《一种乳酸链球菌素复合生物防腐剂及其制备方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种乳酸链球菌素复合生物防腐剂及其制备方法.pdf（7页完整版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 CN 103355730 A (43)申请公布日 2013.10.23 CN 103355730 A *CN103355730A* (21)申请号 201310337300.4 (22)申请日 2013.08.06 A23L 3/3571(2006.01) C12P 21/02(2006.01) C12R 1/465(2006.01) (71)申请人 山东省蓝源生物工程有限公司 地址 252000 山东省聊城市开发区中华路 6 号 (72)发明人 张彦杰 梁勇 彭玉存 张洲 李凤翠 刁文锦 孙玉科 (74)专利代理机构 济南智圆行方专利代理事务 所 ( 普通合伙企业 ) 3。
2、7231 代理人 杜文娟 (54) 发明名称 一种乳酸链球菌素复合生物防腐剂及其制备 方法 (57) 摘要 本发明公开了一种乳酸链球菌素复合生物防 腐剂及其制备方法。防腐剂包括乳酸链球菌发酵 液， 以及， 按重量百分比计， 占乳酸链球菌发酵液 重量的下列组分 ： 壳聚糖 2 6， 竹叶抗氧化物 1 2， 六偏磷酸钠 5、 纳他霉素 0.5 1、 大蒜素 1 2、 抗坏血酸钠 0.05 0.1、 麦芽糊精 1 3和 NaCl0.5 2。本发明的防 腐剂不添加任何化学防腐剂成分， 克服了单纯的 乳酸链球菌素抗菌谱窄和低 PH 值依赖性的局限， 具有高效、 广谱、 稳定性好、 安全性高的特点， 极大。
3、 的提高了乳酸链球菌素的防腐效果和应用范围， 具有较高的经济效益和社会效益。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 (10)申请公布号 CN 103355730 A CN 103355730 A *CN103355730A* 1/1 页 2 1. 一种乳酸链球菌素复合生物防腐剂， 其特征在于， 包括乳酸链球菌发酵液， 以及， 按 重量百分比计， 占乳酸链球菌发酵液重量的下列组分 ： 壳聚糖 2 6， 竹叶抗氧化物 1 2， 六偏磷酸钠 5、 纳他霉素 0.5 1、 大 蒜素 1 2、 。
4、抗坏血酸钠 0.05 0.1、 麦芽糊精 1 3和 NaCl 0.5 2。 2. 根据权利要求 1 所述的乳酸链球菌素复合生物防腐剂， 其特征在于， 所述占乳酸链 球菌发酵液重量的下列组分 ： 壳聚糖 2 3， 竹叶抗氧化物 1 1.5， 六偏磷酸钠、 纳他霉素 0.5、 大蒜素 1 1.5、 抗坏血酸钠 0.05、 麦芽糊精 3和 NaCl 0.5 0.8。 3. 根据权利要求 1 所述的乳酸链球菌素复合生物防腐剂， 其特征在于， 所述占乳酸链 球菌发酵液重量的下列组分 ： 壳聚糖 2， 竹叶抗氧化物 1， 六偏磷酸钠、 纳他霉素 0.5、 大蒜素 1、 抗坏血 酸钠 0.05、 麦芽糊精 。
5、3和 NaCl 0.5。 4. 根据权利要求 1 所述的乳酸链球菌素复合生物防腐剂， 其特征在于， 所述占乳酸链 球菌发酵液重量的下列组分 ： 壳聚糖 3， 竹叶抗氧化物 1.5， 六偏磷酸钠、 纳他霉素 0.5、 大蒜素 1.5、 抗 坏血酸钠 0.05、 麦芽糊精 3和 NaCl 0.8。 5.权利要求14所述的乳酸链球菌素复合生物防腐剂的制备方法， 其特征在于， 包括 以下步骤 ： （1） 菌株发酵 将乳酸链球菌进行液体发酵， 生产乳酸链球菌素 ； （2） 发酵液预处理 a. 将发酵液用 10mol/L 的盐酸在搅拌状态下调 PH=2-3， 80-90加热 30-60 分钟， 将乳 酸链。
6、球菌素完全释放于发酵液中， 经板框过滤去除培养基颗粒和菌体， 收集滤液 ； b. 滤液经孔径为 15-30 万的滤膜去除大分子蛋白和杂质 ； （3） 发酵液复配 a. 将处理后的发酵液添加六偏磷酸钠和麦芽糊精和壳聚糖， 调 PH 值为 6.5， 充分溶解 后， 10-25M 帕高压均质 15-30 分钟 ； b. 向均质后的发酵液加入竹叶抗氧化物、 纳他霉素、 大蒜素、 抗坏血酸钠和 NaCl 充分 混和均匀。 6. 根据权利要求 5 所述的方法， 其特征在于， 步骤 （1） 中发酵条件为 ： 1%-3% 接种量， 发 酵培养基以发酵培养基的总重量计， 包括复合氮源 2%-4%（其中复合氮源为。
7、脱脂牛乳、 酵母 粉、 大豆蛋白胨、 牛肉膏任意比的混合物） 、 复合碳源 2-4% （其中复合碳源为葡萄糖、 蔗糖、 可 溶性淀粉任意比的混合物） 、 K2HPO4为 1.0-1.5%， MgSO47H2O 0.01-0.02%、 维生素 C0.5%， 余 量为水， 调 pH=6.2-7.0， 罐压 0.1MPa， 30-35发酵培养 13-20h， 乳酸球菌为对数生长期末 期时停止发酵。 7. 根据权利要求 6 所述的方法， 其特征在于， 所述复合氮源为 ： 脱脂牛乳 0.8-1%、 酵母 粉 0.8-1%、 大豆蛋白胨 0.5%、 牛肉膏 0.5%。 8. 根据权利要求 6 所述的方法，。
8、 其特征在于， 所述复合碳源为葡萄糖 0.5%、 蔗糖 1%、 可 溶性淀粉 0.5%。 权 利 要 求 书 CN 103355730 A 2 1/5 页 3 一种乳酸链球菌素复合生物防腐剂及其制备方法 0001 技术领域 0002 本发明属于生物技术领域， 涉及一种复合生物防腐剂及其制备方法。 0003 背景技术 0004 乳酸链球菌素 （Nisin） 亦称乳酸链球菌肽， 是乳酸链球菌产生的一种的多肽物质， 它能有效抑制引起食品腐败的嗜热脂肪芽孢杆菌、 金黄色葡萄球菌、 李斯特氏菌、 肉毒梭菌 等各种革兰氏阳性菌的营养细胞和芽孢。食用后在人体的生理 pH 条件和 胰凝乳蛋白 酶作用下很快水解。
9、成氨基酸， 是一种高效、 无毒、 安全、 无副作用的天然食品防腐剂。1969 年， 联合国粮农组织和世界卫生组织的食品添加剂联合专家委员会认定乳酸链球菌素为安 全的生物食品添加剂。1990 年 3 月 29 日中国卫生部将其列入 GB276086 的 1990 年增补 品种中， 可用于罐藏食品、 植物蛋白食品、 乳制品和肉制品， 目前在食品领域已被 60 多个国 家和地区广泛应用。 0005 乳酸链球菌素的局限性在于它的抑菌普窄使它的应用范围受限， 它只能抑制大部 分革兰氏阳性菌及其芽孢的生长和繁殖， 不能抑制酵母菌和霉菌等。并且乳酸链球菌素具 有低 PH 值依赖性， 一旦 pH 值超过 6.。
10、5， 活性降低 ； 经 115高压灭菌后在 pH 值为 2 时仍然 是稳定的， 但在 pH 值为 5 时失去 40% 活性 ,pH 值为 6.8 时失去 90% 的活性。另外以乳酸链 球菌素为主要成分的复合防腐剂一般采用乳酸链球菌素冻干粉复溶而成， 因其本身的溶解 度低， 而使其有效浓度较低， 而且增加了工艺成本， 有一定的局限性。而且目前市场上已有 的复配防腐剂都是将几种不同的化学防腐剂和乳酸链球菌素进行复配， 具有一定的健康危 害性， 如何研制零添加化学试剂的复配防腐剂， 绝对安全的食品防腐剂， 是食品行业面临的 一个难题。 0006 发明内容 0007 本发明所要解决的技术问题是为了确服。
11、乳酸链球菌素抑菌范围窄和稳定性差的 缺陷， 提供一种乳酸链球菌素复合生物防腐剂。 0008 本发明还提供了该乳酸链球菌素复合生物防腐剂的制备方法。 0009 为了实现上述目的， 本发明提出如下技术方案 ： 一种乳酸链球菌素复合生物防腐剂， 包括乳酸链球菌发酵液， 以及， 按重量百分比计， 占乳酸链球菌发酵液重量的下列组分 ： 壳聚糖 2 6， 竹叶抗氧化物 1 2， 六偏磷酸钠 5、 纳他霉素 0.5 1、 大 蒜素 1 2、 抗坏血酸钠 0.05 0.1、 麦芽糊精 1 3和 NaCl 0.5 2。 0010 本发明利用乳酸链球菌的发酵液制备复合生物防腐， 经过发酵液的粗处理、 添加 说 明。
12、 书 CN 103355730 A 3 2/5 页 4 生物活性物质、 科学配比得到的复合生物防腐剂， 其中不添加任何化学防腐成分， 通过以上 生物活性物质的进行科学配比， 利用天然产物本身具有的抗氧化性能， 使之与发酵液的抑 菌总用协同增效， 达到使食品抗氧化保鲜、 抑菌防腐、 延长食品保质期、 提高食品品质和安 全性的目的。经抑菌实验和稳定性实验检测具有高效、 广谱、 稳定性好、 安全性高的特点。 0011 优选的， 所述占乳酸链球菌发酵液重量的下列组分 ： 壳聚糖 2 3， 竹叶抗氧化物 1 1.5， 六偏磷酸钠、 纳他霉素 0.5、 大蒜素 1 1.5、 抗坏血酸钠 0.05、 麦芽糊。
13、精 3和 NaCl 0.5 0.8。 0012 优选的， 所述占乳酸链球菌发酵液重量的下列组分 ： 壳聚糖 2， 竹叶抗氧化物 1， 六偏磷酸钠、 纳他霉素 0.5、 大蒜素 1、 抗坏血 酸钠 0.05、 麦芽糊精 3和 NaCl 0.5。 0013 优选的， 所述占乳酸链球菌发酵液重量的下列组分 ： 壳聚糖 3， 竹叶抗氧化物 1.5， 六偏磷酸钠、 纳他霉素 0.5、 大蒜素 1.5、 抗 坏血酸钠 0.05、 麦芽糊精 3和 NaCl 0.8。 0014 本发明提供的乳酸链球菌素复合生物防腐剂的制备方法， 包括以下步骤 ： （1） 菌株发酵 将乳酸链球菌进行液体发酵， 生产乳酸链球菌素。
14、 ； （2） 发酵液预处理 a. 将发酵液用 10mol/L 的盐酸在搅拌状态下调 PH=2-3， 80-90加热 30-60 分钟， 将乳 酸链球菌素完全释放于发酵液中， 经板框过滤去除培养基颗粒和菌体， 收集滤液 ； b. 滤液经孔径为 15-30 万的滤膜去除大分子蛋白和杂质 ； （3） 发酵液复配 a. 将处理后的发酵液添加六偏磷酸钠和麦芽糊精和壳聚糖， 调 PH 值为 6.5， 充分溶解 后， 10-25M 帕高压均质 15-30 分钟 ； b. 向均质后的发酵液加入竹叶抗氧化物、 纳他霉素、 大蒜素、 抗坏血酸钠和 NaCl 充分 混和均匀。 0015 优选的， 步骤 （1） 中发。
15、酵条件为 ： 1%-3% 接种量， 发酵培养基以发酵培养基的总重 量计， 包括复合氮源 2%-4%（其中复合氮源为脱脂牛乳、 酵母粉、 大豆蛋白胨、 牛肉膏任意比 的混合物） 、 复合碳源 2-4%（其中复合碳源为葡萄糖、 蔗糖、 可溶性淀粉任意比的混合物） 、 K2HPO4为 1.0-1.5%， MgSO47H2O 0.01-0.02%、 维生素 C0.5%， 余量为水， 调 pH=6.2-7.0， 罐 压 0.1MPa， 30-35发酵培养 13-20h， 乳酸球菌为对数生长期末期时停止发酵。 0016 优选的， 所述复合氮源为 ： 脱脂牛乳 0.8-1%、 酵母粉 0.8-1%、 大豆蛋。
16、白胨 0.5%、 牛 肉膏 0.5% ； 所述复合碳源为葡萄糖 0.5%、 蔗糖 1%、 可溶性淀粉 0.5%。 0017 优选的， 所述防腐剂采用液体剂型， 使于添加使用， 能与不同材质食品混溶， 提高 防腐效果。 0018 本发明将乳酸链球菌进行发酵， 是将乳酸链球菌接种于改良的液体发酵培养基进 行发酵产生乳酸链球菌素， 其发酵液经过初步处理， 利用发酵液的体系与其他生物活性物 质进行复配后制成的复合生物防腐剂。 0019 本发明直接利用处理后的发酵液进行复配， 发酵液只经过粗略处理， 利用发酵液 里残存的部分大分子物质和其他无机盐等构成的复杂体系， 提高了乳酸链球菌素的抑菌效 说 明 书。
17、 CN 103355730 A 4 3/5 页 5 果， 复配后体系稳定， 产品稳定性能较好。 0020 本发明的发酵液经板框过滤和无机滤膜超滤进行预处理， 工艺简单、 发酵液利用 率高并减少了污水排放。 0021 复合防腐剂经过抑菌试验和稳定性试验证明增大了单纯的乳酸链球菌素的抑菌 范围， 并且对热和酸的稳定性较高， 解决了乳酸链球菌素抑菌范围窄和稳定性差的局限。 0022 本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出， 部分将从下面的描述中变 得明显， 或通过本发明的实践了解到。 0023 具体实施方式 0024 下面通过实施例对本发明的技术方案作进一步说明， 但不能理解为对本发明的限 。
18、制。 0025 本实施方式所使用的乳酸链球菌是 ： 乳酸乳球菌乳酸亚种 T0625(Lactococcus lactis subspLacfisT0625)， 由沈阳农业大学赠送。 0026 复合防腐剂的效价测定采用琼脂扩散法， 培养基为牛肉膏蛋白胨培养基， 以培养 基的总重量计， 胰蛋白胨 O8， 酵母膏 O5， 葡萄糖 O5， NaC105， K2HPO405， Tween20 1， 琼脂 18， 余量为水， pH68。 0027 实施例 1 1、 菌株发酵 将乳酸链球菌以 1% 的接种量接种于液体发酵培养基， 进行液体发酵。发酵培养基包 括 ： 以发酵培养基的总重量计， 复合氮源 （脱脂。
19、牛乳 0.8%、 酵母粉 0.8%、 大豆蛋白胨 0.5%、 牛 肉膏 0.5%） 、 复合碳源 （葡萄糖 0.5%、 蔗糖 1%、 可溶性淀粉 0.5%） 、 K2HPO4为 1.0%， MgSO4 7H2O 0.01%、 维生素 C0.5%， 余量为水， 调 pH6.5， 罐压 0.1MPa， 30培养培养 20h， 停止发酵。 0028 2、 发酵液预处理 （1） 将发酵液用 10mol/L 的盐酸在搅拌状态下调 PH=2.5， 90加热 30 分钟， 将乳酸链 球菌素完全释放于发酵液中， 经板框过滤去除培养基颗粒和菌体， 收集滤液。 0029 （2） 滤液经孔径为 15 万的滤膜去除大。
20、分子蛋白和杂质。 0030 3、 发酵液复配 （1） 将处理后的发酵液添加， 以乳酸链球菌发酵液总重量计， 1六偏磷酸钠和 3麦芽 糊精和壳聚糖 2， 调 PH 值为 6.5， 充分溶解后， 10-25M 帕高压均质 15-30 分钟。 0031 （2） 向均质后的发酵液加入竹叶抗氧化物（产品名 ： 竹叶抗氧化物 ； 规格 ： 8:1 ； 购自润泽生物有限公司， 竹叶抗氧化物已列入国标 GB-2760， 被卫生部批准作为天然 食品抗氧化剂使用） 、 纳他霉素 0.5、 大蒜素 1、 抗坏血酸钠 0.05和 NaCl0.5充分混 和均匀， 得乳酸链球菌素复合生物防腐剂。 0032 本实施例得到的。
21、一种乳酸链球菌素复合生物防腐剂， 包括乳酸链球菌发酵液， 以 及， 按重量百分比计， 占乳酸链球菌发酵液重量的下列组分 ： 壳聚糖2， 竹叶抗氧化物1， 六偏磷酸钠1、 纳他霉素0.5、 大蒜素1、 抗坏血酸 钠 0.05、 麦芽糊精 3和 NaCl 0.5。 0033 4、 复配防腐剂的抑菌谱实验 说 明 书 CN 103355730 A 5 4/5 页 6 （1） 乳酸链球菌标准品用0.02mol/L的盐酸溶液配制成100 IU/mL的标准液， 发酵液用 无菌水稀释 100 倍备用。 0034 （2） 将金黄色葡糖球菌、 大肠杆菌、 沙门氏菌、 假单孢杆菌、 枯草芽孢杆菌营养肉汤 培养基 。
22、（配方是蛋白胨 10g， 牛肉膏粉 3g， 氯化钠 5g， 蒸馏水 1000mL， 最终 pH=7.5） ， 将酵母 菌和黑曲霉分别接种于 PDA 培养基进行摇菌培养， 菌悬液用无菌生理盐水稀释为 107cfu/ mL。 0035 (3) 取 1mL 指示菌菌悬液涂布于牛肉膏蛋白胨平板上， 涂布均匀晾干后放置牛津 杯 （内径 6mm， 高 8mm） ， 静置 10 分钟， 滴加复合防腐剂和乳酸链球菌素标准品， 37培养 48 小时后， 用游标卡尺测量抑菌圈直径并计算效价。 0036 结果显示复合防腐剂对以上受试菌株均具有较强的抑菌效果， 抑菌谱明显拓宽。 经计算复合防腐剂的效价为 15000I。
23、U/mL。 0037 5、 复合防腐剂的稳定性检测 （1） 将复合防腐剂调 PH=5， 115加热 30 分钟， 用琼脂扩散法检测与未处理的复合防腐 剂抑菌效果变化。 0038 （2） 将复合防腐剂调 PH=5， 121加热 20 分钟， 用琼脂扩散法检测与未处理的复合 防腐剂抑菌效果变化。 0039 （3） 将复合防腐剂调 PH=7， 115加热 30 分钟， 用琼脂扩散法检测与未处理的复合 防腐剂抑菌效果变化。 0040 （4） 将复合防腐剂调 PH=7， 121加热 20 分钟， 用琼脂扩散法检测与未处理的复合 防腐剂抑菌效果变化。 0041 结果显示， 经加热复合防腐剂抑菌效果无变化，。
24、 具有较强的稳定性。 0042 实施例 2 1、 菌株发酵 将乳酸链球菌 LY103 以 1% 的接种量接种于液体发酵培养基， 进行液体发酵。发酵培养 基包括 ： 以发酵培养基的总重量计， 复合氮源 （脱脂牛乳 1%、 酵母粉 1%、 大豆蛋白胨 0.5%、 牛 肉膏0.5%） 、 复合碳源 （葡萄糖0.5%、 蔗糖1%、 可溶性淀粉0.5%） 、 K2HPO4为1.0%， MgSO4 7H2O 0.01%、 维生素 C0.5%， 余量为水， 调 pH6.5， 罐压 0.1MPa， 30培养培养 20h， 停止发酵。 0043 2、 发酵液预处理。 0044 （1） 将发酵液用 10mol/L。
25、 的盐酸在搅拌状态下调 PH=2.5， 90加热 30 分钟， 将乳 酸链球菌素完全释放于发酵液中， 经板框过滤去除培养基颗粒和菌体， 收集滤液。 0045 （2） 滤液经孔径为 15 万的滤膜去除大分子蛋白和杂质。 0046 3、 发酵液复配 （1） 将处理后的发酵液， 以乳酸链球菌发酵液总重量计， 添加 1六偏磷酸钠和 3麦 芽糊精和壳聚糖 3， 调 PH 值为 6.5， 充分溶解后， 10-25M 帕高压均质 15-30 分钟。 0047 （2） 向均质后的发酵液加入竹叶抗氧化物.5（产品名 ： 竹叶抗氧化物 ； 规格 ： 8:1 ； 购自润泽生物有限公司， 竹叶抗氧化物已列入国标 GB。
26、-2760， 被卫生部批准作为天然 食品抗氧化剂使用） 、 纳他霉素 0.5、 大蒜素 1.5、 抗坏血酸钠 0.05和 NaCl0.8充分 混和均匀， 得乳酸链球菌素复合生物防腐剂。 0048 本实施例得到的一种乳酸链球菌素复合生物防腐剂， 包括乳酸链球菌发酵液， 以 说 明 书 CN 103355730 A 6 5/5 页 7 及， 按重量百分比计， 占乳酸链球菌发酵液重量的下列组分 ： 壳聚糖3， 竹叶抗氧化物1.5， 六偏磷酸钠1、 纳他霉素0.5、 大蒜素1、 抗坏血 酸钠 0.05、 麦芽糊精 3和 NaCl 0.8。 0049 4、 复配防腐剂的抑菌谱实验 （1） 乳酸链球菌标准。
27、品用0.02mol/L的盐酸溶液配制成100 IU/mL的标准液， 发酵液用 无菌水稀释 100 倍备用。 0050 （2） 将金黄色葡糖球菌、 大肠杆菌、 沙门氏菌、 假单孢杆菌、 枯草芽孢杆菌营养肉汤 培养基 （配方是蛋白胨 10g， 牛肉膏粉 3g， 氯化钠 5g， 蒸馏水 1000mL， 最终 pH=7.5） ， 将酵母 菌和黑曲霉分别接种于 PDA 培养基进行摇菌培养， 菌悬液用无菌生理盐水稀释为 107cfu/ mL。 0051 (3) 取 1mL 指示菌菌悬液涂布于牛肉膏蛋白胨平板上， 涂布均匀晾干后放置牛津 杯 （内径 6mm， 高 8mm） ， 静置 10 分钟， 滴加复合防。
28、腐剂和乳酸链球菌素标准品， 37培养 48 小时后， 用游标卡尺测量抑菌圈直径并计算效价。 0052 结果显示复合防腐剂对以上受试菌株均具有较强的抑菌效果， 抑菌谱明显拓宽。 经计算复合防腐剂的效价为 17000IU/mL。 0053 5、 复合防腐剂的稳定性检测 （1） 将复合防腐剂调 PH=5， 115加热 30 分钟， 用琼脂扩散法检测与未处理的复合防腐 剂抑菌效果变化。 0054 （2） 将复合防腐剂调 PH=5， 121加热 20 分钟， 用琼脂扩散法检测与未处理的复合 防腐剂抑菌效果变化。 0055 （3） 将复合防腐剂调 PH=7， 115加热 30 分钟， 用琼脂扩散法检测与未处理的复合 防腐剂抑菌效果变化。 0056 （4） 将复合防腐剂调 PH=7， 121加热 20 分钟， 用琼脂扩散法检测与未处理的复合 防腐剂抑菌效果变化。 0057 结果显示， 经加热复合防腐剂抑菌效果无变化， 具有较强的稳定性。 0058 尽管已经示出和描述了本发明的实施例， 本领域的普通技术人员可以理解 ： 在不 脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、 修改、 替换和变型， 本 发明的范围由权利要求及其等同物限定。 说 明 书 CN 103355730 A 7 。