArH);ESI-MS:m/z676M+H+。 0056 实施例 5 0057 1-(4-(2- 甲基 -4-(6-(5-(2-( 甲磺酰基 ) 乙基 ) 氨基 ) 甲基 ) 呋喃 -2- 基 )。

30、喹唑啉 -4- 基 ) 氨基 ) 苯氧基 ) 甲基 ) 哌啶 -1- 基 ) 乙酮（ -5）的合成 0058 说明书 CN 103554091 A 8 7/9 页 9 0059 按照实施例 1 相同的方法制备，将 1-(4-(2- 甲基 -4- 硝基苯氧基 ) 甲基 ) 哌啶 -1- 基 ) 乙酮在铁粉还原下得到化合物 1-(4-(4- 氨基 -2- 甲基苯氧基 ) 甲基 ) 哌啶 -1- 基 ) 乙酮，再与 4- 氯 -6- 碘喹唑啉反应，然后与 5- 甲酰基 -2- 呋喃硼酸反应，最后与 2- 甲磺酰基乙胺反应得到目标化合物 -5， 1H NMR(400MHz,DM。

31、SO):1.34-1.59(m,4H, CH2),2.00(m,1H,CH),2.18(s,3H,CH3),2.36(s,3H,CH3),2.83(s,3H,CH3),3.11(m,2H,CH2), 3.20-3.40(m,4H,CH2),3.53(m,2H,CH2),3.67(s,2H,CH2),3.90(d,2H,CH2),6.39(d,1H,ArH) ,6.74(d,1H,ArH),7.35(d,1H,ArH),7.60(d,2H,ArH),7.93(d,1H,ArH),8.20(m,2H,ArH),8 .60(s,1H,ArH);ESI-MS:m/z592M+H+。 0060 实施例。

32、6 0061 1-(4-(2- 氟 -4-(6-(5-(2-( 甲磺酰基 ) 乙基 ) 氨基 ) 甲基 ) 呋喃 -2- 基 ) 喹唑啉 -4- 基 ) 氨基 ) 苯氧基 ) 甲基 ) 哌啶 -1- 基 ) 乙酮（ -6）的合成 0062 0063 按照实施例 1 相同的方法制备，将 1-(4-(2- 氟 -4- 硝基甲氧基 ) 甲基 ) 哌啶-1-基)乙酮在铁粉还原下得到化合物1-(4-(4-氨基-2-氟苯氧基)甲基）哌啶-1-基) 乙酮，再与 4- 氯 -6- 碘喹唑啉反应，然后与 5- 甲酰基 -2- 呋喃硼酸反应，最后与 2- 甲磺酰基乙胺反应得到目标化合物 -6，。

33、 1H NMR(400MHz,DMSO):1.34-1.59(m,4H,CH 2),2.00 (m,1H,CH),2.36(s,3H,CH3),2.83(s,3H,CH3),3.11(m,2H,CH2),3.20-3.40(m,4H,CH2),3.53 (m,2H,CH2),3.67(s,2H,CH2),3.90(d,2H,CH2),6.39(d,1H,ArH),6.74(d,1H,ArH),7.35(d, 1H,ArH),7.60(d,2H,ArH),7.93(d,1H,ArH),8.20(m,2H,ArH),8.60(s,1H,ArH);ESI-MS:m/ z596M+H+。 0064 实。

34、施例 7 0065 片剂制备方法如下： 0066 说明书 CN 103554091 A 9 8/9 页 10 0067 工艺：将活性成分辅料分别过 100 目筛，称取处方量的主药和辅料（一半羧甲基淀粉钠）充分混合，加入聚乙烯吡咯烷酮水溶液适量制软材，过 24 目筛，制得湿颗粒于 50-60烘箱中干燥约 2-3 小时，将剩余羧甲基淀粉钠和硬脂酸镁与颗粒混合均匀，整粒，测定中间体含量，用 8mm 浅冲压片。 0068 实施例 8 0069 注射液的制备 0070 0071 工艺：取注射用水 50ml，称取处方量的柠檬酸、磷酸二氢钠搅拌使溶解，加入样品搅拌溶。

35、解，用 0.1mol/L 的盐酸或氢氧化钠调 pH 值为 4.0-5.0，加入 0.1% 的活性炭吸附 20 分钟。先用 0.45m 滤膜滤过，再用 0.22m 精滤。按每安瓿 5 毫升灌装， 105高温灭菌 30 分钟即得注射液。 0072 实施例 9 0073 化合物的体外抗肿瘤活性试验 0074 （1）材料 0075 细胞株：人脐静脉内皮细胞（HUVEC）、人肺腺癌细胞（A-549）、人髓状甲状腺细胞（TT）、人结直肠腺癌细胞（Colo205）、人前列腺癌细胞（PC-3）、人卵巢癌细胞（SKOV-3）、人乳腺癌细胞（MCF-7）、人。

36、白血病细胞（HL-60）。 0076 试剂： MTT， Amresco 公司； DMEM、 DMEM/F12 培养基， Gibco 公司；小牛血清，兰州民海生物；胰蛋白酶， Amresco 公司。 0077 仪器：超净工作台，苏州净化设备厂； CO2 培养箱， Thermo 公司，型号： HERA Cell150 ；倒置显微镜， Carl Zeiss公司，型号： Axiovert200 ；酶联免疫检测仪， TECAN公司，说明书 CN 103554091 A 10 9/9 页 11 型号： Sunrise ；离心机， Kerdro 公司，型号。

37、： Heraeus。 0078 （2）方法 0079 细胞培养：细胞接种在含 10% 小牛血清， 100IU/ml 青霉素 G 钠盐及 100ug/ml 硫酸链霉素的 DMEM 或 DMEM/F12 完全培养液中，置 37、 100% 相对湿度、含 5%CO2 的培养箱中，传代 3 次后备用。 0080 MTT 比色法检测：取对数生长期的细胞，经 0.25% 胰蛋白酶消化后（悬浮细胞无须消化），悬浮于含10%小牛血清的培养液中，用玻璃滴管轻轻吹打成单细胞悬液，显微镜下用血细胞记数板记数活细胞。96 孔培养板每孔接种细胞悬液 90l（细胞浓度为 3 6104 。

38、个 /mL），置培养箱 24h 后，每孔加 10l 药液。另外，每个浓度设阴性对照（等浓度 DMSO）及空白本底（不加细胞），各组均设 6 个复孔。再连续培养 48h，然后每孔加入 10l5mg/mL 的 MTT 溶液，继续培养 4h 后，仔细吸去上清液。每孔加入 100l DMSO，置微量振荡器震荡 5min 以使结晶完全溶解，于酶标仪 492nm 单波长比色，测定 OD 值，试验结果见表 1。 0081 抑制率（%） =1-( 实验组 OD 均值 - 空白组 OD 均值 )/( 对照组 OD 均值 - 空白组 OD 均值 )100。Bliss 法计算受试化合物 IC50值。 0082 （3）结果 0083 表 1. 对体外培养细胞生长的 IC50(g/ml) 0084 。说明书 CN 103554091 A 11 1/1 页 12 图 1 图 2 说明书附图 CN 103554091 A 12 。

摘要
申请专利号：	CN201310542061.6	申请日：	2013.11.05
公开号：	CN103554091A	公开日：	2014.02.05
当前法律状态：	终止	有效性：	无权
法律详情：	未缴年费专利权终止IPC(主分类):C07D 405/14申请日:20131105授权公告日:20160518终止日期:20171105\|\|\|授权\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):C07D 405/14申请日:20131105\|\|\|公开
IPC分类号：	C07D405/14; A61K31/517; A61P35/00	主分类号：	C07D405/14
申请人：	沈阳工业大学
发明人：	蔡志强; 李素君; 侯玲; 胡志泉; 孙洪涛; 李志利; 郭洪彬; 蔡奥飞
地址：	110870 辽宁省沈阳市经济技术开发区沈辽西路111号
优先权：
专利代理机构：	沈阳智龙专利事务所(普通合伙) 21115	代理人：	宋铁军;周楠
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内容摘要

本发明属药物化学技术领域，涉及通式（Ⅰ）喹唑啉衍生物及其制备方法，及其与无机或有机的酸或碱所形成的生理上可接受的盐，含有它们的药物组合物，及其在制备治疗疾病的药物，特别是特征为异常erbB家族PTK活性的疾病药物上的应用。所述化合物具有有价值的药理性质，特别是对因酪氨酸激酶所引起的信号转导有抑制效果。

权利要求书

权利要求书
1.  通式（Ⅰ）所示的喹唑啉衍生物或其药学上可接受的盐：

其中，R1表示：氢、C1-4烷烃、C1-4烷氧烃或卤素；R2表示：氢、乙酰基、环丙甲酰基、环己基甲酰基、甲磺酰基、苯甲酰基、对甲苯甲酰基、苯磺酰基或对甲苯磺酰基。

2.  根据权利要求1所述的喹唑啉衍生物或其可药用盐，其特征在于：R1优选自单取代的氢、甲基、甲氧基、氟、氯或溴。

3.  根据权利要求1所述的喹唑啉衍生物或其可药用盐，其特征在于：R1优选自双取代的氢、甲基、甲氧基、氟、氯或溴。

4.  根据权利要求1、2或3所述的喹唑啉衍生物或其药学上可接受的盐，其特征在于：适用的酸为：盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、富马酸、丁二酸、乳酸、柠檬酸、酒石酸、水杨酸、甲磺酸、琥珀酸、马来酸或苹果酸。

5.  权利要求1、2或3中所述任一化合物作为制备治疗以异常ErbB家族PTK活性为特征的疾病的药物中的应用。

6.  权利要求5所述的用途，其特征在于：所述ErbB家族PTK选自EGFR、ErbB1(EGFR)和ErbB2(HER2)。

7.  权利要求1、2或3中所述任一化合物或盐类，以及含有该任一化合物或盐类作为活性成分的药物组合物作为制备抗癌药物的应用。

8.  根据权利要求7所述的应用，其用于制备皮下给药或口服的药物制剂。

说明书

说明书喹唑啉衍生物及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于药物合成领域，具体地说是一种喹唑啉衍生物的制备方法及其作为药物制剂用途。
背景技术
酪胺酸激酶抑制剂（Tyrosine Kinase Inhibitor），主要作用于上皮细胞生长因子受体（Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR）。EGFR对癌细胞的生长有重要的影响与控制相关性。如果癌细胞的受体过度表达或是过度活化，癌细胞将会大量生长，因而连带地增加治愈困难度以及再发的机率。EGFR受体可分为四种人类上皮生长因子受体（Human Epidermal Receptor）。第一型通常称为EGFR，而第二型则称为HER2，其他另有第三与第四型。在这四型中，第二型受体的存在与否最为重要，因为第二型受体的过度表现与过度活化与乳腺癌患者的治愈机率成反比，即患者的癌细胞若带有第二型受体，那么其治愈率则越低，复发率越高，预计生存时间越短。人ErbB受体属于I型受体酪氨酸激酶(TK)家族。包括ErbB1(EGFR)、ErbB2(HER2)、ErbB3(HER3)和ErbB4(HER4)。癌症患者ErbB-1(EGFR)和ErbB-2(HER-2)受体通常过度表达或发生其它改变。
ErbB家族PTK的生物学作用及其与各种疾病的关系在例如美国专利5773476；国际专利申请WO99/35146；M.C.Hung等，Seminars in oncology,26:4,Suppl.12,1999,51-59;Ullri等，Cell,61:203-212,20,1990;Modjtahedi等，Int’l.J.of Oncology,13:335-342,1998;以及J.R.Wooburn,Pharmacol.Ther.,82:2-3,241-250,1999中已有讨论。
已知人类表皮生长因子受体-2(ErbB-2、HER-2)是目前认识较为清楚的与乳腺癌关系密切的人类癌基因，它在乳腺癌中的高表达往往预示着易有淋巴结转移和肿瘤分化差。随着对HER-2研究的深入，它已经成为乳腺癌特异性治疗的靶分子之一。
许多合成的化合物具有抑制表皮生长因子受体酪氨酸激酶(EGFR-PTK)的活性，尤其以喹唑啉类化合物研究的最深入，其中拉帕替尼于2007年被在美国获准上市治疗乳腺癌，并在12月份获得欧洲药品管理机构有条件的批准。
通过对拉帕替尼的临床前、以及临床的数据、专利情况等的分析和对比，确立以其为先导化合物，然后根据已报道化合物及生物活性测试数据，利用计算机辅助设计的手段，有目的的对拉帕替尼的结构进行设计、合成与筛选，以其找到结构新颖、高特异、活性更好的新型靶向抗肿瘤化合物。
发明内容
发明目的：
本发明的目的是提供一种新颖化合物喹唑啉衍生物、及互变异构体和其盐类，尤其是其与无机的或有机的酸或碱的生理上可接受的盐类，并提供含有该药理学上有效化合物的药物制剂及其应用。
技术方案：
本发明是通过以下技术方案来实现的。
优点及效果：
本发明的喹唑啉衍生物还具有但不限于以下有益效果：
（1）相对于拉帕替尼，本发明所提供的喹唑啉衍生物Ⅰ-2具有良好的药理活性和选择性。例如，喹唑啉衍生物Ⅰ-2对体外培养细胞生长的抑制活性IC50(μg/ml)值分别如下：对A-549和MCF-7的抑制活性为0.18和0.27μg/ml，对PC-3的抑制活性为10.2；而拉帕替尼对体外培养细胞生长的抑制活性IC50(μg/ml)值分别如下：对A-549和MCF-7的抑制活性为1.56和3.15μg/ml，对PC-3的抑制活性为7.28。由此可见，所设计的喹唑啉衍生物具有更好的抑制活性和选择性。
（2）本发明的喹唑啉衍生物Ⅰ-2具有较好的水溶性，经试验证实，其在0.1NHCl盐酸中溶解度为0.008mg/mL，水中的溶解度可达0.05mg/ml H2O（温度25℃），而拉帕替尼在0.1N HCl盐酸中溶解度为0.001mg/mL，水中溶解度为0.007mg/mL（温度25℃），几乎高于一个数量级。因而本发明的喹唑啉衍生物Ⅰ-2具有较拉帕替尼更佳或至少相当的生物利用度。
附图说明：
图1是喹唑啉衍生物或其药学上可接受的盐的通式；
图2是合成式通式（Ⅰ）所示的化合物衍生物的路线图。
具体实施方式：
本发明涉及通式（Ⅰ）的新颖化合物、及互变异构体和其盐类、及其制法，含有该药理学上有效化合物的药物制剂及其应用。
通式（Ⅰ）所示的喹唑啉衍生物或其药学上可接受的盐：

其中，R1表示：氢、C1-4烷烃、C1-4烷氧烃或卤素；R2表示：氢、乙酰基、环丙甲酰基、环己基甲酰基、甲磺酰基、苯甲酰基、对甲苯甲酰基、苯磺酰基或对甲苯磺酰基。
R1优选自单取代的氢、甲基、甲氧基、氟、氯或溴。
R1优选自双取代的氢、甲基、甲氧基、氟、氯或溴。
上述通式（I）所示的喹唑啉衍生物或其药学上可接受的盐，成盐适用的酸为：盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、富马酸、丁二酸、乳酸、柠檬酸、酒石酸、水杨酸、甲磺酸、琥珀酸、马来酸或苹果酸。
上述任一化合物作为制备治疗以异常ErbB家族PTK活性为特征的疾病的药物中的应用。
所述ErbB家族PTK选自EGFR、ErbB1(EGFR)和ErbB2(HER2)。
所述化合物具有有价值的药理性质，特别是对因酪氨酸激酶所引起的信号转导有抑制效果。
上述通式（Ⅰ）所示的化合物或盐类及其非毒性药学上可接受的盐，以及包含通式（Ⅰ）所示的化合物或盐类及其非毒性药学上可接受的盐作为活性成分的药物组合物作为制备抗癌药物的用途。
上述化合物或盐类用于制备皮下给药或口服的药物制剂。
本发明所述的化合物或其可药用盐可以单独或以药物组合物的形式给药。本发明药物组合物可根据给药途径配成各种适宜剂型。使用一种或多种生理学上可接受的载体，包含赋形剂和助剂，它们有利于将活性化合物加工成可以在药学上使用的制剂。适当的制剂形式取决于所选择的给药途径，可以按照本领域熟知的常识进行制备。
给药途径可以是口服、非肠道或局部给药，优选口服和注射形式给药。可以口服的药物制剂包括胶囊剂和片剂等。本发明化合物也可以配制用于肠胃外给药或者透皮给药或者经粘膜给药，或者采用栓剂或者埋植剂的方式给药。本领域技术人员可以理解，本发明化合物可以采用合适的药物释放系统（DDS）以得到更有利的效果。
本发明通过体外四氮唑盐还原法（MTT法）试验表明：具有通式（Ⅰ）结构的喹唑啉衍生物对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）、人肺腺癌细胞（A-549）、人髓状甲状腺细胞（TT）、人结直肠腺癌细胞（Colo205）、人前列腺癌细胞（PC-3）、人卵巢癌细胞（SKOV-3）、人乳腺癌细胞（MCF-7）、人白血病细胞（HL-60）等具有很强的细胞增殖抑制作用。
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明：
首先参考文献（WO99/35146）方法合成式（Ⅰ）所示的化合物衍生物：

其中R1和R2如上所定义。
将硝基苯氧基哌啶酮1用铁酸还原得到化合物2，化合物2再与取代的喹唑啉反应得到化合物3，化合物3在钯碳的催化下与呋喃硼酸反应得到化合物4，化合物4再与伯胺反应得到目标化合物Ⅰ。
实施例1
1-(4-((4-((6-(5-(((2-(甲磺酰基)乙基)氨基)甲基)呋喃-2-基)喹唑啉-4-基)氨基)苯氧基)甲基)哌啶-1-基)乙酮（Ⅰ-1）的合成

将500mL乙醇和5mL硫酸加入1000mL四口反应瓶中，再加入50g1-(4-((4-硝基苯氧基)甲基)哌啶-1-基)乙酮1，升温回流。少量多次加入60g还原铁粉，加完铁粉后于继续回流反应3h。冷却至室温滴加氨水，调节pH=9左右，过滤，除去铁泥，水洗。滤液用盐酸调pH=4，析出产品，过滤，滤饼烘干得36.8g1-(4-((4-氨基苯氧基)甲基)哌啶-1-基)乙酮2。1H NMR(400MHz,DMSO):δ1.34-1.59(m,4H,CH2),2.00(m,1H,CH),2.36(s,3H,CH3),3.20-3.40(m,4H,CH2),3.90(d,2H,CH2),6.50-6.80(dd,4H,ArH);ESI-MS:m/z249[M+H]+。
将4-氯-6-碘喹唑啉(90.2g,0.31mol)和1-(4-((4-氨基苯氧基)甲基)哌啶-1-基)乙酮2（76.9g,0.31mol)溶解在异丙醇(500mL)中，加热回流2h。溶液冷却后，过滤，异丙醇和乙醚洗，干燥得120.5g1-(4-((4-((6-碘喹唑啉-4-基)氨基)苯氧基)甲基)哌啶-1-基)乙酮3。1H NMR(400MHz,DMSO):δ1.34-1.59(m,4H,CH2),2.00(m,1H,CH),2.36(s,3H,CH3),3.20-3.40(m,4H,CH2),3.90(d,2H,CH2),6.74(d,2H,ArH),7.60(d,2H,ArH),7.93(d,1H,ArH),8.20(m,2H,ArH),8.60(s,1H,ArH);ESI-MS:m/z503[M+H]+。
将化合物3(130.52g,0.26mol)、乙酸钯(58.4g,0.26mol)、三苯基磷(68.1g,0.26mol)和三乙胺20mL溶解在350mL的DMF中，滴加5-甲酰基-2-呋喃硼酸(36.4g,0.26mol)，加热回流7小时，得到粗品经柱层析得到90.3g5-(4-((4-((1-乙酰基哌啶-4-基)甲氧基)苯基)氨基)喹唑啉-6-基)呋喃-2-甲醛4。1H NMR(400 MHz,DMSO):δ1.34-1.59(m,4H,CH2),2.00(m,1H,CH),2.36(s,3H,CH3),3.20-3.40(m,4H,CH2),3.90(d,2H,CH2),6.39(d,1H,ArH),6.74(d,2H,ArH),7.35(d,1H,ArH),7.60(d,2H,ArH),7.93(d,1H,ArH),8.20(m,2H,ArH),8.60(s,1H,ArH),9.70(s,1H,CHO);ESI-MS:m/z471[M+H]+。
将化合物4(84.6g,0.18mol)和2-甲磺酰基乙胺(22.4g,0.18mol)加到200mL二氯甲烷中，室温搅拌2小时。然后加入三乙酰基硼氢化钠(110.2g,0.52mol)的50mL乙酸溶液，继续反应6小时。倒入水中，二氯甲烷提取，蒸干溶剂，粗品柱层析得到目标化合物1-(4-((4-((6-(5-(((2-(甲磺酰基)乙基)氨基)甲基)呋喃-2-yl)喹唑啉-4-yl)氨基)苯氧基)甲基)哌啶-1-基)乙酮（Ⅰ-1）80.2g。1H NMR(400MHz,DMSO):δ1.34-1.59(m,4H,CH2),2.00(m,1H,CH),2.36(s,3H,CH3),2.83(s,3H,CH3),3.11(m,2H,CH2),3.20-3.40(m,4H,CH2),3.53(m,2H,CH2),3.67(s,2H,CH2),3.90(d,2H,CH2),6.39(d,1H,ArH),6.74(d,2H,ArH),7.35(d,1H,ArH),7.60(d,2H,ArH),7.93(d,1H,ArH),8.20(m,2H,ArH),8.60(s,1H,ArH);ESI-MS:m/z578[M+H]+。
实施例2
环丙基1-(4-((4-((6-(5-(((2-(甲磺酰基)乙基)氨基)甲基)呋喃-2-基)喹唑啉-4-基)氨基)苯氧基)甲基)哌啶-1-基)甲酮（Ⅰ-2）的合成

按照实施例1相同的方法制备，将环丙基(4-((4-硝基苯氧基)甲基)哌啶-1-基) 甲酮在铁粉还原下得到化合物(4-((4-氨基苯氧基)甲基)哌啶-1-基)环丙基甲酮，再与4-氯-6-碘喹唑啉反应，然后与5-甲酰基-2-呋喃硼酸反应，最后与2-甲磺酰基乙胺反应得到目标化合物Ⅰ-2，1H NMR(400MHz,DMSO):δ0.72-0.93(m,4H,CH2),1.15-1.17(m,1H,CH),1.34-1.59(m,4H,CH2),2.00(m,1H,CH),2.83(s,3H,CH3),3.11(m,2H,CH2),3.20-3.40(m,4H,CH2),3.53(m,2H,CH2),3.67(s,2H,CH2),3.90(d,2H,CH2),6.39(d,1H,ArH),6.74(d,2H,ArH),7.35(d,1H,ArH),7.60(d,2H,ArH),7.93(d,1H,ArH),8.20(m,2H,ArH),8.60(s,1H,ArH);ESI-MS:m/z604[M+H]+。
实施例3
6-(5-(((2-(甲磺酰基)乙基)氨基)甲基)呋喃-2-基)-N-(4-((1-(甲磺酰基)哌啶-4-基)甲氧基)苯基)喹唑啉-4-胺（Ⅰ-3）的合成

按照实施例1相同的方法制备，将1-甲磺酰基-(4-((4-硝基苯氧基)甲基)哌啶在铁粉还原下得到化合物(4-((1-甲磺酰基)哌啶-4-基)甲氧基苯胺，再与4-氯-6-碘喹唑啉反应，然后与5-甲酰基-2-呋喃硼酸反应，最后与2-甲磺酰基乙胺反应得到目标化合物Ⅰ-3，1H NMR(400MHz,DMSO):δ1.34-1.59(m,4H,CH2),2.00(m,1H,CH),2.83(s,3H,CH3),2.96(s,3H,CH3),3.11(m,2H,CH2),3.20-3.40(m,4H,CH2),3.53(m,2H,CH2),3.67(s,2H,CH2),3.90(d,2H,CH2),6.39(d,1H,ArH), 6.74(d,2H,ArH),7.35(d,1H,ArH),7.60(d,2H,ArH),7.93(d,1H,ArH),8.20(m,2H,ArH),8.60(s,1H,ArH);ESI-MS:m/z614[M+H]+。
实施例4
6-(5-(((2-(甲磺酰基)乙基)氨基)甲基)呋喃-2-基)-N-(4-((1-(苯磺酰基)哌啶-4-基)甲氧基)苯基)喹唑啉-4-胺（Ⅰ-4）的合成

按照实施例1相同的方法制备，将4-((4-硝基苯氧基)甲基)-1-（苯磺酰基）哌啶在铁粉还原下得到化合物4-((1-(苯磺酰基)哌啶-4-基)甲氧基)苯胺，再与4-氯-6-碘喹唑啉反应，然后与5-甲酰基-2-呋喃硼酸反应，最后与2-甲磺酰基乙胺反应得到目标化合物Ⅰ-4，1H NMR(400MHz,DMSO):δ1.34-1.59(m,4H,CH2),2.00(m,1H,CH),2.83(s,3H,CH3),3.11(m,2H,CH2),3.20-3.40(m,4H,CH2),3.53(m,2H,CH2),3.67(s,2H,CH2),3.90(d,2H,CH2),6.39(d,1H,ArH),6.74(d,2H,ArH),7.35(d,1H,ArH),7.60(d,2H,ArH),7.93(d,1H,ArH),8.20-8.45(m,7H,ArH),8.60(s,1H,ArH);ESI-MS:m/z676[M+H]+。
实施例5
1-(4-((2-甲基-4-((6-(5-(((2-(甲磺酰基)乙基)氨基)甲基)呋喃-2-基)喹唑啉-4-基)氨基)苯氧基)甲基)哌啶-1-基)乙酮（Ⅰ-5）的合成

按照实施例1相同的方法制备，将1-(4-((2-甲基-4-硝基苯氧基)甲基)哌啶-1-基)乙酮在铁粉还原下得到化合物1-(4-((4-氨基-2-甲基苯氧基)甲基)哌啶-1-基)乙酮，再与4-氯-6-碘喹唑啉反应，然后与5-甲酰基-2-呋喃硼酸反应，最后与2-甲磺酰基乙胺反应得到目标化合物Ⅰ-5，1H NMR(400MHz,DMSO):δ1.34-1.59(m,4H,CH2),2.00(m,1H,CH),2.18(s,3H,CH3),2.36(s,3H,CH3),2.83(s,3H,CH3),3.11(m,2H,CH2),3.20-3.40(m,4H,CH2),3.53(m,2H,CH2),3.67(s,2H,CH2),3.90(d,2H,CH2),6.39(d,1H,ArH),6.74(d,1H,ArH),7.35(d,1H,ArH),7.60(d,2H,ArH),7.93(d,1H,ArH),8.20(m,2H,ArH),8.60(s,1H,ArH);ESI-MS:m/z592[M+H]+。
实施例6
1-(4-((2-氟-4-((6-(5-(((2-(甲磺酰基)乙基)氨基)甲基)呋喃-2-基)喹唑啉-4-基)氨基)苯氧基)甲基)哌啶-1-基)乙酮（Ⅰ-6）的合成

按照实施例1相同的方法制备，将1-(4-((2-氟-4-硝基甲氧基)甲基)哌啶-1-基)乙酮在铁粉还原下得到化合物1-(4-((4-氨基-2-氟苯氧基)甲基）哌啶-1-基)乙酮，再与4-氯-6-碘喹唑啉反应，然后与5-甲酰基-2-呋喃硼酸反应，最后与2-甲磺酰基乙胺反应得到目标化合物Ⅰ-6，1H NMR(400MHz,DMSO):δ1.34-1.59(m,4H,CH2),2.00(m,1H,CH),2.36(s,3H,CH3),2.83(s,3H,CH3),3.11(m,2H,CH2),3.20-3.40(m,4H,CH2),3.53(m,2H,CH2),3.67(s,2H,CH2),3.90(d,2H,CH2),6.39(d,1H,ArH),6.74(d,1H,ArH),7.35(d,1H,ArH),7.60(d,2H,ArH),7.93(d,1H,ArH),8.20(m,2H,ArH),8.60(s,1H,ArH);ESI-MS:m/z596[M+H]+。
实施例7
片剂制备方法如下：

工艺：将活性成分辅料分别过100目筛，称取处方量的主药和辅料（一半羧甲基淀粉钠）充分混合，加入聚乙烯吡咯烷酮水溶液适量制软材，过24目筛，制得湿颗粒于50-60℃烘箱中干燥约2-3小时，将剩余羧甲基淀粉钠和硬脂酸镁与颗粒混合均匀，整粒，测定中间体含量，用Φ8mm浅冲压片。
实施例8
注射液的制备

工艺：取注射用水50ml，称取处方量的柠檬酸、磷酸二氢钠搅拌使溶解，加入样品搅拌溶解，用0.1mol/L的盐酸或氢氧化钠调pH值为4.0-5.0，加入0.1%的活性炭吸附20分钟。先用0.45μm滤膜滤过，再用0.22μm精滤。按每安瓿5毫升灌装，105℃高温灭菌30分钟即得注射液。
实施例9
化合物Ⅰ的体外抗肿瘤活性试验
（1）材料
细胞株：人脐静脉内皮细胞（HUVEC）、人肺腺癌细胞（A-549）、人髓状甲状腺细胞（TT）、人结直肠腺癌细胞（Colo205）、人前列腺癌细胞（PC-3）、人卵巢癌细胞（SKOV-3）、人乳腺癌细胞（MCF-7）、人白血病细胞（HL-60）。
试剂：MTT，Amresco公司；DMEM、DMEM/F12培养基，Gibco公司；小牛血清，兰州民海生物；胰蛋白酶，Amresco公司。
仪器：超净工作台，苏州净化设备厂；CO2培养箱，Thermo公司，型号：HERA Cell150；倒置显微镜，Carl Zeiss公司，型号：Axiovert200；酶联免疫检测仪，TECAN公司，型号：Sunrise；离心机，Kerdro公司，型号：Heraeus。
（2）方法
细胞培养：细胞接种在含10%小牛血清，100IU/ml青霉素G钠盐及100ug/ml硫酸链霉素的DMEM或DMEM/F12完全培养液中，置37℃、100%相对湿度、含5%CO2的培养箱中，传代3次后备用。
MTT比色法检测：取对数生长期的细胞，经0.25%胰蛋白酶消化后（悬浮细胞无须消化），悬浮于含10%小牛血清的培养液中，用玻璃滴管轻轻吹打成单细胞悬液，显微镜下用血细胞记数板记数活细胞。96孔培养板每孔接种细胞悬液90μl（细胞浓度为3～6×104个/mL），置培养箱24h后，每孔加10μl药液。另外，每个浓度设阴性对照（等浓度DMSO）及空白本底（不加细胞），各组均设6个复孔。再连续培养48h，然后每孔加入10μl5mg/mL的MTT溶液，继续培养4h后，仔细吸去上清液。每孔加入100μl DMSO，置微量振荡器震荡5min以使结晶完全溶解，于酶标仪492nm单波长比色，测定OD值，试验结果见表1。
抑制率（%）=[1-(实验组OD均值-空白组OD均值)/(对照组OD均值-空白组OD均值)]×100％。Bliss法计算受试化合物IC50值。
（3）结果
表1.对体外培养细胞生长的IC50(μg/ml)
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