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1、(10)申请公布号 CN 103333964 A (43)申请公布日 2013.10.02 CN 103333964 A *CN103333964A* (21)申请号 201310264568.X (22)申请日 2013.06.28 C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人 浙江星博生物科技有限公司 地址 315040 浙江省宁波市高新区新晖路 139 号 2 号楼 (72)发明人 张彩霞 曾桥 薛志刚 (74)专利代理机构 宁波奥圣专利代理事务所 ( 普通合伙 ) 33226 代理人 程晓明 (54) 发明名称 人类 Y 染色体 SY124、 SY153 和 SY239 位点缺。
2、 失的 PCR 检测液 (57) 摘要 本发明公开了人类 Y 染色体 SY124、 SY153 和 SY239 位点缺失的 PCR 检测液， 包括镁离子、 dNTP、 Taq 酶、 氯化钾、 三羟甲基氨基甲烷 - 盐酸、 SY124 引物、 SY153 引物和 SY239 引物， 该 PCR 检 测液中镁离子的浓度为 2.632mM， dNTP 的浓度 为 0.263mM， Taq 酶的浓度为 105u/mL， 氯化钾的 浓度为 50.63mM， pH 值为 8.3 的三羟甲基氨基甲 烷 - 盐酸的浓度为 10.53mM， SY124 引物的浓度为 0.632M， SY153 引物的浓度为 0。
3、.263M， SY239 引物的浓度为 0.263M ； 该 PCR 检测液可以在低 温中长期保存， 能耐受反复冻融， 检测时只需加入 DNA 模板， 操作简便， 快速， 扩增的特异性和灵敏 性效果。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书2页 (10)申请公布号 CN 103333964 A CN 103333964 A *CN103333964A* 1/1 页 2 1.人类Y染色体SY124、 SY153和SY239位点缺失的PCR检测液， 包括镁离子、 dNTP、 Taq 酶、 氯化钾。
4、、 三羟甲基氨基甲烷 - 盐酸、 SY124 引物、 SY153 引物和 SY239 引物， 其特征在于该 PCR 检测液中镁离子的浓度为 2.632mM， dNTP 的浓度为 0.263mM， Taq 酶的浓度为 105u/mL， 氯化钾的浓度为 50.63mM， pH 值 8.3 的三羟甲基氨基甲烷 - 盐酸的浓度为 10.53mM， SY124 引物的浓度为 0.632M， SY153 引物的浓度为 0.263M， SY239 引物的浓度为 0.263M。 权 利 要 求 书 CN 103333964 A 2 1/2 页 3 人类 Y 染色体 SY124、 SY153 和 SY239 位。
5、点缺失的 PCR 检测 液 技术领域 0001 本发明涉及人类 Y 染色体缺失的 PCR 检测技术， 具体涉及人类 Y 染色体 SY124、 SY153 和 SY239 位点缺失的 PCR 检测液。 背景技术 0002 育龄夫妇中约有 10% 15% 不育， 其中病因在男性的占 50%， 除输精管道梗阻感 染等明确病因外， 遗传性状改变也是其中一个重要的原因， 主要是男方生精障碍， 表现为严 重少精 （小于 2106/mL 5106/mL） 或无精子。临床不育的男性中大约有 20% 是由遗传 性、 非梗阻性的无精症或少精症引起的， 这些患者大多染色体核型检测正常 ； 但 Y 染色体微 缺失导致。
6、遗传性不育。 目前一般通过STSs进行PCR 来获取Y染色体微缺失信息， 然而各文 献报道的缺失率从 1% 55% 各不相同， 所使用的 STSs 数量和位点可在 1 131 个 STSs 范 围内变化， 包括 sY124（AZFb 区） 、 sY153（AZFb 区） 、 sY239（AZFc 区） 等 STS 位点。PCR 检 测这些 STS 位点时， 操作中需要将水、 镁离子、 缓冲液 （KCl 和 Tris-HCl 等） 、 dNTP、 引物、 酶 等分步骤逐渐加入到反应体系， 操作过程繁琐， 加入的各组分的配比比例不同， 核酸的扩展 效率不一， 且存在反复冻融时扩增效率急剧下降等问题。
7、。 发明内容 0003 本发明所要解决的技术问题是提供一种低温长期保存、 耐受反复冻融， 使用时只 需加入 DNA 模板的人类 Y 染色体 SY124、 SY153 和 SY239 位点缺失的 PCR 检测液。 0004 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为 ： 人类 Y 染色体 SY124、 SY153 和 SY239 位点缺失的 PCR 检测液， 包括镁离子 （Mg2+） 、 dNTP、 Taq 酶、 氯化钾 （KCl） 、 三羟甲基 氨基甲烷 - 盐酸 （Tris-HCl） 、 SY124 引物、 SY153 引物和 SY239 引物， 该 PCR 检测液中镁离 子的浓度为 2.63。
8、2mM， dNTP 的浓度为 0.263mM， Taq 酶的浓度为 105u/mL， 氯化钾的浓度为 50.63mM， pH 值 8.3 的三羟甲基氨基甲烷 - 盐酸的浓度为 10.53mM， SY124 引物的浓度为 0.632M， SY153 引物的浓度为 0.263M， SY239 引物的浓度为 0.263M。 0005 与现有技术相比， 本发明优点在于本发明解决上述技术问题所采用的技术方案 为 ： 人类Y染色体SY124、 SY153和SY239位点缺失的PCR检测液， 包括镁离子、 dNTP、 Taq酶、 氯化钾、 三羟甲基氨基甲烷 - 盐酸、 SY124 引物、 SY153 引物和。
9、 SY239 引物， 该 PCR 检测液中 镁离子的浓度为 2.632mM， dNTP 的浓度为 0.263mM， Taq 酶的浓度为 105u/mL， 氯化钾的浓度 为 50.63mM， pH 值为 8.3 的三羟甲基氨基甲烷 - 盐酸的浓度为 10.53mM， SY124 引物的浓度 为 0.632M， SY153 引物的浓度为 0.263M， SY239 引物的浓度为 0.263M ； 该 PCR 检测液 可以在低温中长期保存， 能耐受反复冻融， 检测时只需加入 DNA 模板， 操作简便， 快速， 扩增 的特异性和灵敏性效果。 具体实施方式 说 明 书 CN 103333964 A 3 。
10、2/2 页 4 0006 以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。 0007 实施例 1 人类 Y 染色体 SY124、 SY153 和 SY239 位点缺失的 PCR 检测液， 该 PCR 检测液中 Mg2+的 浓度为 2.632mM， dNTP 的浓度为 0.263mM， Taq 酶的浓度为 105u/mL， KCl 的浓度为 50.63mM， Tris-HCl （pH 值为 8.3） 的浓度为 10.53mM， SY124 引物的浓度为 0.632M， SY153 引物的 浓度为 0.263M， SY239 引物的浓度为 0.263M。该 PCR 检测液可以在 -20低温长期保 存， 使。
11、用时冻融也不影响检测效果， 检测时只需加入 DNA 模板， 操作简便， 快速。Taq 酶为自 己制备 ,dNTP 购于宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司公司， SY124、 SY153 和 SY239 引物购于英 潍捷基 （上海） 贸易有限公司。 0008 实施例 2 用柱洗脱法提取抗凝全血中的人DNA， 作为模板DNA ； 检测时， 在实施例1的PCR检测液 中加入 1uL DNA 模板， 在 Eppendorf PCR 仪中进行 PCR 扩增反应。PCR 循环条件为 :94预 变性 5min， 然后 94变性 30sec， 57复性 30sec， 72延伸 60sec， 反应 33 个循环后， 72 再延伸 10min ； PCR 产物于可以在 4冰箱储存。取 10uL PCR 产物， Gel red 染色， 经 2% 琼 脂糖电泳， 电泳电压 5V/cm， 电泳时间 35min， 反应产物条带位置及长度 ； 若 AZFb 区域出现 109bp 条带， 则 SY124 未缺失， 若 AZFb 区域出现 135bp 条带， 则 SY153 未缺失， 若 AZFc 区域 出现 201bp 条带， 则 SY239 未缺失， 反之就出现基因缺失现象， 临床表现少精或无精。 说 明 书 CN 103333964 A 4 。