改善精子运动能力的人精子体外培养液及其应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103352025 A (43)申请公布日 2013.10.16 CN 103352025 A *CN103352025A* (21)申请号 201310256093.X (22)申请日 2013.06.25 C12N 5/076(2010.01) (71)申请人 南京医科大学 地址 211166 江苏省南京市江宁区天元东路 818 号 (72)发明人 沙家豪 周作民 郭雪江 牛鑫 (74)专利代理机构 南京经纬专利商标代理有限 公司 32200 代理人 李纪昌 唐循文 (54) 发明名称 改善精子运动能力的人精子体外培养液及其 应用 (57) 摘要 改善人精子运动能。

2、力的体外培养液及其应 用， 该培养液含有果糖 6- 磷酸 (F6P)。本发明改 善人精子运动能力的体外培养液， 对离体后纯化 的人精子进行培养， 除了维持精子运动还能显著 提高了正常人精子的活力， 为改进辅助生育技术 提供了有意义的参考。F6P 是直接用于培养液稀 释和培养的， 不涉及乙醇或者 DMSO 等有机溶剂， 避免了乙醇或者DMSO对精子的毒害作用。 精子培 养液中加入的 F6P， 能够显著提高临床弱精子症 患者精子的活力， 在重度弱精子症时活力改善程 度最为明显， 并且使部分培养的精子活力达到正 常精子活力范围， 其中对重度弱精子症改善程度 最为明显。这充分说明 F6P 的使用能够改。

3、善弱精 症患者精子的运动能力低下的作用。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103352025 A CN 103352025 A *CN103352025A* 1/1 页 2 1. 改善人精子运动能力的体外培养液， 其特征在于含有果糖 6- 磷酸。 2. 根据权利要求 1 所述改善人精子运动能力的体外培养液， 其特征在于每升培养液含 有以下组分 ： 5.5-6.0g NaCl、 2.0-2.5g NaHCO 、 0.3-0.4g K。

4、Cl、 0.04-0.06g MgSO4.7(H2O)、 0.04-0.06g KH2PO4、 0.035-0.04g 丙酮酸钠、 3.8-4.0g 乳酸钠、 0.28-0.35g CaCl2.2(H2O)、 0.5-1g F6P。 3. 权利要求 1 2 任一所述改善人精子运动能力的体外培养液的应用， 其特征在于培 养时间在 1-2h。 4. 根据权利要求 3 所述的改善人精子运动能力的体外培养液的应用， 其特征在于所用 精子为离体之后去除精浆的人精子。 权 利 要 求 书 CN 103352025 A 2 1/5 页 3 改善精子运动能力的人精子体外培养液及其应用 0001 技术领域 本发。

5、明涉及一种培养液， 具体涉及一种改善体外培养精子运动能力的培养液及其应 用。 0002 背景技术 0003 目前， 不孕不育率约占到育龄夫妇的十分之一， 其中男性因素不育约占一半， 但是 不育男性中超过 85% 均能够产生精子。男性不育临床上的一种重要表现是弱精子症， 即精 子运动能力低下， 导致男性不育， 提高精子的运动能力是治疗该类型男性不育的一种重要 方法。这也说明精子的运动能力在精子正常功能中的重要性。 0004 治疗不孕不育有多种辅助生殖手段， 如人工授精 (IUI)、 体外受精胚胎移植 (IVF) 和卵浆内单精子注射 （ICSI） 等， 这些技术均涉及到精子的体外培养和操作， 在体。

6、外 培养和操作的过程中， 维持甚至提高精子的功能对于提高辅助生殖的成功率有着重要的作 用。 0005 正常精子存在于精浆中， 能量的主要来源是果糖。临床使用的培养液如 BWW、 HTF 等使用葡萄糖作为能量来源。这两种类型的单糖在精子中被利用时均需转变成果糖 6- 磷 酸 （fructose 6-phosphate， F6P） ， 最终代谢转换成 ATP， 为精子的运动提供能量。 0006 在体外进行精液处理过程中， 精子脱离了体内环境， 处于人工配制的培养液中。 除 了需要合适的培养液 pH 和渗透压， 精子的运动需要消耗大量的能量。高质量的精子培养 液在生殖医学领域内有广泛而且重要的用途，。

7、 尤其是随着辅助生育技术在临床上的开展， 更是受到了足够的重视。如在人工授精时， 具有良好运动能力的精子能迅速上游至输卵管 与卵子受精 ； 在体外受精时运动能力良好的精子具有穿透卵子的卵丘和透明带的足够动 力， 顺利进入卵质中完成受精。 对于临床上常见的有运动能力异常精子， 改善精子活力具有 非常重要的治疗意义。所以制备能改善精子功能的精子培养液一直是生殖医学工作者的 研究重点之一。传统的用于体外处理精子的培养液主要有 Ham s F10， Tyrode s， BWW， Whitten s 等培养液， 这些培养液的优点是经过长期临床应用证明对精子无毒性并对精子 有一定的保护作用和营养作用。 基。

8、本能满足临床上开展辅助生育技术中体外处理精子的应 用。但显著的缺点是于精子运动能力的改善不够， 人工授精的成功率一直不高 ( 约徘徊在 10 % 左右 ) 可能也与此有关。因此， 开发一种能显著改善精子运动能力的精子培养液具有 非常重要的临床意义。 0007 发明内容 0008 解决的技术问题 ： 本发明的目的是提供一种改善体外培养精子活动能力的培养液 及其应用方法， 对不同运动能力的人类精子培养结果表明， 精子的运动能力均有显著的提 高。 说 明 书 CN 103352025 A 3 2/5 页 4 0009 技术方案 ： 改善人精子运动能力的体外培养液， 含有果糖 6- 磷酸。 0010 。

9、上述每升培养液含有以下组分 ： 5.5-6.0g NaCl、 2.0-2.5g NaHCO 、 0.3-0.4g KCl、 0.04-0.06g MgSO4.7(H2O)、 0.04-0.06g KH2PO4、 0.035-0.04g 丙酮酸钠、 3.8-4.0g 乳酸 钠、 0.28-0.35g CaCl2.2(H2O)、 0.5-1g F6P。 0011 改善人精子运动能力的体外培养液的应用， 培养时间在 1-2h。所用精子为离体之 后去除精浆的人精子。 0012 有益效果 ： 1、 本发明改善人精子运动能力的体外培养液， 在精子培养液的成分中使用 F6P， 对离体 后纯化的人精子进行培养。

10、， 除了维持精子运动还能显著提高人精子的活力， 为改进辅助生 育技术提供了有意义的参考。 0013 2、 本发明中的F6P是直接用培养液稀释和培养的， 不涉及乙醇或者DMSO等有机溶 剂， 避免了乙醇或者 DMSO 对精子的毒害作用。 0014 3、 本发明中， 精子培养液中加入的 F6P， 能够显著提高临床弱精子症患者精子的活 力， 在重度弱精子症时活力改善程度最为明显， 并且使部分培养的精子活力达到正常精子 活力范围， 其中对重度弱精子症改善程度最为明显。这充分说明 F6P 的使用具有改善弱精 症患者精子运动能力低下的作用。 0015 附图说明 0016 图 1 HTF-F6P 培养液对不。

11、同运动能力的精子活力的作用图 ； 图示说明 ： X-轴是在不同培养液中精子培养时间， Y-轴是指精子活力 （Motility = A + B， 以百分比计数） 。图 A 表示重度弱精子培养后精子活力的统计， 图 B 表示中轻度弱精子 症精子培养后活力数据的统计， 图 C 表示正常活力精子培养后活力数据的统计。图中数据 以均值 标准误差显示。 0017 具体实施方式 0018 以下实施例进一步说明本发明的内容， 但不应理解为对本发明的限制。在不背 离本发明精神和实质的情况下， 对本发明方法、 步骤或条件所作的修改和替换， 均属于本 发明的范围。若未特别指明， 实施例中所用的技术手段为本领域技术人。

12、员所熟知的常规 手段。以下实施例中所使用的试剂和材料均为市售产品， 例如， 实验中所使用的 F6P 可从 SIGMA-ALDRICH， MO， USA 购买。 0019 实施例 1 1. 样品准备 选择重度弱精子症患者的精子样本进行实验。手淫法排精， 用特定的无菌容器收集禁 欲 2-7 天的精子样本。将样品水浴保持 22-37， 液化后的精液， 根据 WHO1999 年的评价标 准， 使用电脑辅助精液分析仪 CASA （IVOS; Hamilton-Thorn Research， Inc.Beverly， MA， USA） ， 对精子参数 （体积， 精子计数， 活力和运动特性的百分比） 进行评。

13、估。弱精子症被定义 为 A 级精子数目 25或 A+B 级精子数目 50，（世界卫生组织， 1999 年） ， 而所有其他参数 说 明 书 CN 103352025 A 4 3/5 页 5 都是正常。根据形态学观察排除含白细胞或者体细胞污染的标本。重度弱精子症精子的运 动参数为 (a+ b) 级 25%， 其中 a 级精子 5%。 0020 2. 精子体外培养 1） 密度梯度离心从精液当中分选精子。 0021 在试管内放置 1mL 60%（v/v） 的 Percoll 分离液， 在其上铺上 1mL-1.5mL 的精液， 300g 的离心力下离心 5-10 分钟， 弃去上清液。重悬精子悬液于 2。

14、mL 的 HTF-S 培养液 （商业 化 HTF 培养液， 简称 HTF-S） ， 300g 离心力离心 5-10 分钟， 重复该步骤一次。将精子悬液轻 轻转移到实验所用到的各种精子培养液中。 0022 2） 精子培养 合适数量的精子 （5106左右） 转移到各种精子培养液中之后， 置于 37， 5% CO2的培 养箱中 1-2 小时。 0023 所用的精子培养液为 ： 商业化的HTF-S培养液和HTF-F6P培养液 （配方见表1） 。 下 同。 0024 表 1. HTF-F6P 培养液配方 组分g/L NaCl5.9 NaHCO 2.1 KCl0.35 MgSO4.7(H2O)0.05 K。

15、H2PO40.05 丙酮酸钠0.036 乳酸钠3.998 CaCl2.2(H2O)0.294 F6P0.78 3. 精子活动力的检测 根据WHO1999年的评价标准， 使用计算机辅助精液分析仪CASA （IVOS; Hamilton-Thorn Research， Inc.Beverly， MA， USA） ， 对精子活力进行评估。对于每个标本， 选取 6-10 个视 野， 计数到的精子数目不小于 500 个。 0025 实施例 2 1. 样品准备 选择中轻度弱精子症患者的精子样本进行实验。手淫法排精， 用特定的无菌容器收集 禁欲 2-7 天的精子样本。将样品水浴保持 22-37， 液化后的精。

16、液， 根据 WHO1999 年的评价 标准， 使用电脑辅助精液分析仪 CASA（IVOS; Hamilton-Thorn Research， Inc. Beverly， MA， USA） ， 对精子参数 （体积， 精子计数， 活力和运动特性的百分比） 进行评估。根据 1999 年 世界卫生组织的标准， 中轻度弱精子症的精子运动参数为 25%(a+b) 级 50% 且 a 级精子 25%。 0026 2. 精子体外培养 1） 密度梯度离心从精液当中分选精子。 0027 在试管内放置 1mL 60%（v/v） 的 Percoll 分离液， 在其上铺上 1mL-1.5mL 的精液， 300g 的离心。

17、力下离心 5-10 分钟， 弃去上清液。重悬精子悬液于 2mL 的 HTF-S 培养液， 300g 离心力离心 5-10 分钟， 重复该步骤一次。将精子悬液轻轻转移到实验所用到的各种精子培 养液中。 说 明 书 CN 103352025 A 5 4/5 页 6 0028 2） 精子培养 合适数量的精子 （5106左右） 转移到各种精子培养液中之后， 置于 37， 5% CO2的培 养箱中 1-2 小时。 0029 所用的精子培养液为 ： 商业化的HTF-S培养液和HTF-F6P培养液 （配方见表1） 。 下 同。 0030 3. 精子活动力的检测 根据WHO1999年的评价标准， 使用计算机辅。

18、助精液分析仪CASA （IVOS; Hamilton-Thorn Research， Inc.Beverly， MA， USA） ， 对精子活力进行评估。对于每个标本， 选取 6-10 个视 野， 计数到的精子数目不小于 500 个。 0031 实施例 3 1. 样品准备 选择健康男性的精子捐赠者的精子样本进行实验。手淫法排精， 用特定的无菌容器收 集禁欲 2-7 天的精子样本。将样品水浴保持 22-37， 液化后的精液， 根据 WHO1999 年的评 价标准， 使用电脑辅助精液分析仪 CASA （IVOS; Hamilton-Thorn Research， Inc.Beverly， MA， 。

19、USA） ， 对精子参数 （体积， 精子计数， 活力和运动特性的百分比） 进行评估。 0032 2. 精子体外培养 1） 密度梯度离心从精液中分选精子。 0033 在试管内放置 1mL 60%（v/v） 的 Percoll 分离液， 在其上缓慢铺上 1mL-1.5mL 的 精液， 300g 的离心力下离心 5-10 分钟， 弃去上清液。重悬精子悬液于 2mL 的 HTF-S 培养液， 300g离心力离心5-10分钟， 重复该步骤一次。 将精子悬液轻轻转移到实验所用到的各种精 子培养液中。 0034 2） 精子培养 合适数量 （5106左右） 的精子转移到各种精子培养液中之后， 置于 37， 5。

20、% CO2的培 养箱中 1-2 小时。 0035 所用的精子培养液为 ： 商业化的 HTF-S 培养液， HTF-F6P 培养液 （配方见表 1） 。 0036 3. 精子活动力的检测 根据WHO1999年的评价标准， 使用计算机辅助精液分析仪CASA （IVOS; Hamilton-Thorn Research， Inc.Beverly， MA， USA） ， 对精子活力进行评估。对于每个标本， 选取 6-10 个视 野， 计数到的精子数目不小于 500 个。 0037 实验结果表明 ： 体外培养的精子在HTF-S培养液中培养1小时和2小时之后， 活动 力均没有产生显著性变化。重度弱精子症精。

21、子在 HTF-F6P 培养液中培养 1 小时之后之间活 力升高有统计学差异(P0.05)。 中轻度弱精子症精子与正常精子在HTF-F6P培养1小时后 活力升高无统计学差异。三种类型的精子在 HTF-F6P 培养液中培养 2 小时后精子活力与培 养前相比均有明显升高。其中重度弱精子症精子活力培养后从 13.252.96%( 均值 标 准误 ) 上升至 30.006.17%(P0.001)， 升高达到培养前的 2.26 倍 ； 中轻度弱精子症精子 活力培养后从 34.191.68( 均值 标准误 ) 上升至 48.313.40(P0.001)， 升高达到培 养前的 1.41 倍 ； 而正常精子活力从培养前 54.881.27 上升至 63.382.03（P0.001） ， 详细实验数据见图 1。 0038 虽然， 上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述， 但在 说 明 书 CN 103352025 A 6 5/5 页 7 本发明的基础上， 可以对之作一些修改或改进， 这对本领域技术人员而言是显而易见的。 因 此， 在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改活改进， 均属本发明要求保护的内容。 说 明 书 CN 103352025 A 7 1/1 页 8 图 1 说 明 书 附 图 CN 103352025 A 8 。