一种油菜假单胞菌及其培养方法和应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103333843 A (43)申请公布日 2013.10.02 CN 103333843 A *CN103333843A* (21)申请号 201310305627.3 (22)申请日 2013.07.19 CGMCC NO.6774 2012.11.02 C12N 1/20(2006.01) A01N 63/02(2006.01) A01P 3/00(2006.01) C12R 1/38(2006.01) (71)申请人 上海农乐生物制品股份有限公司 地址 201419 上海市奉贤区雷州路 158 号 (72)发明人 张红艳 冯镇泰 沈丽娟 龚新进 王香秀 张进武。

2、 (74)专利代理机构 上海科盛知识产权代理有限 公司 31225 代理人 蒋亮珠 (54) 发明名称 一种油菜假单胞菌及其培养方法和应用 (57) 摘要 本发明涉及一种油菜假单胞菌及其培养方法 和应用， 该油菜假单胞菌分类命名为油菜假单胞 菌 (Pseudomonas brassicacearum)， 在中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编 号为CGMCC NO.6774， 将油菜假单胞菌接种到液体 培养基中， 在 24-28下培养得到假单胞菌产品 ； 所述液体培养基含有 3-5重量的可溶性淀粉、 0.1-0.3重量的无水硫酸镁， 1-3重量的蛋白 胨， 0.2-0.4重量的。

3、磷酸氢二钾， 余量为水， 所得 假单胞菌产品用作生防菌剂的活性成分， 与现有 技术相比， 本发明具有所用原料组成简单、 价格低 廉、 来源广泛， 而且生产过程中无污染性废料、 废 渣和废气的产生， 非常环保等优点。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书3页 (10)申请公布号 CN 103333843 A CN 103333843 A *CN103333843A* 1/1 页 2 1. 一种油菜假单胞菌， 其特征在于， 该油菜假单胞菌分类命名为油菜假单胞菌 (Pseu。

4、domonas brassicacearum)， 在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保 藏编号为 CGMCC NO.6774。 2. 根据权利要求 1 所述的培养油菜假单胞菌的方法， 其特征在于， 所述的油菜假单胞 菌为直的杆菌， 大小为 0.7-0.8X2.3-2.8 微米， 不产芽孢， 革兰氏染色阴性 ； 在牛肉膏蛋白 胨琼脂平板上培养时菌落圆形， 边缘整齐规则， 表面湿润光滑， 菌落半透明、 土黄色， 菌苔 薄。 3. 一种培养权利要求 1 所述的油菜假单胞菌的方法， 其特征在于， 该方法包括以下步 骤 ： 将油菜假单胞菌接种到液体培养基中， 在 24-28下培养得到假单胞菌。

5、产品 ； 所述液体 培养基含有 3-5重量的可溶性淀粉、 0.1-0.3重量的无水硫酸镁， 1-3重量的蛋白胨， 0.2-0.4重量的磷酸氢二钾， 余量为水。 4. 根据权利要求 3 所述的培养油菜假单胞菌的方法， 其特征在于， 所述的液体培养基 含有 3重量的可溶性淀粉、 0.2重量的无水硫酸镁， 2.5重量的蛋白胨， 0.2重量的磷 酸氢二钾， 余量为水。 5.根据权利要求3或4所述的培养油菜假单胞菌的方法， 其特征在于， 所述的培养的温 度为 26。 6. 一种权利要求 1 所述的油菜假单胞菌的应用， 其特征在于， 以油菜假单胞菌为活性 成分的生防菌剂。 7. 根据权利要求 6 所述的油。

6、菜假单胞菌的应用， 其特征在于， 将培养得到的假单胞菌 株 nlsy003 产品可配成浓度为 10109个 / 毫升的细菌悬浮液， 保存在 14 16左右的 环境中， 保存期一年， 作为生防菌剂使用时， 将该悬浮剂稀释 500-1000 倍使用。 权 利 要 求 书 CN 103333843 A 2 1/3 页 3 一种油菜假单胞菌及其培养方法和应用 技术领域 0001 本发明涉及一株生防菌株， 尤其是涉及一种油菜假单胞菌及其培养方法和应用。 背景技术 0002 油菜假单胞菌(Pseudomonas brassicacearum)是一种重要的植物根际促生细菌， 从植物根围分离到的油菜假单胞菌大。

7、部分都具有防病增产作用， 因而可能用于植物病害的 生物防治。该类菌株对油菜立枯病菌、 黄瓜霜霉病和白粉病菌、 小麦根腐病菌、 水稻纹枯病 病菌、 菜豆炭疽病菌、 番茄叶霉病菌、 小麦全蚀病菌、 白菜黑斑病菌、 烟草黑胫病菌、 番茄灰 霉病菌和芦笋茎枯病菌等多种蔬菜和粮食作物病原真菌均有较强的抑制作用， 并且能够在 多种作物根际进行定殖， 显示了在生物防治中应用的潜力。 发明内容 0003 本发明的目的就是为了提供一种所用原料组成简单、 价格低廉、 来源广泛， 而且生 产过程中无污染性废料、 废渣和废气的产生， 非常环保的油菜假单胞菌及其培养方法和应 用。 0004 本发明的目的可以通过以下技术。

8、方案来实现 ： 0005 一种油菜假单胞菌， 其特征在于， 该油菜假单胞菌分类命名为油菜假单胞菌 (Pseudomonas brassicacearum)， 在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保 藏编号为 CGMCC NO.6774。 0006 本发明油菜假单胞菌通过以下技术路线来实现 ： 0007 分离一株假单胞菌株， 筛选步骤如下 ： 0008 1)2010 年从安徽徐州、 江西新余、 江苏南通及上海松江等蔬菜种植基地采集 25 个 土样， 利用牛肉膏蛋白胨培养基进行分离， 共分离得到 300 多菌株。 0009 2) 然后进行平板拮抗实验， 得到对番茄灰霉病有较好拮抗效果的菌。

9、株 25 株。 0010 3) 通过盆栽试验， 进一步筛选对番茄灰霉病具有相对稳定的拮抗复筛细菌 5 菌 株。 0011 4)该生防菌株nlsy003是复筛细菌中对番茄灰霉病拮抗作用最强的一株。 根据菌 株的形态特征、 培养特征和生理生化特征， 参照杰氏细菌鉴定手册， 对该菌株进行鉴定， 初 步确定属于假单胞菌属， 它采自于江西新余。 0012 所述的油菜假单胞菌为直的杆菌， 大小为 0.7-0.8X2.3-2.8 微米， 不产芽孢， 革兰 氏染色阴性 ； 在牛肉膏蛋白胨琼脂平板上培养时菌落圆形， 边缘整齐规则， 表面湿润光滑， 菌落半透明、 土黄色， 菌苔薄。 0013 一种培养油菜假单胞菌。

10、的方法， 其特征在于， 该方法包括以下步骤 ： 将油菜假单胞 菌接种到液体培养基中， 在 24-28下培养得到假单胞菌产品 ； 所述液体培养基含有 3-5 重量的可溶性淀粉、 0.1-0.3重量的无水硫酸镁， 1-3重量的蛋白胨， 0.2-0.4重量的 磷酸氢二钾， 余量为水。 说 明 书 CN 103333843 A 3 2/3 页 4 0014 所述的液体培养基含有 3重量的可溶性淀粉、 0.2重量的无水硫酸镁， 2.5重 量的蛋白胨， 0.2重量的磷酸氢二钾， 余量为水。 0015 所述的培养的温度为 26。 0016 一种油菜假单胞菌的应用， 其特征在于， 以油菜假单胞菌为活性成分的生。

11、防菌剂。 0017 将培养得到的假单胞菌株 nlsy003 产品可配成浓度为 10109个 / 毫升的细菌悬 浮液， 保存在 14 16左右的环境中， 保存期一年， 作为生防菌剂使用时， 将该悬浮剂稀 释 500-1000 倍使用。 0018 与现有技术相比， 本发明的 nlsy003 假单胞菌株对黄瓜霜霉病、 自粉病、 番茄叶霉 病、 水稻纹枯病、 稻瘟病、 小麦全蚀病、 棉花枯萎病等具有良好的抑制效果。 该菌剂液体发酵 工艺中所用原料组成简单、 价格低廉、 来源广泛， 而且生产过程中无污染性废料、 废渣和废 气的产生， 非常环保。用该产品防治蔬菜和农作物病害， 可以减少化学农药对环境的污染。

12、， 而且对人畜十分安全。 0019 油菜假单胞菌 nlsy003 对植物病原菌具有高效广谱的抑菌作用， 对油菜立枯病 (L)、 小麦根腐病(G)、 水稻纹枯病(W)、 菜豆炭疽病(T)、 番茄叶霉病(M)、 小麦全蚀病(Q)、 白 菜黑斑病 (B)、 烟草黑胫病 (Y)、 番茄灰霉病 (F)、 芦笋茎枯病 (J) 的抑菌试验结果见下表 ： 0020 病原菌LGWTMQBYFJ EC50(mg/L)0.72 0.800.370.542.78 1.201.762.442.35 0.85 0021 EC50为半致死浓度， 浓度越低， 表示抑菌作用越强。 具体实施方式 0022 下面结合具体实施例对本。

13、发明进行详细说明。 0023 实施例 1 ： 筛选生防菌株 Pseudomonas brassicacearum nlsy003( 保藏号 ： CGMCC NO.6774) 0024 2010 年从江西新余蔬菜种植基地采集 5 个土样， 利用牛肉膏蛋白胨培养基进行 分离， 共分离得到 25 个菌株 ； 然后进行平板拮抗实验， 得到对番茄灰霉病有较好拮抗效 果的菌株 5 株 ； 通过盆栽试验， 进一步筛选对番茄灰霉病具有相对稳定的拮抗复筛细菌 nlsy003( 保藏号 ： CGMCC NO.6774)。 0025 实施例 2 ： 培养生防菌株 Pseudomonas brassicacearum。

14、 nlsy003( 保藏号 ： CGMCC NO.6774) 0026 采用液体发酵大量的生防菌产品 ： 将菌株接种到液体培养基中， 在 26下培养得 到假单胞菌产品。液体培养基含有 3重量的可溶性淀粉， 0.2重量的无水硫酸镁， 2.5 重量的蛋白胨， 0.2重量的磷酸氢二钾， 余量为水。将培养基在 0.15MPa 下灭菌 115 分钟， 自然冷却后用于接种。接种后将搅拌器的转速调为 180rpm， 保持 26培养 30 小时后出灌。 0027 将发酵液以3000rpm的转速离心20分钟， 去掉上清， 取出菌体沉淀物， 用无菌水将 其配成 100 亿 / 毫升的孢子悬浮液， 置于冰箱中冷藏，。

15、 可以保存十个月以上。 0028 实施例 3 ： 培养生防菌株 Pseudomonas brassicacearum nlsy003( 保藏号 ： CGMCC NO.6774) 说 明 书 CN 103333843 A 4 3/3 页 5 0029 培养方式等同于实施例 2， 不同之处在于所用的液体培养基为 ： 4重量的可溶性 淀粉， 0.1重量的无水硫酸镁， 2.0重量的蛋白胨， 0.15重量的磷酸氢二钾， 余量为水。 0030 实 施 例 4 ： 生 防 菌 株 Pseudomonas brassicacearum nlsy003( 保 藏 号 ： CGMCC NO.6774) 防治番茄灰。

16、霉病的药效试验 0031 在温室盆栽番茄苗， 人工接种灰霉病， 发病后， 将实施例 2 得到的生防菌产品在室 温下用无菌水配置成细菌浓度为 2107个 / 毫升的悬浮液， 对照为清水。每隔 7 天喷雾一 次， 共两次， 在第二次用药后十天进行调查统计。 喷本发明菌剂的处理对番茄灰霉病的抑制 率达 75以上。 0032 实 施 例 5 ： 生 防 菌 株 Pseudomonas brassicacearum nlsy003( 保 藏 号 ： CGMCC NO.6774) 防治水稻纹枯病的药效试验 0033 在温室盆栽水稻， 人工接种纹枯病菌块， 发病后， 将实施例 2 得到的生防菌产品在 室温下。

17、用无菌水配置成细菌浓度为 2107个 / 毫升的悬浮液， 对照为清水。每隔 7 天喷雾 一次， 共两次， 在第二次用药后十天进行调查统计。 喷本发明菌剂的处理对水稻纹枯病的抑 制率达 70以上。 0034 实 施 例 6 ： 生 防 菌 株 Pseudomonas brassicacearum nlsy003( 保 藏 号 ： CGMCC NO.6774) 防治黄瓜霜霉病的药效试验 0035 在温室盆栽水稻， 人工接种纹枯病菌块， 发病后， 将实施例 2 得到的生防菌产品在 室温下用无菌水配置成细菌浓度为 2107个 / 毫升的悬浮液， 对照为清水。每隔 7 天喷雾 一次， 共两次， 在第二次。

18、用药后十天进行调查统计。 喷本发明菌剂的处理对黄瓜霜霉病的抑 制率达 81以上。 0036 实 施 例 7 ： 生 防 菌 株 Pseudomonas brassicacearum nlsy003( 保 藏 号 ： CGMCC NO.6774) 防治黄瓜白粉病的药效试验 0037 在温室盆栽水稻， 人工接种纹枯病菌块， 发病后， 将实施例 2 得到的生防菌产品在 室温下用无菌水配置成细菌浓度为 2107个 / 毫升的悬浮液， 对照为清水。每隔 7 天喷雾 一次， 共两次， 在第二次用药后十天进行调查统计。 喷本发明菌剂的处理对黄瓜白粉病的抑 制率达 83以上。 0038 实施例 8 ： 培养生。

19、防菌株 Pseudomonas brassicacearum nlsy003( 保藏号 ： CGMCC NO.6774) 0039 培养方式等同于实施例 2， 不同之处在于所用的液体培养基为 ： 5重量的可溶性 淀粉， 0.1重量的无水硫酸镁， 1重量的蛋白胨， 0.2重量的磷酸氢二钾， 余量为水。 0040 实施例 9 ： 培养生防菌株 Pseudomonas brassicacearum nlsy003( 保藏号 ： CGMCC NO.6774) 0041 培养方式等同于实施例 2， 不同之处在于所用的液体培养基为 ： 3重量的可溶性 淀粉， 0.3重量的无水硫酸镁， 3重量的蛋白胨， 0.4重量的磷酸氢二钾， 余量为水。 说 明 书 CN 103333843 A 5 。